Summary
Este bioensayo emplea un pez depredador modelo para evaluar la presencia de metabolitos de alimentación-disuasión a partir de extractos orgánicos de los tejidos de organismos marinos naturales en concentraciones utilizando una matriz de comida comparable nutricionalmente.
Introduction
Ecología Química desarrolla a través de la colaboración de los químicos y los ecologistas. Mientras que la especialidad de la ecología química terrestre ha estado alrededor por algún tiempo, el de la ecología química marina es sólo unas pocas décadas, pero ha aportado importantes conocimientos sobre la estructura de la ecología y la comunidad evolutiva de los organismos marinos 1-8. Aprovechando las tecnologías emergentes de buceo y la espectroscopia de RMN, los químicos orgánicos generados rápidamente un gran número de publicaciones que describen nuevos metabolitos de invertebrados y algas marinas bentónicas en los años 1970 y 1980 9. Suponiendo que los metabolitos secundarios deben servir algún propósito, muchas de estas publicaciones atribuidas ecológicamente propiedades importantes a nuevos compuestos sin evidencia empírica. Casi al mismo tiempo, los ecologistas también se están aprovechando de la llegada de buceo y la descripción de la distribución y abundancia de animales bentónicos y plantas conocidas previamente froestoy métodos de muestreo relativamente ineficaces como el dragado. La asunción de estos investigadores era que nada sésiles y de cuerpo blando deben ser defendidos químicamente para evitar el consumo por los depredadores 10. En un esfuerzo por introducir el empirismo a lo que era el trabajo de otra manera descriptiva sobre la abundancia de especies, algunos ecologistas comenzaron extrapolando defensas químicas a partir de ensayos de toxicidad 11. La mayoría de los ensayos de toxicidad implicaron la exposición del pescado entero u otros organismos a las suspensiones acuosas de extractos orgánicos crudos de tejidos de invertebrados, con la posterior determinación de las concentraciones en masa seca de los extractos responsables de matar a la mitad de los organismos de ensayo. Sin embargo, los ensayos de toxicidad no emulan la manera en que los depredadores potenciales perciben presa en condiciones naturales, y estudios posteriores no han encontrado relación entre la toxicidad y la palatabilidad 12-13. Es sorprendente que las publicaciones en revistas de prestigio utilizan técnicas que tienen poca o ninguna ecological relevancia 14-15 y que estos estudios son aún ampliamente citados hoy. Es aún más alarmante observar que los estudios basados en datos de toxicidad se siguen publicando 16-18. El método de bioensayo descrito en este documento se elaboró a finales de 1980 para proporcionar un enfoque ecológicamente relevante para los ecologistas químicos marinos para evaluar las defensas químicas antidepredación. El método requiere un modelo depredador para muestrear un extracto orgánico crudo desde el organismo diana a una concentración natural en una matriz alimentaria nutricionalmente comparable, proporcionando datos palatabilidad que son ecológicamente más significativa que los datos de toxicidad.
El enfoque general a la evaluación de la actividad antidepredación de los tejidos de organismos marinos incluye cuatro criterios importantes: (1) un depredador generalista apropiado debe ser utilizado en ensayos de alimentación, (2) los metabolitos orgánicos de todas las polaridades deben ser exhaustiva extraído del tejido de la orientar organismo, (3) los metabolitos deben be mezclado en un alimento experimental nutricionalmente adecuada a la misma concentración volumétrica tal como se encuentra en el organismo a partir del cual fueron extraídos, y (4) el diseño experimental y enfoque estadístico deben proporcionar una métrica significativa para indicar mal sabor relativa.
