Abstract
تنبيذ فائق التحليلية (AUC) يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات بين الجزيئات عكسها على مجموعة واسعة من نقاط القوة التفاعل وتحت الظروف الفسيولوجية. وهذا يجعل من الجامعة الأمريكية بالقاهرة وسيلة لاختيار لتقييم كمي رياضيات الكيمياء والديناميكا الحرارية من هومو ومغاير الجمعية التي هي عابرة وقابلة للانتكاس في العمليات الكيميائية الحيوية. في طريقة الترسيب التوازن (SE)، توازن بين نشر والترسيب ويقدم لمحة بوصفها وظيفة من المسافة الشعاعية التي تعتمد على نموذج جمعية محدد. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة SE لتحديد حجم ومونومر-مونومر الطاقة جمعية صغيرة قليل وحدات البروتين غشاء باستخدام نابذة فائقة السرعة التحليلية. AUC-ES هي خالية من التسمية، استنادا فقط على المبادئ الفيزيائية، ويمكن استخدامها على كل من المياه القابلة للذوبان البروتينات والأغشية. ويرد مثال على هذا الأخير، ومسعور (SH) بروتين صغير في الفيروس المخلوي التنفسي للإنسان (hRSV)، وهو حمض أميني ببتيد 65-مع-α حلزونية عبر الغشاء (TM) مجال واحد التي تشكل القنوات الأيونية pentameric. وتظهر بيانات الهيكلي القائم NMR التي البروتين SH اثنين protonatable صاحب المخلفات في مجال الغشاء لها التي يتم الموجهة التي تواجه تجويف القناة. وقد تم تصميم التجارب SE لتحديد كيفية تأثير درجة الحموضة ثابتة الجمعيات وحجم بلازميدة قليلة القسيمات من البروتين SH. في حين تم الحفاظ على شكل pentameric في جميع الحالات، تم تخفيض ثابتة ارتباطه في انخفاض الرقم الهيدروجيني. هذه البيانات هي في الاتفاق مع تبعية درجة الحموضة المماثلة الملحوظة للنشاط قناة SH، بما يتفق مع التوجه lumenal من اثنين صاحب المخلفات في البروتين SH. قد تواجه هذا الأخير التنافر الكهربائي وتقليل الاستقرار قليل وحدات في انخفاض الرقم الهيدروجيني. وباختصار، هذا الأسلوب هو المعمول به كلما معلومات كمية عن التغييرات الطفيفة جمعية البروتين البروتين في الظروف الفسيولوجية يجب أن تقاس.
Introduction
تنبيذ فائق التحليلية 1-5 هو واحد من أهم الأساليب لدراسة تفاعلات الجزيئات في ظل الظروف الفسيولوجية، ويجري في متناول كل من التفاعلات الضعيفة والقوية. هذه الطريقة خالية من التسمية ويستخدم امتصاص الضوء أو تدخل، وحتى النظم البصرية مضان يمكن استخدامها للوصول إلى نطاقات التركيز على مدى عدة أوامر من حجم 6.
هذه الطريقة مفيدة خصوصا لأن معظم العمليات الكيميائية الحيوية تعتمد على التفاعلات عكسها. رياضيات الكيمياء وقوة هذه التفاعلات يجب أن يتميز من الناحية الكمية لفهم العمليات البيولوجية، ويوجد عدد من الطرق لهذا الغرض 7 و 8. ومع ذلك، تفاعلات عابرة يصعب دراسة 9.
اختيار طريقة لوصف تفاعلات الجزيئات يعتمد على طبيعته ثابتة أو متغيرة. في الحالة الأولى، sedim ويستخدم entation سرعة (SV)، حيث يتم قياس معدل النقل شعاعي ومجزأة المجمعات على أساس الاختلافات في كتلة ازدهار والشكل.
في المقابل، الجمعيات الديناميكية التي عكسها على مقياس الساعة من التجربة لا يمكن فصلها جسديا. في هذه الحالة، الذاتي أو مغاير التفاعلات التي تؤدي إلى تفاعلات غير التساهمية هي في التوازن الذي يعتمد على تركيز البروتين الكلي. هذه التفاعلات الديناميكية يمكن دراستها من قبل كل من توازن الترسيب (SE) وسرعة الترسيب (SV) 10. ومع ذلك، الأسلوب الأول هو أبسط لأداء ويوصف هنا. في SE، يتم تنفيذ الطرد المركزي على سرعة منخفضة بما فيه الكفاية بحيث يتم التوصل إلى توازن بين نشر والترسيب. في هذه المرحلة، والوضع توازن إشارة ضوئية (UV-VIS) كدالة للمسافة شعاعي، ويمكن تحليلها باستخدام نماذج الحرارية المحددة مسبقا للجمعيات 11.
ve_content "> في هذه الورقة، وقدم دراسة الترسيب التوازن للجمعية الذاتي للبروتين الغشاء الفيروسية التي تشكل أيون القنوات. وبسبب للا مائية لها، يتم تشغيل التجربة في وجود المنظفات، وفي هذه الحالة كثافة لديها مذيب لتكون مطابقة لتلك التي من المنظفات. ومع ذلك، وصف بروتوكول من شأنه متطابقة في حالة وجود البروتين للذوبان في الماء، إلا أنه لا مطابقة كثافة المذيبات سيكون مطلوبا.يتم ترميز البروتين المستخدمة في الجهاز التنفسي البشري الفيروس المخلوي (hRSV)، وهو pneumovirus يلفها عائلة الفيروسات المخاطانية الذي يسبب انخفاض مرض الجهاز التنفسي عند الرضع والمسنين والسكان المناعة في جميع أنحاء العالم 12. ما يصل إلى 64 مليون سهم سجلت حالات العدوى hRSV و160،000 حالة وفاة تحدث سنويا.
