Protocol
在此之前任何动物的过程中，机构的动物护理和使用委员会（IACUC）必须批准该协议。该协议被批准为密歇根州立大学IACUC。
FITC的 - 菊粉解决方法1.实验前的准备
- 暖20毫升盐水至70℃，并慢慢地搅拌在100毫克的FITC-菊粉（5毫克/ ml的FITC-菊粉），直到所有菊粉溶解。
- 凉溶液至室温，并添加了牛血清白蛋白800毫克（40毫克/毫升BSA，冻干粉末，基本上球蛋白自由，低内毒素，≥98％纯度通过琼脂糖凝胶电泳）。
- 过滤用滤纸（1级）的菊粉BSA解决方案。放置在20ml的注射器用注射器尖过滤器（0.2微米）过滤溶液，并盖上铝箔避光。
2，麻醉和手术
- 将大鼠在感应腔室填充有5％异氟烷诱导麻醉。记录BODŸ重量（250-350克），将老鼠的目的是保持整个实验37℃的体温加热的手术平台。轻轻固定鼠与实验室磁带在爪子的平台。维持麻醉用1-2％异氟醚与医疗级100％O 2在0.8-1.0升/分钟的气流速率。
- 插入一锥形导管（血管内尖端外径，2.7F）插入股动脉血压和心脏速率监控和血液取样。
- 插入一个导管（PE-50）插入股静脉菊糖输注。固定导管周围组织与5-O丝编织手术缝合6。
- 附加的动脉导管以应变仪压力传感器。记录血压，并使用数据采集软件和显示在实时计算机屏幕上心脏速率。该技术表现出在细节上视频6。
- 经耻骨上切口暴露膀胱。切一小孔在膀胱的前端与插入套管（PE-190）用热扩口顶端的膀胱尿液收集内部。固定套管用一个荷包缝合膀胱。
3，尿液和血液采集
- 放置的FITC-菊粉的注射器在注射器泵的流速设置每100g体重1毫升/小时（3毫升/小时的大鼠称重300克）。附加注射器向股静脉导管。启动菊粉输液，并允许1-2小时平衡期。保持注射器用铝箔纸覆盖避光。
- 确定尿的流速是稳定和足够的试样分析（20微升/分钟）通过收集在预称重的收集瓶尿样，为期10分钟。重力测定尿量用数字刻度。足够的尿量为10分钟收集期为0.2毫升继续收集尿液样本，直到连续两个集合指示20微升/ m的尿流率在以上。
- 预药物样本
- 收集在一个20分钟期间的尿液样本。收集血液样品（0.5毫升），从动脉导管在尿液收集期间的中点。小心生理盐水彻底清除动脉导管含1 U肝素收集瓶采集血样前。使用收集瓶与体积标记，以促进为0.5ml的动脉血收集。
- 冲洗动脉导管与肝素盐水（20单位/毫升）以清除血液（约0.1ml）中的导管。动脉导管的长度应尽可能地短，以限制冲洗所需肝素盐水的体积。
注：稀释血液样本产生GFR和Na和K的排泄分数的计算不准确 - 等待10分钟，并重复一第二预药物尿液和血液样品的集合。
- 下面的两个预毒品样品的收集，管理利尿DRU克，速尿（10毫克/千克），通过动脉导管。冲洗动脉导管与肝素生理盐水以清除药物的导管。照顾，以防止空气注入通过动脉导管。记录速尿注射的时间。
- 用药后的样品：在每个以下3个时间点的，收集在10分钟收集时段尿样和血样（0.5毫升）的尿液收集期间的中点。
- 对于用药后的样品1 - 收集5分钟后，速尿。
- 对于用药后的样品2 - 收集10分钟后，速尿。
- 对于用药后的样品3 - 收集15分钟后，速尿。
- 毕竟样品已收集，安乐死大鼠按照制度程序通过开胸手术和摘取心脏。取出两个肾脏。解封装（去掉周围的膜），并吸干肾脏，去除多余血液。权衡肾脏。
- 衡量所有尿样体积与重量分析的数字称重，并记录重量。
- 离心的全血样品与台式离心机（1800×g离心）以分离血浆。转移血浆样本，以小标记的小瓶。
- 与钠/钾分析器分析Na和K浓度的尿和血浆样品中。
- 的FITC-菊粉的血浆和尿的测量
- 稀预药物尿（从1：200至1：400），以及后药物尿（1:10）与HEPES缓冲液（500毫米，pH值7.4）。
- 添加40微升HEPES缓冲标准品或样品和60微升的96孔板（每孔样品）中，并允许混合10分钟，同时用铝箔覆盖。
- 产生的标准曲线的FITC-菊粉的浓度6.25，12.5，25，50，100，200，400微克/毫升（ 图1）。确定在样品和标准的FITC-菊粉荧光用酶标仪与前分别为485和538纳米，引文和发射波长。
- 适合的标准荧光值到4放慢参数逻辑函数的回归分析。回归函数参数来计算血浆和尿液样品（ 见表1）中的FITC-菊粉浓度。
结果5后的实验室分析：计算
- 计算尿流量（UV;毫升/分钟）：尿体积收集（毫升）]÷[集合的时间（min）]
- 计算肾小球滤过率（GFR毫升/分钟）：尿菊糖浓度（微克/毫升）×紫外线（毫升/分钟）]÷[等离子体菊粉浓（微克/毫升）]