El procedimiento descrito a continuación está diseñado específicamente para evaluar las defensas químicas antidepredación en los invertebrados marinos del Caribe. Empleamos el pez cabeza azul, Thalassoma bifasciatum, como un pez depredador modelo porque esta especie es común en los arrecifes de coral del Caribe y se sabe que degustar una amplia variedad de invertebrados bentónicos 19. Tejido del organismo diana se extrae primero, a continuación, se combina con una mezcla de alimentos, y, finalmente, se ofreció a los grupos de T. bifasciatum para observar si rechazan los alimentos tratados con extracto. Los datos de ensayo que utilizan este método han aportado importantes conocimientos sobre la química defensiva de los organismos marinos 12,20-21, lhistoria ife compensaciones 22-24 y ecología de comunidades 25-26.
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Protocol
NOTA: El paso 3 de este protocolo implica sujetos animales vertebrados. El procedimiento ha sido diseñado para que los animales reciben el tratamiento más humana posible y ha sido aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Wilmington.
1) La extracción de tejidos
- Utilice tejido que se encuentra en su estado natural de hidratación y no exprimido, reseca o demasiado húmedo ya que esto alterará la concentración volumétrica de metabolitos secundarios. Cortar o cortar tejido para piezas o rodajas que se pueden insertar en un tubo de centrífuga de 50 ml. Nota: El tejido fresco se pueden utilizar en algunos casos, pero a menudo es mejor cortar o picar el tejido congelado, que no está sujeto a la compresión cuando se corta.
- Añadir piezas de tejido a 30 ml de una mezcla 1: 1 de diclorometano (DCM) y metanol (MeOH) en un tubo de centrífuga graduado hasta un volumen final de 40 ml se alcanza. Asegúrese de llevar a cabo todas las medidas que impliquen la transferencia dedisolvente en una campana de humos con ventilación adecuada.
- Tapar el tubo e invierta varias veces, luego agitar repetidamente durante un período de extracción de 4 horas. Nota: Durante este período, el agua se combina con el MeOH y el MeOH resultante: fase de agua se separa de la fase de DCM. El tejido se alternativamente expuesto a DCM y MeOH: agua como una emulsión como los tubos se agitan.
- Transferir el extracto de DCM a un matraz de fondo redondo y se evapora a sequedad en un evaporador rotatorio usando calor bajo (<40 ° C). Utilizando disolvente mínima, transferir el extracto seco a un vial de centelleo de 20 ml. Colocar el vial con un adaptador evaporador rotatorio y otra vez evaporar a sequedad en un evaporador rotatorio usando calor bajo (<40 ° C).
Nota: El siguiente paso requiere el uso de un instrumento de compresión hecha en casa que puede ser montado atornillando los siguientes elementos en orden secuencial en el extremo de una varilla roscada: (1) tuerca, (2) la arandela, y (3) la tuerca ciega. La arandela o bien debe ser perforada oequipado de modo que sea menor que el diámetro interno de un tubo de centrífuga de 50 ml. - Volviendo al tubo de centrífuga graduado que contiene el tejido y MeOH: extracto de agua, apriete el medio de extracción de tejido a través de la compresión. Transferir el MeOH: extracto de agua, al mismo matraz de fondo redondo y almacenar refrigerada (<10 ° C).
- Añadir MeOH al tubo de centrífuga graduado hasta que el tejido se sumerge ahora deshidratados para una segunda extracción de 2 a 6 hr duración, a continuación, transferir la nueva MeOH extraer al matraz de fondo redondo refrigerado que contiene el MeOH: extracto de agua. Si hay alguna preocupación de que el tejido no ha sido completamente extraída, repetir la extracción MeOH 2 a 6 hr.
- Seque el MeOH en un evaporador rotatorio usando calor bajo (<40 ° C). Transferir el extracto acuoso restante del matraz de fondo redondo al vial de centelleo que contiene el extracto no polar seco, usando un volumen mínimo de MeOH para enjuagar el matraz de fondo redondo.
- Evaporate el extracto acuoso a sequedad usando calor bajo (<40 ° C) en un concentrador de vacío. El vial de centelleo ahora contiene el extracto orgánico seco total bruta de 10 ml de tejido. Evacuar el espacio superior del vial con gas N2 para evitar la oxidación, sellar herméticamente y almacenar congelado (-20 ° C).