الجينوم hRSV المحاضر 11 البروتينات، بما في ذلك البروتينات الغشاء ثلاثة F، G، والصغيرة مسعور (SH). ويشارك البروتين SHفي التسبب في العدوى RSV. كان RSV تفتقر إلى الجين SH (RSVΔSH) قابلة للحياة، وتسبب تشكيل syncytia ونما وكذلك البرية من نوع (WT) فيروس 13-16. ومع ذلك، تكرار فيروس RSVΔSH 10 أضعاف أقل كفاءة من WT في الجهاز التنفسي العلوي 15 و 16. أيضا، تم الموهن فيروس RSVΔSH في الماوس في الجسم الحي ونماذج الشمبانزي 13 و 17.
البروتين SH هو (RSV فرعية A) 64 أو 65 (RSV فرعية B) الأحماض الأمينية نوع طويل II بروتين الغشاء لا يتجزأ التي تتراكم في الغالب في أغشية مقصورة جولجي 18. البروتين SH وتوقع واحد عبر الغشاء (TM) المجال حلزونية 19 التي يتم حفظها للغاية 20،21. تتوجه C- وN-محطة المجالات extramembrane lumenally / خارج الخلية وcytoplasmically، على التوالي.
كلا مجال TM الاصطناعية (بقايا 18-43) وكامل طول البروتين SH وقد ثبت لتشكيل homopentamers في مجموعة متنوعة من المنظفات. شكل homopentameric هي المسؤولة عن النشاط قناة في طبقات ثنائية الدهون مستو 22،23. تم تحديد الاتجاه الصحيح للأحادية TM في طبقة ثنائية الدهون أولا باستخدام الموقع ازدواج اللون الأشعة تحت الحمراء محدد 23، والذي أظهر صاحب-22 ليكون في lumenal، على مقربة من بين حلزونية، والتوجه. وأكد نفس TM التوجه المجال عن طريق دراسات الرنين المغناطيسي النووي التي أعيد بناؤها في pentameric ل-حلزونية حزمة من البروتين كامل طول في dodecylphosphocholine (DPC) المذيلات 22. في هذا النموذج "مذيلة"، وكان يحيط واحد أ- نطاق TM حلزونية N-الميؤوس من قبل لحلزون، وC-عضال لا شفاء منه موسعة ب-دبوس الشعر. بقايا protonatable اثنين من البروتين SH، صاحب-22 وصاحب-51، وتقع في المجال TM (الموجهة lumenally)، وفي غيض من extramembrane-C محطة β دبوس (بعيدا عن مسام قناة)، على التوالي. في بيئى bicellarnment، ومع ذلك، فإن TM-α الحلزون يمتد حتى صاحب-51، وكلاهما صاحب المخلفات يمكن الوصول إلى تجويف القناة 24 ساعة. هيكل قناة يتبنى بنية تشبه القمع 22، حيث المنطقة أضيق (سر-29 إلى السيستئين-45) واصطف 22 مع سلاسل الجانب مسعور (إيل-32، إيل 36، إيل 40 ولوي-44)، و إيل-36 يحدد أضيق نقطة في تجويف القناة. يقع له-22 في أكبر افتتاح هذا القمع، في حين أن صاحب-51 هو في غيض من أصغر الافتتاح.
في هذه الورقة، وقد استخدمت الطرد المركزي التحليلي في وضع الترسيب التوازن لتحديد ما إذا كان إضافة بروتون صاحب يؤثر على استقرار مخموس البروتين SH. في هذه الحالة، كان يذوب البروتين SH في المنظفات C14-البيتين، والتي تم استخدامها سابقا لإظهار أن أشكال البروتين SH الأوليغومرات pentameric 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويستند هذا البروتوكول على الموارد التالية، التي يجب أن يشار لمزيد من التفاصيل واعتبارات خاصة 3، 25-28.
1. الكثافة مطابقة المذيلات المنظفات مع 2 H 2 O
ملاحظة: يحتاج كثافة من الحل عازلة لتكون مطابقة لكثافة المذيلات المنظفات. تشمل عوامل ضبط كثافة المشترك 2 H 2 O، H 2 18 O، 2 H 2 18 O، الجلسرين والسكروز 29. H 2 O 18 لديه نفس الكثافة السكانية مع 2 H 2 O ويمكن أن يكون خيارا أفضل إن لم يكن هو المطلوب بالديوتريوم من البروتونات تبديل في البروتين. في هذا الإجراء، وكثافة 3- (N، N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) المنظفات في 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7.3، سوف تكون مطابقة 100 مم كلوريد الصوديوم مع 2 H 2 O. كما تخمين الأولي للتركيزات التالية2 H 2 O سيتم استخدامها: 10، 30، و 50٪ ت / ت.