- 计算筛选钠负荷（微摩尔/分钟）：血浆钠浓度（微摩尔/毫升）×GFR（毫升/分钟）
- 计算钠排泄率（U 娜伏;微摩尔/分钟）：尿钠浓度（微摩尔/毫升）×UV（毫升/分钟）
- 计算分数排泄钠（FE娜;％）：[U 娜 V（微摩尔/分钟）]÷[滤过钠负荷（微摩尔/分钟）]×100
- 过滤计算负荷钾（微摩尔/分钟）：血钾浓度（微摩尔/毫升）×GFR（毫升/分钟）
- 计算钾排泄率（Uķ伏;微摩尔/分钟）：尿钾浓度（微摩尔/毫升）×UV（毫升/分钟）
- 计算分数排泄钾（FE K表;％）：[UķV（微摩尔/分钟）]÷[过滤钾负荷（微摩尔/分钟）]×100
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Representative Results
在实验室演示中使用的利尿剂是呋塞米其非常迅速地抑制Na和K的重吸收过滤通过药物给药后几分钟内肾脏导致增加的Na，K和水排泄。由它的主要机制，速尿应该对GFR和Na和K的过滤载荷的影响最小，但会增加尿流Na和K，以及排泄分数
在表的代表性的结果3可知 ，在麻醉的大鼠，对于GFR预药物值的平均值为3.2毫升/分钟，钠排泄为0.58微摩尔/分钟（经过滤的负载的0.1％），和K排泄为4.4微摩尔/分钟（经过滤的负荷的27％）。塞米（后药物1），GFR和Na和K的过滤负荷后五分钟并没有受到影响。然而，钠排泄分数增加至11.5％，和K的排泄分数增加到各个过滤载荷的63％。 MA的测量P和HR表明，速尿对MAP和HR（ 表2）的影响很小。
肾功能的实验室演示评估指数分别GFR的，其定义为通过该等离子体是由肾脏过滤率;经过滤的Na和K，定义为通过其中的Na和K是由肾脏过滤率;的Na和K排泄率，其定义为通过该Na和K是由肾脏排泄的速率;和Na和K的小数排泄，定义为过滤Na和K的是由肾脏排泄的百分比
图1：菊糖标准曲线的FITC荧光值示为含6.25，12.5，25，50，100，200和400微克/毫升菊糖标准。一个4放慢参数逻辑函数的回归分析产生的最佳拟合曲线。从该曲线回归函数参数来计算的FITC-菊粉浓度血浆和尿液样品中。
| FITC菊粉荧光 | 浓度 | 结果 | ||||
| 标准 | 复制1 | 重复2 | 意味着 | 微克/毫升 | 稀释 | 微克/毫升 |
| 空白 | 63.9 | 64.8 | 64.4 | 0.4 | 1 | 0.4 |
| 6.25 | 253.2 | 264.1 | 258.7 | 5.9 | 1 | 5.9 |
| 12.5 | 474.0 </ TD> | 491.3 | 482.7 | 12.5 | 1 | 12.5 |
| 25 | 854.8 | 881.3 | 868.1 | 24.4 | 1 | 24.4 |
| 50 | 1617.1 | 1618.0 | 1617.6 | 50.3 | 1 | 50.3 |
| 100 | 2813.1 | 2846.1 | 2829.6 | 101.3 | 1 | 101.3 |
| 200 | 4367.3 | 4588.7 | 4478.0 | 198.2 | 1 | 198.2 |
| 400 | 6258.0 | 6650.0 | 6454.0 | 401.6 | 1 | 401.6 |
| 尿样 | ||||||
| 药物前1 | 2443.9 | 2062.3 | 2253.1 | 88.5 | 200 | 17700 |
| 药物前2 | 2266.5 | 1707.0 | 1986.8 | 76.3 | 200 | 15250 |
| 用药后的1 | HT“> 1208.91391.2 | 1300.1 | 44.7 | 10 | 447 | |
| 用药后的2 | 2753.4 | 2120.5 | 2437.0 | 97.0 | 10 | 970 |
| 用药后的3 | 2888.3 | 3178.0 | 3033.2 | 124.4 | 10 | 1244 |
表1：菊粉测定 FITC的菊粉荧光值的样品结果示于试剂空白，7标准，和5尿样。标准品和样品进行测定一式两份，并根据需要进行稀释。平均荧光每个样品用于计算菊粉的浓度。菊糖浓度的这些尿样中都包含在测量（ 表2）的表。
表2：测量肾功能的实验室演示过程中记录在5个时间段记录的变量肾功能实验室示范（两个预药及三药后）是正确的，左肾重，平均动脉压（MAP）。心脏速率（HR），采样时间，尿量，血浆和尿钠（Na），钾（K），和菊粉的浓度。尿菊糖浓度从表1中所示的菊粉试验测定。
