작은 올리고머 형성 막 단백질의 침전 평형 : 펜타 머 안정성에 히스티딘 양성자의 효과

요약

Sedimentation equilibrium (SE)은 생리학적 환경에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 인간 세포융합 호흡기 바이러스(hRSV)에 의해 암호화된 작은 소수성(SH) 단백질에 의해 형성된 호모펜타머의 안정성에 대한 pH의 영향을 결정하기 위해 이 기술의 사용을 설명합니다.

초록

분석 용 초 원심 분리 (AUC)은 상호 작용의 세기의 광범위한 생리 학적 조건 하에서 고분자 사이의 가역적 인 상호 작용을 연구하는데 사용될 수있다. 이 AUC를 정량적으로 화학 양론과 호모 생화학 적 과정에 과도 되돌릴 수 있습니다 헤테로 협회의 열역학을 평가하기 위해 선택하는 방법을합니다. 침강 평형 양상 (SE)에서, 확산 침강 간의 균형은 특정 관계 모델에 따라 반경 방향 거리의 함수로서 프로파일을 제공한다. 여기서, SE 상세한 프로토콜 분석 초 원심 분리기를 사용하여 작은 막 단백질 올리고머의 크기와 연관 단량체 단량체 에너지를 결정하기 위해 설명된다. AUC-ES는 단지 물리적 원리에 기초하여, 라벨없는이며, 모두 수용성 단백질 및 막에 사용될 수있다. 예는 후자의 도시, 인간 호흡기 합 포체 바이러스의 작은 소수성 (SH) 단백질 (hRSV), 펜타 머 이온 채널을 형성하는 단일 나선 α 횡단 (TM) 도메인과 65 아미노산 폴리펩티드. 기반 구조 NMR 데이터는 SH 단백질이 채널의 루멘에 대향 배향의 막 횡단 도메인의 두 protonatable 그의 잔기를 갖는 것을 보여준다. SE 실험은 pH가 협회 상수와 SH 단백질의 올리고머 크기에 영향을 미치는 방법을 결정하기 위해 설계되었습니다. 펜타 머 형태는 모든 경우에 유지되었지만, 그 연관 상수는 낮은 pH에서 환원시켰다. 이러한 데이터는 SH 단백질의 두 그의 잔류의 내강 방향과 일치 SH 채널 활동에 대한 관찰과 유사한의 pH 의존성과 일치한다. 후자는 낮은 pH에서 정전 기적 반발력 감소 올리고머 안정성이 발생할 수 있습니다. 생리 학적 조건의 미묘한 단백질 - 단백질 연관 변경 정량적 정보를 측정 할 수있을 때마다 요약하면,이 방법은 적용 가능하다.

서론

분석 용 초 원심 ^1-5, 생리 학적 조건하에 거대 분자의 상호 작용을 연구 강약의 상호 작용 모두에 액세스 가능한 가장 중요한 방법 중 하나이다. 방법은 라벨없는이고 광 흡수 또는 간섭을 사용하며, 심지어 형광 광학 시스템 ^(6)의 크기는 몇 배 이상 농도 범위를 액세스하기 위해 사용될 수있다.

대부분의 생화학 적 과정이 가역적 인 상호 작용에 의존하기 때문에이 방법은 특히 유용합니다. 이러한 상호 작용의 강도 화학량 정량적 생물학적 과정을 이해하는 것을 특징으로 할 수 있고, 다수의 방법이 목적 ^7,8 존재한다. 그러나, 과도 상호 ^작용을 연구 ⁹ 어렵다.

거대 분자의 상호 작용을 특성화하는 방법의 선택은 정적 또는 동적 인 특성에 의존한다. 첫 번째 경우, sedim 정해져있는 속도 (SV)는 방사상 운송 속도가 측정되고, 복합체는 부력 질량 및 형상의 차이에 기초하여 분획 화되는 경우, 사용된다.

반면에, 실험의 시간 스케일에 가역적 동적 연결은 물리적으로 분리 될 수 없다. 이 경우, 자기 또는 비 - 공유 상호 작용으로....