1.1. إعداد عينة
- إعداد الحلول الأسهم التالية وفلتر تعقيم خلال 0.2 ميكرون فلتر حقنة: 50 مل 500 ملي تريس درجة الحموضة 7.3 و 1 M كلوريد الصوديوم (10X حل العازلة)؛ 1 مل 250 ملي C14SB (50X حل المنظفات).
- إعداد 200 ميكرولتر من محلول العينة عن طريق خلط 20 ميكرولتر 10X حل العازلة، 4 ميكرولتر حل 50X المنظفات، 20 ميكرولتر 2 H 2 O (99.9٪)، و 156 ميكرولتر منزوع الأيونات H 2 O. أيضا بإعداد 200 ميكرولتر من حل المرجعية عن طريق خلط 20 ميكرولتر حل العازلة 10X، 20 ميكرولتر 2 H 2 O (99.9٪)، و 160 ميكرولتر منزوع الأيونات H 2 O.
- كرر الخطوة 1.1.2 لأخرى 2 H 2 O تركيزات، أي 30٪ و 50٪، وتعديل 2 H 2 O و H 2 O مبالغ بشكل مناسب.
1.2. جمعية 6-قناة AUC الخلايا وتحميل عينة في الخلايا.
ملاحظة: هناك نوعان من الخلايا AUC اعتمادا على أسلوب العينة التحميل. الخلايا دون ملء الخارجي لابد من تحميل مسبق لختم الخلية، في حين الخارجية ملء خلايا يمكن تحميلها بعد مختومة الخلايا. وقد وصفت جمعية خلية AUC الخارجية ملء سابقا 3. في هذا البروتوكول، وصفت جمعية 6-قناة AUC الخلية دون ملء الخارجي. والفرق الرئيسي هو أن لديها حلقات المسمار على كلا الجانبين والتي تحتاج إلى تشديد على حدة، وأنها لا تحتاج المقابس الإسكان (الشكل 1). ويسلط الضوء على الفرق في الخطوات التجمع أدناه.
الشكل 1. بالنظر إلى خلية AUC 6 قنوات بدون تعبئة الخارجي انفجرت. لقد تم تعديل هذا الرقم من بيكمان كولتر ان-تي 50 و-60 تي Analytiكال الدوار، خلايا، ودليل المستخدم موازن.
- إعداد اثنين من نافذة المجالس لكل خلية AUC مع الياقوت نافذة بدلا من الكوارتز نافذة (الشكل 2). وضع طوقا نافذة على حامل النافذة. الانحناء قليلا من نافذة الخطوط الملاحية المنتظمة ووضعه في حامل نافذة مثل أن الفجوة يتم تشكيل العكس لصاحب نافذة keyway. ضع نافذة الياقوت داخل نافذة الخطوط الملاحية المنتظمة، محاذاة علامة مع حامل نافذة keyway.
ملاحظة: نافذة الكوارتز هو انضغاط، وبالتالي سوف تنتج المزيد من الضوء على الانكسار عالية السرعة 28، 30 لذلك لقياس تدخل فوق 30000 دورة في الدقيقة، كما هو الحال في هذه التجربة مطابقة الكثافة، وتستخدم النوافذ الياقوت. نافذة الياقوت هو أثقل من نافذة الكوارتز ويحتوي على "X" محفورا على جانبها.
الشكل 2. انفجرت الرأي سو الجمعية النافذة. لقد تم تعديل هذا الرقم من بيكمان كولتر ان-تي 50 و-60 تي تحليلية الدوار، خلايا، ودليل المستخدم موازن
- وضع الإسكان خلية مع الجزء رقم رأسا على عقب. مع keyways تتماشى مع مفتاح السكن والانزلاق الى السكن خلية أولا محور 6 قطاع مع الجانب مشطوف أسفل، تليها واحدة التجمع نافذة مع نافذة أسفل (الشكل 1، يسار).
- بخفة معطف المواضيع خاتم المسمار وخاتم المسمار غسالة مع spinkote. وضع غسالة حلقة المسمار على رأس التجمع النافذة. تثبيت حلقة المسمار في السكن نافذة مع كلمة "OUT" تواجه خارج. ومن ناحية إحكام الطوق المسمار باستخدام أداة المحاذاة الخلية.
- باستخدام وجع عزم الدوران، وإحكام الطوق المسمار فقط 60 بوصة جنيه.
- وضع الخلية مع الجزء رقم تستقيم والمتمركزة في 12 ظهرا. LOAD 120 ميكرولتر إشارة إلى الصفوف اليسرى و 110 عينة ميكرولتر في الصفوف الصحيحة. تأكد من أن كل عينة والمراجع يقترن بشكل صحيح.
