Abstract
Analytiske ultrasentrifugering (AUC) kan brukes til å studere interaksjoner mellom reversible makromolekyler over et vidt område av interaksjons sterke og under fysiologiske betingelser. Dette gjør AUC en metode for valg til kvantitativt vurdere støkiometri og termodynamikk av homo- og hetero forening som er forbigående og reversible i biokjemiske prosesser. I modalitet av sedimente likevekt (SE), en balanse mellom diffusjon og sedimentering gir en profil som en funksjon av radiell avstand som er avhengig av en spesifikk assosiasjon modell. Heri er en detaljert SE protokoll beskrevet for å bestemme størrelsen og monomer-monomer krets energi av en liten membranprotein-oligomer ved anvendelse av en analytisk ultrasentrifuge. AUC-ES er etikett-fritt, bare er basert på fysiske prinsipper, og kan brukes på begge vannoppløselige og membranproteiner. Et eksempel er vist på sistnevnte, små hydrofobe (SH) protein i humant respiratorisk syncytialvirus (HRSV), En 65-aminosyre-polypeptid med en enkelt α-heliks transmembran (TM) domene som danner pentamere ionekanaler. NMR-baserte strukturelle data viser at SH-proteinet har to protonerbar His-rester i sitt transmembrane domene som er orientert som vender mot hulrommet i kanalen. SE forsøk har blitt utviklet for å bestemme hvor pH påvirker assosiasjonskonstanten og oligomere størrelsen av SH-protein. Mens pentamer form ble bevart i alle tilfeller ble det assosiasjonskonstanten reduseres ved lav pH. Disse data er i overensstemmelse med en tilsvarende pH-avhengighet observert for SH kanalaktivitet, i samsvar med en lumenal orientering av de to His-restene i SH-protein. Sistnevnte kan oppleve elektrostatisk frastøting og redusert stabilitet oligomer ved lav pH. I sammendrag, er denne fremgangsmåte anvendbar når kvantitativ informasjon om subtile protein-protein forening endringer i fysiologiske betingelser må måles.
Introduction
Analytiske ultrasentrifuge 1-5 er en av de viktigste metodene for å studere interaksjoner mellom makromolekyler under fysiologiske betingelser, være tilgjengelig for både svake og sterke interaksjoner. Metoden er etiketten fritt og bruker lysabsorpsjonen eller forstyrrelser, og til og med fluorescens-optiske systemer kan brukes for å få tilgang til konsentrasjonsområder over flere størrelsesordener 6.
Denne metoden er spesielt nyttig siden de fleste biokjemiske prosesser avhenger av reversible interaksjoner. Støkiometrien og styrken av disse interaksjonene må være kvantitativt karakterisert forstå biologiske prosesser, og en rekke metoder finnes for dette formålet 7, 8. Men forbigående samhandling er vanskelig å studere ni.
Valget av en fremgangsmåte for å karakterisere makromolekylære interaksjoner er avhengig av statisk eller dynamisk natur. I det første tilfellet, sedim sentasjonen hastighet (SV) anvendes, hvor frekvensen av radial transport måles og komplekser blir fraksjonert på grunnlag av forskjeller i flytende masse og form.
I kontrast, dynamiske foreninger som er reversibel på tidsskalaen av eksperimentet kan ikke være fysisk adskilt. I dette tilfelle selv- eller hetero-interaksjoner som fører til ikke-kovalente interaksjoner er i en likevekt som er avhengig av den totale proteinkonsentrasjonen. Disse dynamiske interaksjoner kan studeres ved både sedimente likevekt (SE) og sedimenteringshastighet (SV) 10. Imidlertid er den første fremgangsmåten enklere å utføre, og er beskrevet her. I SE, blir sentrifugering utført ved en tilstrekkelig lav hastighet slik at en likevekt er nådd mellom diffusjon og sedimentering. På dette punkt likevektsprofil av et optisk signal (UV-VIS) som en funksjon av radiell avstand, kan analyseres ved hjelp av forhåndsinnstilte termodynamiske modeller for assosiasjoner 11.