2) Preparación de Alimentos
- Preparar calamar polvo manto liofilizado.
Nota: manto de jibia proporciona una fuente de nutrición que es comparable a la de otros invertebrados bénticos, y será usada como un ingrediente en las subetapas de 2,2.- Anillos Descongele del manto de jibia en desionizada caliente (DI), entonces ellos hacen puré en una licuadora de alta velocidad.
- Vierta una fina capa de manto de jibia en puré en una bandeja de horno poco profunda y la congelación (-20 ° C), luego romper la hoja de puré de calamar congelado en trozos pequeños a liofilizar.
- Liofilizar el puré de manto de jibia congelada siguiendo los procedimientos operativos de la freeze de pelo.
- Pulverizar las piezas liofilizadas de puré de manto de jibia en un mezclador de alta velocidad para formar un polvo.
- En una campana de extracción, vierta el manto de jibia en polvo en un tamiz de harina rotativo y tamizar para separar grandes trozos de tejido del polvo fino.
- Transferir el fino manto de jibia en polvo a un recipiente hermético. Evacuar el espacio superior del recipiente con gas N2 para evitar la oxidación y almacenar congelado (-20 ° C).
- Preparar la mezcla de alimentos.
Nota: cuando se ejecutan múltiples ensayos consecutivos, es práctico para preparar ~ 100 ml de mezcla de comida, sin embargo esta receta puede hacerse a escala en volúmenes más pequeños si es necesario.- Combinar una mezcla de 3 g de ácido algínico y 5 g de polvo liofilizado manto de jibia con 100 ml de agua DI en un vaso de precipitados de 150 ml. Se agita vigorosamente con una microespátula durante unos minutos hasta que el polvo está completamente hidratado y la mezcla es homogénea.
Nota: Si lo desea, colorante de alimentos se puede añadir en este ptep: es más fácil añadir colorante a la mezcla de la comida que va a generar ambas mezclas tratados y de control (enmascarar el pigmento natural del extracto en la mezcla de extracto de tratados) en lugar de tratar de hacer coincidir el color de la mezcla de extracto de tratados mediante la adición teñir a la mezcla de control. Un color verdoso o pardusco alimentos es a menudo deseable para enmascarar cualquier pigmentos en el extracto crudo. - Cargar exactamente 10 ml de mezcla de alimentos en una jeringa graduada. Tenga cuidado para evitar la inclusión de burbujas de aire durante este proceso.
- Retire el vial de centelleo de 20 ml con extracto orgánico crudo seco del congelador. Añadir una o dos gotas de MeOH, luego añada el extracto en una mezcla homogénea con un microespátula.
- Expulsar el cargado de la jeringa 10 ml de la matriz de los alimentos en el vial de centelleo de 20 ml y se agita con una microespátula para homogeneizar la mezcla de alimentos tratados con el extracto.
Nota: Puede ser útil para expulsar la jeringa en incrementos más pequeños (es decir, expulsar 2 ml y homogeneizar, entonces r.EPEAT hasta que todos los 10 ml se han homogeneizado).
- Combinar una mezcla de 3 g de ácido algínico y 5 g de polvo liofilizado manto de jibia con 100 ml de agua DI en un vaso de precipitados de 150 ml. Se agita vigorosamente con una microespátula durante unos minutos hasta que el polvo está completamente hidratado y la mezcla es homogénea.
- Preparar las pastillas de ensayo.
- Cargar un volumen muy pequeño de la mezcla de extracto (~ 1 ml) en una jeringa, y sumergir la punta de la jeringa en una solución de 0,25 M de CaCl2. Expulsar el contenido de la jeringa para formar una hebra de espagueti largo.
- Después de unos minutos, retire el hilo endurecido, cortar en 4 mm gránulos largos en una tabla para cortar vidrio con una hoja de afeitar, luego enjuague con agua de mar.