ملاحظة: حجم العينة بالضبط ليست حرجة، ولكن يجب الإشارة أن يكون أكثر قليلا من حجم العينة (5-10 ميكرولتر) بحيث العينة الغضروف المفصلي سوف يكون مختلفا. - الشريحة بعناية في التجمع نافذة الإسكان خلية واحدة مع يواجه النافذة إلى أسفل (الشكل 1، يمين). والحرص على عدم تعكير صفو الخلايا بشكل مفرط وتسرب محتوياتها.
- كرر الخطوة 1.2. 3 و 1.2. 4، وتشديد الطوق المسمار الثانية إلى 120 بوصة جنيه. عكس الخلية وإعادة إحكام الطوق المسمار الأولى إلى 120 بوصة جنيه.
- تحميل الخلايا في الدوار، تثبيت الدوار في أجهزة الطرد المركزي وتثبيت مستوحد اللون وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 28.
ملاحظة: تفاصيل حول هذا الواحدويمكن أيضا أن الجيش الشعبي يمكن العثور عليها في هذا المرجع 3.
1.3. إنشاء قياس تدخل
- بدء البرنامج واجهة المستخدم للصك AUC وأداء الإعداد الليزر وشعاعي معايرة لكل خلية في 3000 دورة في الدقيقة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، والتي سيتم تلخيص لفترة وجيزة في الخطوة التالية.
- وقد تم التوصل إلى 1.3.1.1 بعد فراغ كاف (<100 ميكرون)، تشغيل أجهزة الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة. معاينة نمط التداخل في البرنامج واجهة المستخدم وضبط المعلمات ليزر للحصول على أعلى التباين.
- إنشاء إعداد ملف جديد (ملف | ملف جديد) تحديد "التوازن" و "التدخل" القياس. إنشاء طريقة الترسيب التوازن ("أسلوب" زر) لتشغيل في 45000 دورة في الدقيقة أو أعلى سرعة المتوقعة للعينات البروتين، أيهما أعلى، مع درجة الحرارة المدى عند 20 درجة مئوية وجمع 1 مسح كل 15 دقيقة. رصد ومراقبةص التقدم التوازن عن طريق فتح ملفات البيانات في HeteroAnalysis واختيار وظيفة "ماتش" بعد 12 ساعة على الأقل (حوالي بين عشية وضحاها، الشكل 3).
ملاحظة: وظيفة مماثلة متوفرة في SEDFIT (خيارات | خيارات تحميل | اختبار النهج إلى التوازن) أيضا.
الشكل 3. النتيجة من وظيفة HeteroAnalysis المباراة. يمكن استخدام الدالة المباراة لرصد التقدم المحرز التوازن بمقارنة RMSD بين المسح المتعاقبة وآخر المسح الضوئي. يوضح هذا المثال تحقيق التوازن بعد 8 ساعة كما يتبين من القيم RMSD مقارب لX-المحور.
1.4. تحليل البيانات
- لكل مجموعة من العينات، رسم المنحدر من الشخصية التوزيع شعاعي ضد 2 H 2 O التركيز.
ملاحظة: سوف يكون توزيع ضحلة جدا الأسي أن ا ف بمقاربات الخطي. X-محور اعتراض يتوافق مع مطابقة 2 H 2 O تركيز. - للحصول على نتائج أكثر دقة، تنفيذ التجربة في عدة مكررات. بدلا من ذلك، كرر التجربة مع مجموعة أضيق من 2 H 2 O تركيز.
2. الترسيب توازن SH في المذيلات C14SB
2.1. المعلمات تشغيل
- حساب كثافة العازلة واللزوجة، والبروتين حجم معين جزئي والسرعة الطرد المركزي باستخدام SEDNTERP. لحساب الكثافة واللزوجة عازلة، حدد حساب في قسم "الواق البيانات حدد" وإدخال مكونات عازلة وفقا لذلك، بما في ذلك يا تركيز D 2.
- 2.1.1.1 لحساب البروتين حجم معين جزئي، حدد حساب في قسم "V-بار" وأدخل تسلسل البروتين من الأحماض الأمينية. تحديد حجم بلازميدة قليلة القسيمات أعلى من المتوقع في "تقديم قليل وحدات من هذا مونومر: N ="الحقل، في هذه الحالة N = 5. احسب سرعة عن طريق إدخال القيم في الحقل RPM في الإطار الرئيسي حتى σ ≈ 1؛ هذا هو بحكم التجربة لضمان الشكل الأسي جيد للوضع التوزيع شعاعي 25.
ملاحظة: كانت القيم المحسوبة لهذه التجربة على النحو التالي: ρ = 1.03839 جم / مل، η = 1.0267 CP = 0.7569 مل / ز، ω 1 = 16000 دورة في الدقيقة. - حساب بسرعة لاحقة لمتابعة لضمان الفرق كاف بين تعريف التوزيع في سرعة واحدة و25 المقبل.
ملاحظة: هذا يمكن أيضا أن يتم ذلك من وظيفة "تقدير التوازن الدوار بسرعة وظيفة" في SEDFIT، والتي تأخذ في الاعتبار العمود الحل (حجم التعبئة).