ve_content "> I den foreliggende papir, er en sedimenteringslikevekt studie presentert av den selv-assosiasjon av et viralt membranprotein som danner ionekanaler. På grunn av dets hydrofobisitet, ble forsøket kjørt i nærvær av detergent, og i dette tilfellet tettheten av Løsningsmidlet må være avstemt til den av vaskemiddel. Imidlertid protokollen som er beskrevet ville identisk i tilfelle av en vannløselig protein, bortsett fra at ikke noe løsningsmiddel tetthet tilpasning ville være nødvendig.Proteinet som brukes er kodet i den menneskelige respiratorisk syncytialvirus (HRSV), en omhyllet pneumovirus i Paramyxoviridae familien som forårsaker nedre luftveissykdom hos spedbarn, eldre og immunkompromitterte populasjoner verden over 12. Opptil 64 millioner rapporterte tilfeller av HRSV infeksjon og 160.000 dødsfall forekommer hvert år.
HRSV-genomet transkriberer 11 proteiner, inkludert tre membranproteiner F, G og små hydrofobe (SH). SH-protein er involverti patogenesen av RSV-infeksjon. RSV mangler SH-genet (RSVΔSH) var levedyktig, forårsaket dannelse av syncytia og vokste i tillegg til villtype (WT) virus 13-16. Imidlertid RSVΔSH virus replikert 10 ganger mindre effektivt enn WT i de øvre luftveier 15, 16. Også RSVΔSH viruset ble svekket i in vivo mus og sjimpanse-modeller 13, 17.
SH-protein er en 64 (RSV undergruppe A) eller 65 (RSV undergruppe B) aminosyrer lang type II integrert membranprotein som akkumulerer hovedsakelig på membraner av Golgi-rommet 18. SH protein har en enkelt spådd en-heliks trans (TM) domene 19 som er svært konservert 20,21. De C- og N-terminale domener extramembrane er orientert lumenally / ekstracellulært og cytoplasmisk, respektivt.
Både syntetisk TM domene (rester 18-43) Og full lengde SH-protein har vist seg å danne homopentamers i en rekke forskjellige vaskemidler. Den homopentameric form er ansvarlig for kanalen aktivitet i planar lipidbilag 22,23. Riktig orientering av TM monomerer i lipidbilaget ble først bestemt bruker nettstedet spesifikk infrarød dichroism 23, som viste His-22 for å være i en lumenal, i nærheten av inter-heliks, orientering. Den samme TM-området orientering ble bekreftet ved NMR-studier som rekonstruert de penta a-spiralformet bunt av full-lengde proteinet i dodecylphosphocholine (DPC) miceller 22. I denne 'micelle' modellen, ble et enkelt a- helisk TM domene flankert N-terminalt av en a-heliks, og C-terminalt med en utvidet b-hårnål. De to protonerbar rester av SH-protein, His-22 og His-51, er plassert i TM-området (lumenally orientert), og ved spissen av extramembrane C-terminale β hårnål (fjernt fra kanalen pore), henholdsvis. I en bicellar Environment imidlertid utvider TM α-heliks opp til His-51, og begge His-rester er tilgjengelige for lumen av kanalen 24. Den kanalstruktur fatter en trakt-lignende arkitektur 22, hvor den smalere område (Ser-29 til Cys-45) 22 er foret med hydrofobe sidekjeder (Ile-32, 36-Ile, Ile-Leu-40 og 44), og Ile-36 definerer det smaleste punktet i kanal lumen. Hans-22 er plassert på den største åpning av trakten, mens His-51 er på spissen av den minste åpning.
I det foreliggende papir, har analytisk sentrifugering i en sedimenteringslikevekt modus blitt brukt for å bestemme om sin protonering påvirker stabiliteten av SH-protein pentamer. I dette tilfelle ble SH-protein solubilisert i C14-betain vaskemiddel, som har blitt brukt tidligere for å vise at SH proteinformer pentamere 22 oligomerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen er basert på følgende ressurser, som er å bli henvist for flere detaljer og spesielle hensyn 3, 25-28.