프로토콜

이 프로토콜은 자세한 내용과 특별한 고려 사항 ^{3, 25 ~ 28에} 대해 언급 할 수있는 다음 자원을 기반으로합니다.

H ₂ O ^2와 세제 미셀 1. 밀도 매칭

주 : 완충액의 농도는 세제 미셀 농도에 일치 될 필요가있다. 일반 밀도 조정 에이전트는 ² H ₂ O, H ₂ O ^{(18), 2} H ₂ O ^(18), 글리세롤과 자당 ^(29)를 포함한다. H ₂ O ^(18)는 H ₂ O ^2와 같은 농도를 가지며, 교환 가능한 양성자 단백질의 중수 소화되지 않게 할 필요가있는 경우는 더 나은 선택 일 수있다. 이 절차에서, 50mM 트리스 pH가 7.3에서 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB)의 세제 농도는 100 mM의 NaCl을 ² H ₂ O.과 일치 될 것이다 초기 추측으로 다음과 같은 농도H ₂ ....

결과

50mM 트리스에서 C14SB 세제 미셀의 방사상 분포 프로필, 100 mM의 NaCl을 pH가 7.3 형태 선형 모델 (도 7A)에 장착 될 수있는 매우 얕은 지수. 이 분포의 기울기는 반대로 D ₂ O 농도 (그림 7B)에 관련된다. 기울기가 0 인 점은, 정합 D ₂ O 농도는 32.3 % 인 ​​것으로 밝혀졌다, 즉.

아래 그림 7을 참조하십시오.

동일한 실험은 다른 버퍼에 대해 반복 하였다는 50mM 인산 나트륨, 5.5 100 mM의 NaCl을 pH 및 50 mM의 포스페이트 - 시트 레이트, 100mM의 염화나트륨 pH 3으로 각각 D를 30.3 %와 41.0 %의 ₂ O 농도 일치 얻었다.

토론

이 논문은 샘플 준비 및 평형 침을 사용하여 세제의 작은 막 단백질의 올리고머의 분석을위한 실험 프로토콜을 제공합니다. 밀도 정합 단계가 필요하지 않은 것으로 설명 프로토콜은 동등하게 유효한 -and simpler- 가용성 단백질이다. 실제로, 시스템은 세제와 단백질의 혼합물로 구성된다. 이 부유 입자에 기여하지 않도록 침강 연구를 수행하기 위해, 세제 중력장에 보이지이어야한다. 따라서, 세제의 밀도는 신중하게 사용하는 세제가 너무 치밀하면 예., SDS는, 심지어 100 % D ₂ O가 일치 할 수있는 한계와, 버퍼 D ₂ O의 첨가에 의해 일치되어야한다. 수용성 단백질로 작업 할 때 세제 샘플을 가지고 있지 않기 때문에 밀도 정합 단계는 필요하지 않다.

우리의 응용, 이온을 형성 chann 작은 바이러스 단백질ELS는 사용되어왔다. 모든 viroporins처럼, SH 단백질은 α 나선 횡단 도메인을 가지고 있으며, 따.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3-(N,N-dimethylmyristylammonio)프로판설포네이	시그마	T0807
듀테륨 옥사이드 99.8%	캠브리지 동위원소	DLM-4-99.8
An-50 Ti 로터, 분석, 8-Place	Beckman Coulter	363782
An-60 Ti Rotor, 분석, 4-Place	Beckman Coulter	361964
Cell housing	Beckman Coulter
12mm 6채널 센터피스, 에폰 숯으로 채워진	Beckman Coulter	331376
윈도우 홀더	Beckman Coulter	305037
윈도우 개스킷	Beckman Coulter	327021
윈도우 라이너	Beckman Coulter	362329
사파이어 윈도우	Beckman Coulter	307177
쿼츠 창	Beckman Coulter	301730
나사 링 와셔	Beckman Coulter	362328
나사 링	Beckman Coulter	301922
Spinkote	Beckman Coulter	306812
토크 스탠드 어셈블리	Beckman Coulter	361318
카운터 밸런스	Beckman Coulter	360219
세포 정렬 도구	Beckman Coulter	362340
SEDNTERP			http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page
HeteroAnalysis			http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp
SEDFIT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm
SEDPHAT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm

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