2.2. عينة الاستعدادات
- إعداد 1 مل من محلول المرجعية مع 5 ملي C14SB و 32.3٪ 2 H 2 O كما هو محدد من التجربة كثافة مطابقة (القسم 1)، عن طريق خلط 100 ميكرولتر 10X عازلة محلولن (الخطوة 1.1.1)، و 20 ميكرولتر 50X المنظفات الحل (الخطوة 1.1.1)، 323 ميكرولتر 2 H 2 O (99.9٪) و 527 ميكرولتر منزوع الأيونات H 2 O.
- حل مجفف بالتجميد، والببتيدات SH-HPLC المنقى (التعبير وتنقية الموصوفة سابقا 31) في مذيب مناسب مثل الميثانول أو 50٪ ت / ت الأسيتونتريل مائي. قياس A280 من الببتيدات المنحل في ميكروليتر على نطاق الأشعة فوق البنفسجية / فيس طيفي وقسامة لثلاث عينات لإعطاء 280، 12MM = 0.3، 0.5، و 0.8 (A 280، 10MM = 0.25، 0.417، و 0.67) لكل منهما عندما تضعف ل 130 ميكرولتر. يجفد العينات بين عشية وضحاها وresuspend في 130 ميكرولتر حل المرجعية (الخطوة 2.2.1) لإعطاء الحلول العينة.
ملاحظة: يمكن أن يتم الكشف عن البروتين SH من الأشعة فوق البنفسجية / فيس الامتصاصية في 280 نانومتر لأنه يحتوي على التربتوفان وبقايا صور. يمكن الكشف عن البروتينات دون بقايا العطرية التي كتبها يحدهم مع حامل اللون المناسب، وذلك باستخدام متحولة التربتوفان التي تحتوي على، أو باستخدام التدخلقياسات NCE بدلا من الامتصاصية. - اتبع الخطوات الموجودة في القسم 1.2 لتجميع 6-قناة AUC خلية مع نوافذ الكوارتز. تحميل أعلى تركيز العينة (A 280، 12MM = 0.8) في القناة الأقرب إلى مركز الدوار وأدنى تركيز العينة (A 280، 12MM = 0.3) أبعد من وسط الدوار.
2.3. وضع قياسات الامتصاصية
- إنشاء إعداد ملف جديد (ملف | ملف جديد) تحديد "التوازن" والقياس "الامتصاصية". تحديد 280 نانومتر كما الطول الموجي كاشف.
- أداء المعايرة شعاعي في 3000 دورة في الدقيقة عن طريق فحص "معايرة شعاعي قبل المسح الأول" في خيارات المسح الضوئي، مع تحديد جمع البيانات على دقة منخفضة، على سبيل المثال مع حجم الخطوة شعاعي = 0.01 سم، ومكررات = 3 (دقة منخفضة، سريع)، وتنفيذ المسح الضوئي واحدة . بعد اكتمال الفحص، قم بإلغاء هذا الخيار.
- إنشاء طريقة الترسيب التوازن ("Metho"زر) د لتشغيل في سرعة الأولى المحسوبة في الخطوة 2.1.3، عند 20 درجة مئوية، وجمع 1 مسح كل 30 دقيقة. في كل خلايا "التفاصيل"، حدد جمع البيانات على دقة منخفضة كما في الخطوة 2.3.2. رصد التقدم المحرز التوازن عن طريق فتح ملفات البيانات في HeteroAnalysis واختيار وظيفة "ماتش" بعد 18 ساعة على الأقل (حوالي بين عشية وضحاها، الشكل 4).
ملاحظة: تحقيق التوازن قد يستغرق وقتا أطول بكثير لسرعة الأولى، في حين سرعات اللاحقة سوف يستغرق وقتا أقل.
الشكل 4. نتائج من وظيفة HeteroAnalysis المباراة. سرعات الأولى والثانية (أعلى اليسار واليمين) ويبدو أن وصلت إلى التوازن، ولكن من الأفضل الانتظار بضعة ساعات للتأكد. في المقارنة، فإن سرعات الثالث والرابع (أسفل اليسار واليمين) وصلت بوضوح التوازنفي وقت أقصر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- مرة واحدة وقد تم التوصل إلى التوازن، وجمع المسح الضوئي واحد في ارتفاع القرار، وعلى سبيل المثال مع حجم الخطوة شعاعي = 0.001 سم، مكررات = 10 (ارتفاع القرار، وبطيئة).
- بعد الانتهاء من المسح الضوئي، كرر الخطوة 2.3.3 و2.3.4 لسرعة المقبلة.
- اختياريا، عندما يحين الوقت المطلوب لتحقيق التوازن هو معروف لكل السرعة (محسوبة أو من الخبرة)، وإعداد طريقة الترسيب التوازن المسح ليشمل جميع السرعات المحسوبة في الخطوة 2.1.3 وجمع المسح 1 بعد وقت موازنة لكل السرعة. في هذه الحالة، تحديد جمع بيانات عالية الدقة في كل خلايا "التفاصيل".