1. Tetthet matching av vaskemiddel miceller med 2 H 2 O
Merk: Densiteten av bufferløsningen må være tilpasset til tettheten av vaskemiddel miceller. Vanlige tetthets-justerende midler omfatter to H 2 O, H 2 18 O 2 H 2 18 O, glycerol og sukrose 29. H 2 18 O har den samme tettheten som 2 H 2 O og kan være et bedre valg hvis deuterering av utbyttbare protoner i proteinet ikke er ønsket. I denne prosedyren, tettheten av 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propansulfonat (C14SB) detergent i 50 mM Tris pH 7,3, 100 mM NaCl vil bli matchet med to H 2 O. Som en første gjetning følgende konsentrasjoner av2 H 2 O vil bli brukt: 10, 30, og 50% v / v.
1.1. Prøveopparbeidelse
- Forbered følgende stamløsninger og filter sterilisere gjennom et 0,2 mikrometer sprøyte filter: 50 ml 500 mM Tris pH 7,3 og 1 M NaCl (10X bufferløsning); 1 ml 250 mM C14SB (50X vaskemiddel).
- Forbered 200 ul prøveoppløsning ved å blande 20 ul 10X bufferoppløsning, 4 ul 50X vaskemiddelløsning, 20 ul 2 H 2 O (99,9%), og 156 ul deionisert H 2 O. Forbered også 200 ul av referanseløsning ved å blande 20 ul 10X buffer-løsning, 20 pl 2 H 2 O (99,9%), og 160 ul deionisert H 2 O.
- Gjenta trinn 1.1.2 for de andre to H 2 O konsentrasjoner, dvs. 30% og 50%, justere 2 H 2 O og H 2 O beløp på riktig måte.
1.2. Montering av 6-kanals AUC celler og prøve lasting inn i cellene.
Merk: Det er to typer av AUC-celle avhengig av prøvelastemetode. Celler uten ytre fyll har til å bli lastet før forsegling av cellen, mens det ytre fylle cellene kan bli lastet etter at cellene er lukket. Montering av en ekstern-inn AUC celle er blitt beskrevet tidligere tre. I denne protokoll, blir sammenstillingen av et 6-kanals AUC celle uten ekstern fyll beskrevet. Den største forskjellen er at den har skrue ringer på begge sider som må strammes separat, og det trenger ikke bolig plugger (Fig. 1). Forskjellen i monteringstrinn er uthevet nedenfor.
Figur 1. Split visning av en 6-kanals AUC celle uten ekstern fyll. Dette tallet har blitt forandret fra Beckman Coulter An-50 Ti og An-60 Ti Analytical Rotor, Celler, og motvekt bruksanvisningen.
- Forbered to vindu samlinger for hver AUC celle med safir vinduet i stedet for kvarts vindu (fig. 2). Plassere vinduspakningen inn i vindusholderen. Bøy vindu liner og legg den inn i vinduet holderen slik at gapet er dannet på motsatt side av vinduet holder kilespor. Plasser safir vindu inne i vinduet liner, samkjøre merket med vinduet holder kilespor.
Merk:. Kvarts vinduet er komprimerbart, og dermed vil produsere mer lysbrytning ved høy hastighet 28, 30. Derfor er for interferensmålinger over 30.000 rpm, for eksempel i dette tetthetstilpasning eksperimentet, er safir-vinduer benyttes. En safirvindu er tyngre enn kvartsvindu og har en "X" etset på sin side.
Figur 2. Split utsikt of vinduet montering. Dette tallet har blitt forandret fra Beckman Coulter An-50 Ti og An-60 Ti Analytical Rotor, Celler, og motvekt bruksanvisningen
- Plasser cellehuset med delenummeret opp-ned. Med kilesporene på linje med huset nøkkelen, gli inn i cellen bolig først en 6-sektoren midt med skrå side ned, etterfulgt av ett vindu montering med vinduet vendt ned (Fig. 1, til venstre).
- Lett belegge skrue ring gjenger og skru ring vaskemaskin med spinkote. Plasser en skrue ring skive på toppen av vinduet forsamlingen. Installere skruen ring inn i vinduet bolig med ordet "UT" vender utenfor. Stram skruen ring ved hjelp av celle justering verktøyet.
- Med momentnøkkel, stramme skruen ring til bare 60 tommers-pounds.
- Plasser celle med delenummeret oppreist og plassert ved 12-middag. Load 120 mL referanse i venstre rader og 110 mL prøve inn i de rette rader. Sikre at hver prøve og referanse er riktig sammenkoblet.