- Repita los pasos 2.3.1 y 2.3.2 sin incluir extracto de tejido para hacer bolitas de control. Asegúrese de tratar bolitas de control con un volumen equivalente de disolvente (ver adición de MeOH a la mezcla tratada en la etapa 2.2.3) para el control de la adición de disolvente. Si se desea un control negativo para confirmar que los peces ensayo puede ser disuadido de alimentación, añadir benzoato de denatonio a una concentración de 2 mg ml -1 a la mezcla de alimentos crudos 27.
3) La palatabilidadLos bioensayos
- Realizar ensayos de alimentación con el pez cabeza azul silvestre amarilla fase, Thalassoma bifasciatum, mantenidos en grupos de tres en compartimentos opacos lados de acuarios de laboratorio.
- Entregar bolitas de comida de un vaso de agua de mar con una pipeta de vidrio con una pera de goma. Nota: Puede tomar algunos días para entrenar a los peces a recibir alimentos de esta manera. Un estímulo acondicionado (por ejemplo, un par de toques de la pipeta sobre el cristal del acuario) que precede a la entrega de los alimentos puede ser útil para entrenar a los peces a esperar la adición de bolitas de comida.
- La puntuación pellets. Considere un pellet aceptada si se consume fácilmente por los peces. Considere un pellet rechazada si no se consumen después de un mínimo de tres intentos de uno o más peces para tomar en su cavidad bucal, o si el sedimento se acercó e hizo caso omiso después de uno de esos intentos.
- Muestras de puntuación. Nota: El procedimiento de ensayo es representado como un diagrama de flujo en la Figura 1 Grupos de peces que se niegan a comer.Bolitas de control en cualquier paso en el protocolo no se consideran aún más. Hay dos posibles resultados de una única prueba de la prueba: la muestra se acepta o se rechaza.
- Comienza con una bolita de control para confirmar que el grupo de peces es cooperativa. Ofrecer un pellet tratada. Si los peces aceptan la pastilla tratada, la puntuación de la muestra aceptada. Si los peces rechazan el sedimento tratado, ofrecer una pastilla de control posterior para determinar si los peces han dejado de alimentación. Si los peces aceptan la pastilla de control posterior, la puntuación de la muestra ha sido rechazada.
- Replicación. Repita el procedimiento de ensayo con diez grupos independientes de pescado para cada extracto.
4) Importancia Evaluación
- Evaluar la importancia de las diferencias en el consumo de control frente gránulos tratados con una versión modificada de la prueba exacta de Fisher 26. Modificar la prueba por lo que los totales marginales para el control y pellets tratados son fijos, Tratándolos ambas muestras aleatorias. Nota: Esto proporciona p = 0,057 cuando se comen 7 pelotillas; por lo tanto, cualquier extracto se considera elemento de disuasión si se consumen 6 o menos bolitas, y agradable al paladar si se comen 7 o más pastillas.
- Para comparar la palatabilidad relativa entre grupos de extractos, calcular una media del número de gránulos comidos dentro de cada grupo. Mantenga el umbral en 6 gránulos así que un grupo de extractos replicados se entienden disuasorio si el número medio de gránulos comido + error estándar (SE) ≤6. NOTA: En los resultados representativos, la asignación de grupo es la especie, por lo que replican extractos provienen de individuos distintos y la palatabilidad relativa se pueden comparar entre las especies.
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Representative Results
Aquí mostramos los resultados de este bioensayo para seis especies de esponjas del Caribe comunes (Figura 2). Estos datos fueron publicados inicialmente en 1995 por Pawlik et al. 12 y demuestran el poder de este enfoque para estudiar las diferencias en las estrategias de defensa química entre concurrentes taxones. Los resultados se presentaron como una media del número de bolitas de comida comido + error estándar (SE) para cada especie. Casi no hay sedimentos se comen en ensayos con extractos orgánicos crudos de clathrodes Agelas, Amphimedon compressa y cauliformis Aplysina. En contraste, los pellets fabricados con extractos de Callyspongia vaginalis, Geodia gibberosa y Mycale laevis fueron consumidos fácilmente en el ensayo 12. Menos de seis pastillas fueron comidos por los primeros tres especies, por lo que se consideraron significativamente disuasivo. En contraste, los segundos tres especies no fueron significativamente diferentes de los controles, y eranconsiderado aceptable.