2.4. تحليل البيانات في SEDFIT وSEDPHAT
ملاحظة: لمزيد من التفاصيل والاعتبارات في القارئ تحليل البيانات ويشار رس على الموقع التالي: www.analyticalultracentrifugation.com.
- بالاشعة مفتوحة عالية الدقة في SEDFIT (البيانات | تحميل البيانات الترسيب التوازن) وتقسيم البيانات إلى 3 قنوات (وهذه تتوافق مع تركيزات مختلفة لكل عينة، خيارات | خيارات تحميل | احفظ 6-قناة البيانات الخام في 3 مجموعات فرعية).
- إعادة فتح ملفات البيانات التي تنتمي إلى نفس العينة ونفس التركيز ولكن بسرعات مختلفة في SEDFIT. ضبط الغضروف المفصلي (الخط الأحمر العمودي)، أسفل الخلية (الخط الأزرق العمودي) وحدود المناسب (خطوط خضراء عمودية)، وتصدير البيانات لاستخدامها في SEDPHAT (البيانات | تصدير البيانات إلى SEDPHAT). إدخال المعلمات المحسوبة في الخطوة 2.1.1، فضلا عن نوع الدوار ونوع محور النحو المطلوب. كرر هذه الخطوة لكل عينة والتركيز.
- فتح كافة البيانات من نفس العينة (جميع التركيزات وسرعات) في SEDPHAT وملء معلمات تجربة. ويرد مثال في الشكل. 5.
ملاحظة: عندما يكون D 2 O يضاف في المخزن المؤقت، سفر التثنية مواصلة النظر البروتونات تبديل يمكن أن يغير كثيرا من الوزن الجزيئي للبروتين، وخاصة بالنسبة للبروتينات قابلة للذوبان في الماء. بروتينات الغشاء، وخاصة الصغيرة منها مثل البروتين SH، هي أقل تأثرا لأن المناطق جزءا لا يتجزأ من غشاء محمية من الصرف. لتصحيح هذا، وإدخال "العازلة D مول جزء".
ملاحظة: في هذه الخطوة فمن المستحسن أن حفظ بيانات تحريرها بشكل منفصل عن طريق اختيار القائمة بيانات | نسخ كافة البيانات وحفظ باسم جديد التكوين. - اختيار نموذج وملء معلمات العالمية لهذا النموذج.
ملاحظة: وكمثال على ذلك، يتم عرض "الأحادي-N-مير جمعية الذاتي" النموذج والمعلمات في الشكل. 6.
الشكل 5. مثال على كيفية تعبئة التجريبية معلمات.
الملفات / ftp_upload / 52404 / 52404fig6.jpg "/>
الشكل 6. مثال على كيفية تعبئة معلمات العالمي للالأحادي-N-مير جمعية الذاتي نموذج.
- تشغيل صالح العالمية عن طريق اختيار القائمة صالح | العالمي صالح وانتظر حتى CONVERGES مناسبة. ملاحظة أسفل (أو يأخذ لقطة من) نتائج المناسب، وخاصة انخفاض خي مربع العالمي وتسجيل K والقيم. استخراج البيانات الأخرى مثل بيانات تناسب والمخلفات المناسب من القائمة نسخ وعرض | عرض معلومات الحرارية.
- العودة إلى معلمات العالمية وتحقق M (1) لتتناسب مع مونومر الوزن الجزيئي وكرر الخطوة 2.4.5. نلاحظ انخفاض الوزن الجزيئي المجهزة والعالمي خفض خي مربع.
- كرر الخطوة 2.4.3 إلى 2.4.6 لكل نموذج لفحصها ومقارنتها نوعية تناسب كل نموذج بمقارنة قيمة خي مربع العالمية مخفضة وكذلك المخلفات المناسب.
ملاحظة: بقايا المناسب الصغيرة والعشوائية يشير عموما مناسبا، والنموذج الذي يناسب شأنهيكون أصغر العالمي خفض خي مربع. مونومر الوزن الجزيئي المجهزة وقيمة خي مربع لها يجب أن لا تختلف اختلافا جوهريا عن تلك التي (النظري) الوزن الجزيئي الثابتة. - حساب فترة الثقة لكا سجل حصلت عليها القيمة من خلال اختيار الاحصائيات الأولى | النقدي خي مربع لتوقعات سطح الخطأ وإدخال فاصل الثقة المطلوبة. بعد ذلك، انتقل الى الإحصائيات | انتج 1-الأبعاد الإسقاط سطح الخطأ وإلغاء تحديد تسجيل كا في الحوار معلمات العالمية للحصول على القيم خي مربع لسجل كا.
وينصح القراء لاستشارة المصادر التالية (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) لمزيد من التفاصيل عن طريقة 32 وكذلك التوضيح لهذه الطريقة 33: ملاحظة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الملف الشخصى شعاعي توزيع C14SB المذيلات المنظفات في 50 ملي تريس، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 7.3 درجة الحموضة أشكال والأسي ضحلة جدا التي يمكن تركيبها على نموذج الخطي (الشكل 7A). يرتبط المنحدر من هذا التوزيع عكسيا مع D 2 تركيز O (الشكل 7B). النقطة التي المنحدر هو صفر، أي مطابقة D 2 O التركيز، وقد وجد أن 32.3٪.