Merk: Eksakt prøvevolum er ikke kritisk, men referansen må ha litt mer volum enn prøven (5-10 ul), slik at prøven menisken vil være tydelig. - Skyv inn i cellen huset ett vindu montering med vinduet vendt ned (Fig. 1, høyre). Pass på å ikke forstyrre cellen overdrevet og søle innholdet.
- Gjenta trinn 1.2. 3 og 1.2. 4, stramme den andre skruen ring til 120 tommers-pounds. Snu celle og skru den første skruen ring til 120 tommers-pounds.
- Laste cellene inn i rotoren, installere rotoren inn i sentrifugen og installere monokromatoren i henhold til produsentens instruksjoner 28.
Merk: Opplysninger om denne step kan også bli funnet i denne referansen tre.
1.3. Sette opp måleinterferensen
- Start opp brukergrensesnittprogramvaren for AUC instrumentet og utføre laseroppsett og radial kalibrering for hver celle ved 3000 rpm, i henhold til produsentens instruksjoner, noe som vil bli kort oppsummert i det følgende trinn.
- 1.3.1.1 Etter tilstrekkelig vakuum er oppnådd (<100 pm), kjøre sentrifuge ved 3000 rpm. Forhåndsvise interferensmønster i brukergrensesnittet programvare og justere laser parametere for å oppnå den høyeste kontrasten.
- Lag en ny satt opp fil (Fil | Ny fil) som angir "Equilibrium" og "Interferens" måling. Sett opp en sedimente likevekt metode ("Metode" -knappen) for å kjøre på 45000 rpm eller den høyeste hastigheten forventet for proteinprøver, som er høyest, med løp temperatur på 20 ° C og samle en scan hvert 15. minutt. Monitor likevekt fremgang ved å åpne datafiler i HeteroAnalysis og velge "Match" funksjon etter minst 12 timer (ca. over natten, Fig. 3).
Merk: en lignende funksjon er også tilgjengelig i SEDFIT (Valg | Legge Alternativer | Test Approach til Equilibrium).
Figur 3. Resultat fra HeteroAnalysis Match funksjon. The Match-funksjonen kan brukes til å overvåke likevekt fremgang ved å sammenligne RMSD mellom etterfølgende skanninger og den siste skanning. Dette eksempel viser oppnåelsen av likevekt etter 8 timer som antydet ved RMSD asymptotiske verdier for X-aksen.
1.4. Dataanalyse
- For hvert sett av prøver, plotte helningen av den radiale fordelingsprofil mot to H 2 O konsentrasjon.
Merk: Fordelingen vil være en svært grunt eksponentiell at apgangsmåter linearitet. X-aksen skjæringspunkt tilsvarer den samsvarende 2 H 2 O konsentrasjon. - For mer nøyaktige resultater, utføre eksperimentet i flere paralleller. Alternativt gjenta eksperimentet med et smalere spekter av to H 2 O konsentrasjon.
2. Sedimente likevekt av SH i C14SB miceller
2.1. Kjør parametere
- Beregn buffer tetthet og viskositet, protein partielt spesifikt volum og sentrifugeringshastighet ved bruk av SEDNTERP. For å beregne buffer tetthet og viskositet, velger Compute i "buffer data Velg" delen og inn bufferkomponenter tilsvarende, inkludert D 2 O konsentrasjon.
- 2.1.1.1 For å beregne protein delvis bestemt volum, velger Compute i "V-bar" -delen og angi protein aminosyresekvens. Spesifiser høyest forventet oligomert størrelse i "Make en oligomer fra denne monomer: N ="felt, i dette tilfellet N = 5. Beregn hastigheten ved å angi verdier i RPM-feltet i hovedvinduet til σ ≈ 1; Dette er en tommelfingerregel for å sikre en god eksponentiell form av den radiale fordelingsprofil 25.
Merk: De beregnede verdiene for dette forsøk var som følger: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 cP = 0,7569 ml / g, ω 1 = 16.000 rpm. - Beregn etterfølgende hastighet for å følge for å sikre tilstrekkelig forskjell mellom fordelingsprofilen på en hastighet og de neste 25.