Figura 1:. Esquemática del procedimiento de ensayo En todas las etapas, el rechazo de una pastilla de control indica que este conjunto de peces ensayo son poco cooperativo o saciado y no se puede usar más. El protocolo comienza ofreciendo cada conjunto de peces un pellet de control seguido por un pellet tratada. A continuación, si se acepta la pastilla tratada la muestra se califica como aceptado. Si el sedimento tratado es rechazado pero el pellet control posterior se acepta, la muestra se obtuvo como rechazada.
Figura 2: Consumo por Thalassoma bifasciatum de bolitas de comida (media + SE) que contiene extractos orgánicos crudos de las esponjas en concentraciones naturales, publicados por primera vez en 1995 por Pawlik
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Discussion
El procedimiento descrito en este documento proporciona un protocolo relativamente simple, de laboratorio ecológicamente relevante para la evaluación de las defensas químicas antidepredación en los organismos marinos. En este artículo revisamos los criterios importantes que son satisfechas por este conjunto de métodos:
(1) predador apropiado. Este ensayo de alimentación emplea el pez cabeza azul, Thalassoma bifasciatum, uno de los peces más abundantes en los arrecifes de coral en el Caribe. La cabeza azul es un carnívoro generalista conocido para degustar una gran variedad de invertebrados bentónicos 19. Depredadores generalistas son la mejor opción para estos ensayos iniciales debido a que la mayoría de los peces depredadores en los arrecifes son generalistas, y se espera que las defensas antidepredación serían ampliamente dirigidos contra ellos, a diferencia de los depredadores especialistas que pueden haber evolucionado mecanismos para eludir las defensas. Encuestas de laboratorio de defensas químicas que utilizan un único depredador potencial son dediez seguido de más experimentos que requieren mucho tiempo y de campo complicado que se basan en las respuestas de una dotación completa de posibles depredadores en condiciones de campo 28-33.
(2) Procedimiento de extracción. La primera etapa de extracción de tejido, que utiliza una mezcla de disolventes de partes iguales de diclorometano (DCM) y metanol (MeOH), penetra rápidamente el tejido, la solubilización de las membranas y deshidratando material celular. El tejido se deshidrata después de este paso, por lo que los pasos subsiguientes extraer restantes metabolitos de todas las polaridades en MeOH. La repetición de la extracción en MeOH hasta que el tejido está totalmente extraído constituye un procedimiento de extracción exhaustiva. Las variaciones menores en este esquema de extracción son aceptables, tales como sustitución de un disolvente de extracción por otro de la misma polaridad, pero la extracción de tejido pueden estar incompletos si se utiliza un disolvente apropiado. Escollos potenciales de los procedimientos de extracción de tejido inadecuada se discuten en detalle en otra parte <sup> 8.
(3) Preparación de la comida experimental. La matriz del alimento artificial debe simular el tejido del organismo diana tanto en la calidad nutricional y la concentración de metabolitos secundarios. Es probable que los mismos procesos sensoriales que los depredadores utilizan para rechazar metabolitos de alimentación-disuasión también están implicados en la percepción de la calidad nutricional de los alimentos. Los alimentos con baja calidad nutricional pueden ser rechazados en niveles mucho más bajos de defensa química, y por el contrario, los metabolitos secundarios sólo pueden ser disuasivo en concentraciones más altas de lo natural si esos metabolitos se presentan en un alimento artificial que es más nutritivo que el tejido del que se deriva. En polvo, manto de jibia liofilizado es un sustituto nutricional útil porque es fácilmente disponible, fácil de medir, y sus características nutricionales ya se han determinado 34.