انظر الشكل 7 أدناه.
وتكررت التجربة نفسها لمخازن مختلفة: 50 ملي فوسفات الصوديوم، وكلوريد الصوديوم 100 ملي درجة الحموضة 5.5 و 50 ملي الفوسفات سترات، 100 مم كلوريد الصوديوم الهيدروجيني 3 للحصول على مطابقة D 2 O تركيزات 30.3٪ و 41.0٪ على التوالي.
تعرض عينات من النوع البري SH (بالوزن) في المنظفات لدرجة الحموضة 3، 5.5 و 7.3 (مجموع 6 عينات)، تليها الطرد المركزي في 15،000، 19،000، 23،000، 28،000، 34،000 و 42،000 دورة في الدقيقة. DATA التي تم الحصول عليها في أقل سرعة لا يمكن تركيبها بشكل موثوق، ربما لأن التوازن لم يتحقق، لذلك تم استخدام البيانات التي تم الحصول عليها من أربع سرعات أعلى. في الرقم الهيدروجيني 7.3، وجد SH WT لتشكيل pentamers (الشكل 8 والجدول 1) مع الظاهر سجل K و= 21.35 (الجدول 2). لم ثابت الجمعية لن تتغير في درجة الحموضة 5.5، ولكن تم تخفيض ذلك بشكل كبير في درجة الحموضة 3. وهذا يتفق مع التقارير السابقة 24، حيث سجلت انخفاضا بنسبة تصرف في انخفاض الرقم الهيدروجيني، مع PK من 4.5.
انظر الشكل 8 أدناه.
انظر الجدول 1 أدناه.
الرقم 7. الكثافة مطابقة C14SB مع D 2 O. (A) شعاعي distributioن البيانات الشخصية التي شكلتها C14SB المذيلات المنظفات في 50 ملي تريس، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 7.3 درجة الحموضة مع 25، 30، و 35٪ D 2 O. تم تركيب البيانات بشكل منفصل إلى النموذج الخطي (أسود). (ب) تم التخطيط المنحدرات ضد D 2 O تركيز (المربعات السوداء) ومزودة إلى النموذج الخطي (خط أحمر). يشار إلى مطابقة D 2 تركيز O (السهم الأحمر).
الرقم 8. تركيب من SH في C14SB لمونومر-مخموس نموذج. تعريف التوزيع شعاعي من SH في C14SB في درجة الحموضة 7 (دوائر مفتوحة) تم العثور على لتناسب أفضل لنموذج جمعية الذاتي مونومر مخموس (خط الصلبة السوداء). ويرد المتبقية المناسب أدناه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نموذج (ن مير) | خي مربع (الثابتة MW) | خي مربع (MW تركيبها) | المجهزة MW |
| 3 | 15،444 | 1.0492 | 13477 دا |
| 4 | 3.8094 | 1.0469 | 9889 دا |
| 5 | 1.0499 | 1.0497 | 7822 دا |
| 6 | 2.5994 | 1،547 | 6504 دا |
| 7 | 6.1667 | 1.2112 | 5743 دا |
الجدول 1. مقارنة خفض القيم خي مربع العالمية من نماذج مختلفة مونومر ن مير.
| درجة الحموضة | الحد الأدنى (163.) | سجل كا | الحد الأعلى (1σ) |
| 3 | 17،432 | 17،576 | 17،737 |
| 5.5 | 20،064 | 20،419 | 20،839 |
| 7.3 | 20،687 | 21،052 | 21،492 |
الجدول 2. مقارنة واضحة تسجيل K والقيم في درجة الحموضة المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه الورقة بروتوكول تجريبي لإعداد العينات وتحليل oligomerization من البروتين غشاء صغير في المنظفات باستخدام توازن الترسيب. بروتوكول صفها صالح -وعلى simpler- للبروتينات قابلة للذوبان على حد سواء، كما لا يشترط الخطوة كثافة مطابقة. في الواقع، يتكون النظام من خلال خليط من المنظفات والبروتين. لإجراء دراسات الترسيب، يجب أن يكون المنظفات غير مرئية للمجال الجاذبية بحيث لا يسهم في تعويم الجسيمات. وهكذا، فإن كثافة المنظفات يجب أن تكون مطابقة بعناية من قبل إضافة D 2 O إلى المخزن المؤقت، مع الحد أنه إذا كانت المنظفات المستخدمة هي كثيفة جدا، على سبيل المثال، SDS، ولا حتى 100٪ D 2 O يمكن أن تتطابق عليه. ليس مطلوبا الخطوة كثافة مطابقة عند العمل مع بروتين للذوبان في الماء، لأن ليس لديها عينة المنظفات.
في تطبيقنا، وهو بروتين فيروسي الصغيرة التي تشكل أيون channوقد استخدم إلس. مثل كل viroporins والبروتين SH له عبر الغشاء المجال α حلزونية، وبالتالي لابد من دراستها في المنظفات التي لن يعطل حجمها بلازميدة قليلة القسيمات الأصلي.