Merk: Dette kan også gjøres fra funksjonen "Beregn likevekt rotor hastigheter funksjon" i SEDFIT, som tar hensyn til løsning kolonne (fylling volum).
2.2. Sample forberedelser
- Forberede en ml referanseløsning med 5 mM C14SB og 32.3% 2 H 2 O som bestemmes fra tetthet matchende eksperiment (§ 1), ved å blande 100 ul 10X buffer løsning;n (trinn 1.1.1), 20 ul 50X vaskemiddel (trinn 1.1.1), 323 ul 2 H 2 O (99,9%) og 527 ul deionisert H 2 O.
- Oppløs lyofilisert, HPLC-renset SH peptider (ekspresjon og rensing beskrevet tidligere 31) i egnet oppløsningsmiddel slik som metanol eller 50% volum / volum vandig acetonitril. Mål A280 av de oppløste peptider i en mikroliter-skala UV / Vis spektrofotometer og delmengde for tre prøver å gi A 280, 12mm = 0,3, 0,5, og 0,8 (A 280, 10mm = 0,25, 0.417 og 0.67) hver når fortynnet til 130 mikroliter. Lyofilisere prøvene over natten og resuspender i 130 ul referanseløsning (trinn 2.2.1) for å gi prøveløsninger.
Merk: SH-protein kan påvises fra UV / Vis-absorbans ved 280 nm, fordi det inneholder Trp og Tyr-rester. Proteiner uten aromatiske rester kan påvises ved å merke dem med et egnet kromofor, ved hjelp av en Trp-mutant inneholdende, eller ved hjelp av forstyrreNCE-målinger i stedet for absorbans. - Følg trinnene i avsnitt 1.2 for å sette sammen en 6-kanals AUC celle med kvarts vinduer. Legg den høyeste konsentrasjon prøven (A 280, 12 mm = 0,8) i kanalen som er nærmest rotoren senter og laveste konsentrasjon prøven (A 280, 12 mm = 0,3) lengst fra rotorsenteret.
2.3. Sette opp absorbansmålinger
- Lag en ny satt opp fil (Fil | Ny fil) som angir "Equilibrium" og "Absorbance" måling. Spesifiser 280 nm som detektoren bølgelengde.
- Utføre radial kalibrering ved 3000 rpm ved å sjekke "Radial kalibrering før første scan" i skannealternativer, angi datainnsamling med lav oppløsning, for eksempel med Radial skritt size = 0,01 cm, Replikater = 3 (lav oppløsning, rask), og gjennomføre en enkelt Scan . Etter at søket er fullført, fjerner du alternativet.
- Sett opp en sedimente likevekt metode ("Method "-knappen) til å kjøre på den første hastighet beregnes i trinn 2.1.3, ved 20 ° C, og samle en skanne hvert 30. minutt. I hver cellenes "Detail", angir datainnsamling ved lav oppløsning som i trinn 2.3.2. Overvåke likevekt fremgang ved å åpne datafiler i HeteroAnalysis og velge "Match" funksjon etter minst 18 timer (ca. over natten, Fig. 4).
Merk: oppnåelse av likevekt kan ta vesentlig lengre tid for den første hastighet, mens påfølgende hastigheter vil ta kortere tid.
Figur 4. Resultater fra HeteroAnalysis Match funksjon. Den første og andre hastigheter (øverst til venstre og høyre) ser ut til å ha nådd likevekt, men det er bedre å vente noen timer for å være sikker. Til sammenligning har den tredje og fjerde hastigheter (nederst til venstre og høyre) klart nådd likevektpå kortere tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Når likevekt er nådd, samle et enkelt scan med høy oppløsning, for eksempel med radial trinnstørrelse = 0,001 cm, Replikater = 10 (høy oppløsning, sakte).
- Etter at skanningen er fullført, må du gjenta trinn 2.3.3 og 2.3.4 for neste hastighet.
- Eventuelt når den tid som er nødvendig for å oppnå likevekt for hver hastighet er kjent (beregnet eller fra erfaring), satt opp sedimente likevekt metode scan for å inkludere alle hastigheter beregnet i trinn 2.1.3 og å samle en scan etter likevekt tid for hver hastighet. I dette tilfellet angir høy oppløsning datainnsamling i hver cellenes "Detaljer".