25table3.jpg“/>
表3：肾功能的参数从记录的测量值计算使用在协议部分5中所示的结构式中，所记录的变量（ 表2）被用来计算尿流率，肾小球滤过率（GFR），GFR / g的肾脏重量，排泄率，过滤负载，和钠排泄分数（钠）和钾（K）这两个预药物和三个后药物周期期间。
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Discussion
适当的标记物GFR测量必须符合四个标准：自由过滤在肾小球，可以绑定到血浆蛋白，并没有被吸收，也不分泌的肾单位。菊糖是一种果糖聚合物满足这些标准。其结果是，菊糖的肾清除被认为是金标准测定GFR 7。所表现出的技术代表确定菊粉8,9的恒定输注期间使用定时尿收集菊粉的肾清除率的传统方法。传统菊粉测量已用蒽酮法以产生由分光光度计10,11测得的比色定量测定菊糖。然而，在试图促进菊粉在较小体积的尿液和血浆的测定，菊糖已被标记放射性12-14，和荧光标记15-17。该实验室在演示视频介绍üsed的FITC标记的菊粉为由于缺乏人体辐射暴露的风险，并易于测量的FITC荧光15的肾功能的测量。
这个实验演示的目的是提供如何衡量肾功能的学生用最少的实验室技能的概念的理解。因此，预实验室制备的FITC-菊粉溶液中，动物的手术准备通过先于示范的开始经验的技术人员进行。学生到达为示范在1-2小时菊粉平衡期的结束。此时，学生都带有一个实验前的概述和通报已在动物体内进行的程序。两个生分配给一个动物实验，并指示如何收集血液和尿液样本之前和利尿药物的给药后。血液和尿液样本的分析是由经验用进行NCED技术员和结果被传递给学生对肾功能的计算。结果在此期间，可以在演示后安排后的实验室的讨论提出。
有协议中的几个关键步骤，以确保有效的反应。首先，FITC菊粉必须完全溶解，之前的动物管理过滤。理想情况下，FITC菊粉应在水中在室温透析48小时以除去残留的未结合的FITC。其次，血浆样本必须是免费的生理盐水。学生被指示收集血液样品只有在所有在动脉导管的盐水被排出并只血液流出导管。所用生理盐水稀释的血液样本将提供不准确的值，等离子体菊粉，钠和钾。第三，尿流必须稳定，足以产生足够的样本进行分析。一个稳定的尿流率基线是非常关键的，因为它的指示一个稳定的实验准备。如果尿流量太低，菊糖的输注速率可以采样集合之前增加。然而，菊粉输液必须在实验过程中恒定， 即 ，菊粉输注速率不应在实验过程中进行调整。最后，菊粉荧光血浆和尿液样品中的酶标仪测量是对一个成功的实验的关键。由于酶标仪的规范将确定是否样品需要稀释，则建议菊粉测定的试运行之前被实验室示范以努力优化酶标仪的规格，并确保样品的荧光值进行内中档标准曲线。
在评估的基础上菊粉的肾清除肾功能被认为是黄金标准，该技术有其局限性，因为动物必须麻醉，仪表血管和膀胱导管。 Anesthethetic剂已被证明影响肾血流动力学与GFR 18,19;然而异氟烷和inactin通常用于肾功能实验，由于其对肾19,20的影响最小。菊粉清除率技术还要求菊粉和多个血液和血浆样品可以是禁止性在较小的动物如小鼠的恒定输注。这种技术的变型已被开发，以允许等离子体间隙的测量从一个单一的喷射菊糖在清醒的动物21。这些修改也需要更小的体积的血样进行分析，并用于评估在小鼠中的肾功能提供的替代方法。
肾功能的测量是适用于生理，病理，毒理，药理和疾病状态的研究。谁参与了肾功能演示学生将学点读笔菊糖肾清除他的黄金标准技术来评估肾功能。通过掌握这种技术，学生将了解肾功能的原则，让他们的技术应用到自己的研究，并确定是否修改该技术适合他们的学习。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。该意见或此处包含的断言是作者的个人观点，并不能解释为官方或反映了陆军部和国防部的意见。
Acknowledgments
资金来源为实验室示威是NIGMS授予：GM077119。我们感谢博士约瑟夫·海伍德和彼得·科贝特博士为他们的中西医结合和器官系统药理学支持短的：原因。我们也感谢汉娜·加弗女士的技术支持实验室演示。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Braided Silk Surgical Suture | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| Assay Plate, 96-Well | Costar | 3922 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Chemical Co | A2934-25G | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | MicroFuge 18, 357160 | |