قبل هذه الدراسات، وبالتالي، المنظفات المناسبة لها ليتم عرضه. على سبيل المثال، في SE السابق يدرس البروتين SH شكلت الأوليغومرات pentameric في DPC، C8E5 وC14-البيتين، ووحظت pentamers أيضا خلال الكهربائي في المنظفات معتدل PFO 22. كل هذه المنظفات هي مناسبة لSE، منذ كثافتها يمكن أن يقابله إضافة D 2 O. وينبغي أيضا اختبار العينات عن طريق الترسيب سرعة (SV)، التي تنص على الحد الأدنى لعدد الأنواع الموجودة 34.
أيضا، سوف المنظفات غير مناسبة تنتج أنواع متعددة في SV، وشرائح متعددة في PFO الكهربائي، والإرشادية للجمعية متعددة غير محددة. يتم الحصول على معلومات مفيدة من SE عندما يكون عدد السائد الأنواع مسبقا أرسلت في النظام ليست أعلى من اثنين. في حالة من البروتين SH، تم تركيب البيانات إلى التوازن بين أحادية وpentamers.
من المهم أن نلاحظ أن النموذج المختار لاحتواء البيانات SE، كما ينبغي أن يكون بسيطا قدر الإمكان، أي، نوع واحد من مجهول الوزن الجزيئي يجب أن يحاكم أولا، تليها التوازنات عكسها بين مونومر والأوليغومرات زيادة الحجم. نماذج أكثر تعقيدا ويرتبط غموض العالي. أيضا، لا يمكن أن يتم الكشف عن المجموعات الصغيرة الأخرى الأوليغومرات أصغر أو أكبر، وسوف نموذج تشير فقط ما هي الأنواع السائدة الحالية. في حالة viroporins، وهذا واضح بشكل خاص بسبب التغييرات حجم بلازميدة قليلة القسيمات تبعا لظروف خفية التجريبية، على سبيل المثال، تستخدم المنظفات، ودرجة الحموضة، وتركيز البروتين، وسرعة الطرد المركزي أو الطفرات، على سبيل المثال، في التهاب الكبد C الفيروسات P7 35، الأنفلونزا A M2 36 أو SH البروتين 24.
jove_content "> النتائج المتحصل عليها للبروتين WT SH تظهر بوضوح أن الثابت جمعية من مخموس يتم تقليل في درجة الحموضة 3. هذه النتائج قياسات النشاط قناة المباراة تم الحصول عليها مع البروتين SH في طبقات ثنائية الدهون الاصطناعية، حيث تم تخفيض تصرف بشكل ملحوظ في درجة الحموضة 3 (PK ~ 4.5)، في حين أنه لا يزال مستمرا بين درجة الحموضة 7 و 5 24. وبناء على هذه النتائج، قد يكون من الممكن أن النشاط قناة SH ينظم إلى حد ما أقل درجة الحموضة عند موجودة في الأغشية البيولوجية الأم. على الرغم من أن في جولجي التجويف درجة الحموضة فقط وحدة واحدة دون ذلك من السيتوبلازم، قطرات درجة الحموضة intravesicular على طول مسار التقامي من درجة الحموضة 6،0-6،5 في الإندوسومات في وقت مبكر لدرجة الحموضة 4.5-5.5 في أواخر الإندوسومات والجسيمات الحالة 37. في الخلية المصابة، قد PK لإجراء تغييرات تصرف أو الاستقرار pentameric يكون أعلى من تلك التي حصلنا عليها في المختبر هنا وسابقا 24، وبالتالي درجة الحموضة يمكن فعلا أن تلعب دورا في تحوير النشاط قناة خلال دورة الحياةالفيروس. تحور protonatable صاحب المخلفات في سياق الخلية المصابة هي وسيلة مثيرة للاهتمام للتجارب المستقبلية 38.وأخيرا، ومما يسهل دراسة البروتين SH من خلال وجود التربتوفان في تسلسل لها، وتسهيل القياسات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. ومع ذلك، يمكن معرفة هيكل قليل وحدات تمكين إدخال التربتوفان في مواقع حساسة، على سبيل المثال، الدهون -or solvent- التي تواجه أجزاء من البروتين في غشاء - أو البروتينات soluble-. بدلا من ذلك البروتين يمكن الموسومة مع تسمية المرئى امتصاص أو الفلورسنت.
وباختصار، يصف هذا البروتوكول تطبيق SE لتحديد حجم وتكوين الجمعيات الثوابت بلازميدة قليلة القسيمات من قناة الفيروسية محددة، عندما يتم تغيير المعايير التجريبية. في هذه الحالة، وقد تفاوتت درجة الحموضة لدراسة تأثير على استقرار إضافة بروتون له، ولكن العديد من فرضية أخرى يمكن اختبارها، مثل آثار الطفرات على هيكلية فيtegrity هذه الأوليغومرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
References
- Laue, T. M., Stafford, W. F. 3rd Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , Beckman Coulter, Inc. Available from: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003 (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, John Wiley & Sons, Inc. 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, McGraw-Hill. New York. (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