2.4. Dataanalyse i SEDFIT og SEDPHAT
Merk: For ytterligere detaljer og hensyn i dataanalyse leseren er henvist to følgende nettside: www.analyticalultracentrifugation.com.
- Åpne skanninger med høy oppløsning i SEDFIT (data | last sedimentelikevektsdata) og dele dataene inn i 3 kanaler (disse tilsvarer forskjellige konsentrasjoner for hver prøve, Alternativer | Legge Alternativer | Lagre 6-kanals Rådata i tre Delsett).
- Re-åpne datafiler som tilhører den samme prøven og samme konsentrasjon, men forskjellige hastigheter i SEDFIT. Juster menisken (vertikal rød linje), cellebunn (vertikal blå linje) og montering grenser (vertikale grønne linjer), og eksportere data til bruk i SEDPHAT (Data | Eksportere data til SEDPHAT). Input parametere beregnet i trinn 2.1.1, så vel som type og rotormidt type som forespurt. Gjenta dette trinnet for hver prøve og konsentrasjon.
- Åpne alle data fra den samme prøven (alle konsentrasjoner og hastigheter) i SEDPHAT og fyll i Experiment Parametere; et eksempel er vist i fig. 5.
Merk: Når D 2 O blir tilsatt i bufferen, Deut nen av utbyttbare protoner kan vesentlig endre molekylvekten av proteinet, særlig for vannløselige proteiner. Membran proteiner, spesielt små som SH protein, er mindre berørt fordi membran-embedded regionene er beskyttet mot utveksling. For å rette opp dette, tast inn "buffer D mol brøkdel".
Merk: På dette trinnet er det anbefalt å lagre den redigerte datasettet separat ved å velge menyen data | Copy All data og lagre som ny Config. - Velg en modell og fyll i Global Parametere for denne modellen.
Merk: Som et eksempel, er den "Monomer-n-Mer Selv Association" modell og dens parametre vist i fig. 6.
Figur 5. Et eksempel på hvordan man skal fylle i eksperimentelle parametre.
filer / ftp_upload / 52404 / 52404fig6.jpg "/>
Figur 6. Et eksempel på hvordan man skal fylle i Global Parametere for monomer-n-Mer Selv Association modell.
- Kjør en global Fit ved å velge menyen Fit | Globalt Fit og vente til fit konvergerer. Noter ned (eller ta en skjermdump av) prøverom resultater, spesielt den globale redusert chi-kvadrat og logge K a verdier. Pakk andre data som passer data og montering residualene fra menyen Kopier og skjerm | Vis Termodynamisk Information.
- Tilbake til globale parametere og sjekk M (1) for å passe på monomer molekylvekt og gjentar trinn 2.4.5. Notere utstyrt molekylvekt og global redusert chi-kvadrat.
- Gjenta trinn 2.4.3 til 2.4.6 for hver modell som skal testes og sammenligne fit kvalitet av hver modell ved å sammenligne redusert global chi-kvadrat verdi samt montering av restprodukter.
Merk: Små og tilfeldige sittende rester vanligvis indikerer en god passform, og den modellen som passer best villehar den minste global redusert chi-kvadrat. Den utstyrt monomer molekylvekt og dens chi-kvadrat-verdi bør ikke vesentlig forskjellig fra den for den faste (teoretisk) molekylvekt. - Beregne konfidensintervallet for den innhentet log Ka av verdi ved først å velge Statistikk | Kritisk chi-kvadrat for feil overflate anslag og legge inn ønsket konfidensintervall. Deretter gå til Statistisk | generere en-dimensjonale feil overflaten projeksjon og velge bort logge Ka i dialog globale parametere for å oppnå chi-kvadrat verdier for log Ka.
Note: lesere rådes til å konsultere følgende kilder (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) for mer detaljer om metoden 32 samt illustrasjon av denne metoden 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den radiale fordelingsprofil C14SB vaskemiddel miceller i 50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7,3 danner et meget grunt eksponentialuttrykk som kan monteres på en lineær modell (Figur 7A). Skråningen av denne fordelingen er inverst korrelert til D 2 O konsentrasjon (figur 7B). Punktet hvor helningen er null, det vil si, den tilsvarende D 2 O-konsentrasjon, ble funnet å være 32,3%.