| Conical Sample Tubes | Dot Scientific Inc. | #711-FTG | |
| Cotton Tipped Applicators | Solon Manufacturing Co | 56200 | |
| Data Acquisition Software | ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | |
| Digital Scale | Denver Instrument | APX-4001 | |
| FITC-Inulin | Sigma Chemical Co | F3272-1G | |
| Gauze Sponges | Covidien | 2146 | |
| Heated Surgical Bed | EZ-Anesthesia | EZ-212 | |
| Heparin | Sagnet | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | Sigma Chemical Co | H3375 | |
| Isoflurane | Abbott Animal Health | IsoFlo, 5260-04-05 | |
| Isoflurane Vaporizer | EZ-Anesthesia | EZ-190F | |
| Micro Dissecting Forceps | Biomedical Research Instruments Inc. | 70-1020 | |
| Microplate Reader - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer | NOVA BioMedical | 14156 | |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PE-190 (for bladder catheter) | BD Medical | 427435 | |
| Pressure Transducer | ADInstruments | MLT1199 | |
| Pyrex Culture Tubes | Corning Inc. | 99445-12 | |
| Rat Femoral Tapered Artery Catheter | Strategic Applications Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemide 5% | Intervet | #34-478 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Student Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Surgical Gloves | Kimberly-Clark | Sterling Nitrile Gloves | |
| Syringe pump | Razel Scientific | R99-E | |
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 91121-12 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann Co | 105-420 | |
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar 3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc. #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann Co 105-420 |
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References
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