Se figur 7 nedenfor.
Det samme eksperiment ble gjentatt for forskjellige buffere: 50 mM natriumfosfat, 100 mM NaCl pH 5,5 og 50 mM fosfat-citrat, 100 mM NaCl pH 3 for å oppnå samsvarer D 2 O konsentrasjoner på 30,3% og 41,0%, respektivt.
Prøver av SH villtype (wt) i vaskemiddel ble eksponert til pH 3, 5,5 og 7,3 (totalt 6 prøver), etterfulgt av sentrifugering ved 15.000, 19.000, 23.000, 28.000, 34.000 og 42.000 rpm. Data oppnådd ved lavere hastighet ikke kan bli montert på en pålitelig måte, muligens fordi likevekten ikke hadde blitt oppnådd, derfor data fra de fire høyere hastigheter ble anvendt. Ved pH 7,3, ble SH WT funnet å danne pentamerer (figur 8 og tabell 1) med tilsynelatende log K a = 21,35 (tabell 2). Assosiasjonskonstanten endret seg ikke ved pH 5.5, men det var signifikant redusert ved pH 3. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter 24, som rapporterte en reduksjon av konduktans ved lavere pH-verdi, med en pK på 4,5.
Se figur 8 nedenfor.
Se tabell 1 nedenfor.
Figur 7. Tetthet matching av C14SB med D 2 O. (A) Radial distribution profil dannet av C14SB vaskemiddel miceller i 50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7,3 med 25, 30, og 35% D 2 O. Dataene ble hver for seg tilpasset til en lineær modell (svart). (B) Bakkene ble plottet mot D 2 O konsentrasjon (sorte firkanter) og tilpasset til en lineær modell (rød linje). Samsvar D 2 O konsentrasjon indikeres (rød pil).
Figur 8. Montering av SH i C14SB til monomer-pentamer modell. Radial fordelingsprofilen av SH i C14SB ved pH 7 (åpne sirkler) ble funnet å passe best til det monomer-pentameren selv-assosiasjon modell (svart heltrukket linje). Montering rest er vist nedenfor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Modell (n-mer) | Chi-kvadrat (fast MW) | Chi-kvadrat (montert MW) | Utstyrt MW |
| 3 | 15,444 | 1,0492 | 13477 Da |
| 4 | 3,8094 | 1,0469 | 9889 Da |
| 5 | 1,0499 | 1,0497 | 7822 Da |
| 6 | 2,5994 | 1,547 | 6504 Da |
| 7 | 6,1667 | 1,2112 | 5743 Da |
Tabell 1. Sammenligning av globale reduserte chi-kvadrat verdier av ulike monomer-n-mer-modeller.
| pH | Nedre grense (163;) | Logg Ka | Øvre grense (1σ) |
| 3 | 17,432 | 17,576 | 17,737 |
| 5.5 | 20,064 | 20,419 | 20,839 |
| 7.3 | 20,687 | 21,052 | 21,492 |
Tabell 2. Sammenligning av tilsynelatende log K en verdi på forskjellig pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette notatet gir en eksperimentell protokoll for prøveopparbeidelse og analyse av oligomerisering av en liten membran protein i vaskemiddel bruker likevekt sedimentering. Protokollen er beskrevet er like gyldig -og simpler- for løselige proteiner, som tettheten samsvarende trinnet ikke er nødvendig. Faktisk er det system som utgjøres av en blanding av detergent og protein. For å gjennomføre sedimenteringsstudier, må vaskemidlet være usynlig for gravitasjonsfeltet, slik at den ikke bidrar til partikkel flotasjon. Således, har tettheten av det vaskemiddel som skal nøye avstemt ved tilsetning av D 2 O til bufferen, med den begrensning at dersom vaskemidlet anvendes er for tett, f.eks., SDS, selv ikke 100% D 2 O kan samsvare med den. Tettheten matchende trinnet er ikke nødvendig når du arbeider med et vannløselig protein, siden utvalget ikke har vaskemiddel.
I søknaden vår, en liten viral protein som danner ion flaels har blitt brukt. Som alle viroporins, har SH protein en α-heliks transmembrane domene, og derfor må studeres i et vaskemiddel som ikke vil forstyrre sin opprinnelige oligomert størrelse.
Forut for disse studiene er derfor egnede rengjøringsmidler må skjermes. For eksempel, i forrige SE studerer SH protein dannet penta oligomerer i DPC, C8E5 og C14-betain, og pentamers ble også observert under elektroforese i den mildt rengjøringsmiddel PFO 22. Alle disse midlene er egnet for SE, siden deres tetthet kan matches av tilsetning av D 2 O. Prøvene skal også testes ved sedimente hastighet (SV), som gir minimum antall arter til stede 34.
Dessuten vil uegnede vaskemidler produsere flere arter i SV, og flere band i PFO elektroforese, som tyder på multippel uspesifikk forening. Nyttig informasjon fra SE oppnås når den dominerende antall arter pre sendes i systemet ikke er høyere enn to; i tilfelle av SH-protein, ble dataene montert til en likevekt mellom monomerer og pentamerer.
Det er viktig å merke seg at den modellen som er valgt for å passe de SE data, bør også være så enkel som mulig, f.eks., Bør en enkelt art av ukjent molekylvekt prøves først, etterfulgt av reversible likevekter mellom monomer og oligomerer av økende størrelse. Mer komplekse modeller har knyttet et høyere tvetydighet. Dessuten kan små bestander av andre mindre eller større oligomerer ikke bli oppdaget, og modellen vil bare indikere hva er de dominerende artene tilstede. I tilfelle av viroporins, dette er spesielt tydelig fordi oligomere størrelse endres avhengig av subtile eksperimentelle betingelser, f.eks vaskemiddel som brukes, pH-verdi, proteinkonsentrasjon, sentrifugehastighet eller mutasjoner, for eksempel i Hepatitt C-virus p7 35, influensa A M2 36 eller SH protein 24.
jove_content "> oppnådd for WT SH-protein Resultatene viser klart at assosiasjonskonstanten av pentameren blir redusert ved pH 3. Disse resultatene tilsvarer kanalaktivitetsmålinger oppnådd med SH-protein i syntetisk lipid bilag, hvor konduktans ble merkbart redusert ved pH 3 (pK ~ 4.5), mens det holdt seg konstant mellom pH 7 og 5 24. Basert på disse resultater, kan det være mulig at SH kanalaktivitet er noe regulert ved lavere pH-verdi når den er tilstede i native biologiske membraner. Selv i Golgi lumen pH er bare en enhet under det i cytoplasma, synker intravesikulær pH langs endocytoseveien fra pH 6,0 til 6,5 i begynnelsen av endosomer til pH 4,5 til 5,5 i slutten av endosomer og lysosomer 37. I den infiserte celle, kan pK for konduktans-forandringer eller pentamer stabilitet bli høyere enn de som oppnås in vitro heri tidligere, og 24 derfor pH kan faktisk spiller en rolle ved modulering av kanalaktivitet i løpet av livssyklusenav viruset. Mutasjon av protonerbar Hans rester i sammenheng med den infiserte cellen er en interessant avenue for fremtidige eksperimenter 38.Til slutt blir studiet av SH-protein lettes ved tilstedeværelsen av Trp i sin sekvens, tilrettelegging UV-absorpsjonsmålinger. Imidlertid kan kjennskap til strukturen av oligomeren mulig innføring av Trp til ufølsomme steder, f.eks, lipid-eller løsemiddel- vendt deler av protein i membranen - eller soluble- proteiner. Alternativt kan proteinet kan merkes med en synlig-absorberende eller fluorescerende markør.
Oppsummert beskriver denne protokollen anvendelsen av SE å bestemme oligomeriske størrelse og foreningen konstanter av en definert viral kanal, når eksperimentelle parametre er endret. I dette tilfelle har pH blitt variert for å studere virkningen på stabiliteten av sin protonering, men mange andre hypotese kan testes, slik som effekter av mutasjoner på det strukturelle itegrity av disse oligomerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
References
- Laue, T. M., Stafford, W. F. 3rd Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , Beckman Coulter, Inc. Available from: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003 (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, John Wiley & Sons, Inc. 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, McGraw-Hill. New York. (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