La segunda consideración en la preparación de la alimento experimental se refiere a la determinación de la concentración del extracto, que debe hacerse sobre la base de volumen, no en masa. Los depredadores comen tejido húmedo, y los tejidos de organismos marinos varían ampliamente en contenido de agua. Desde la perspectiva de un depredador, una picadura de una medusa o mar anémona contendría sustancialmente más agua por unidad de masa seca que en el mismo tamaño de un bocado de un calamar o el mar babosa. Para tejidos altamente hidratados, la concentración del metabolito por unidad de masa seca sería mucho mayor que por unidad de volumen, pero el volumen (picaduras) es la medida que sea ecológicamente relevante. Además, los tejidos de organismos marinos pueden tener densidades muy diferentes debido a los elementos esqueléticos minerales. Determinación de la concentración de metabolitos en volumen resuelve ambos problemas y es la medida más relevante desde el punto de vista del consumo de tejido por un depredador potencial. En este tema, incluyendo ejemplos de la literatura, se discute en detalle en otra parte 8.
.. content "> (4) Diseño experimental y enfoque estadístico diseño experimental apropiado y análisis estadísticos de datos son tan importantes para los ensayos de comportamiento como para cualquier otra investigación científica que consiste en determinar la importancia de las diferencias en los resultados experimentales El análisis aquí descrito es simple: diferencias se determinan con una tabla de contingencia modificado. El método requiere que todas las ofrendas de comida de control consumirse porque el investigador no estaría utilizando depredadores experimentales que no se alimentaban de alimentos de control 8. Aunque el uso de la prueba exacta de Fisher ha sido modificado desde su inicial utilizar por Pawlik et 12, el valor umbral de 6 pastillas de tratados comido se mantiene sin cambios. Con los años, otras pruebas estadísticas se han sugerido como sustitutos, pero descartada después de consultar con su colaborador James E. Blum (UNCW Departamento de Matemáticas y Estadística al. ). Por ejemplo, la prueba de McNemar se ha sugerido,pero no es apropiado, tanto porque carece de un conjunto combinado de datos, y debido a una fila de la tabla de contingencia se fija en 10 bolitas de control comido.A pesar de nuestra experiencia que este método de ensayo proporciona resultados muy claros, no obstante, se basa en una respuesta conductual. Si los peces se morían de hambre por un período de tiempo antes del ensayo, ellos podrían comer los comprimidos más tratados que lo harían si estaban bien alimentados pescado, sobre todo si un metabolito defensiva está presente en los gránulos alimentarios tratados con una concentración cerca del umbral de la actividad. Por estas razones, los resultados de ensayos de alimentación no deben ser interpretados sobre. Por ejemplo, una diferencia entre dos muestras de tejido de un décimo vs 9/10 gránulos comidos indica la primera muestra es disuasorio y la segunda no lo es, pero una diferencia de 3/10 vs 5/10 gránulos comidos puede ser debido a la variación del comportamiento entre los ensayos, y la primera muestra no es necesariamente más disuasorio que la segunda.
Un applicat claveion de este bioensayo es su uso en el fraccionamiento guiado por bioensayo, mediante el cual las particiones sucesivas del extracto crudo se prueban en peces para aislar los compuestos químicos responsables de la actividad de alimentación de disuasión 29,32-33,35-38. Una vez que la presencia de una defensa química se ha cerciorado, el extracto orgánico crudo se fracciona por cromatografía en subconjuntos más pequeños de compuestos que componen la mezcla, y estos subconjuntos se alimentan a pescar en el mismo ensayo de alimentación. Una vez más, esto debe hacerse sobre una base volumétrica, el uso de "equivalentes" ml de extracto de tejido en lugar de equivalentes de masas. A medida que avanza la separación, las fracciones se ensayaron mejor como una dilución en serie con respecto a la concentración volumétrica natural: 4 ×, 2 ×, y 1 ×. Este lapso de concentraciones tiene en cuenta la probable reducción en la actividad de disuasión que proviene de la división de los metabolitos activos sobre dos o más fracciones cromatográficas o de la pérdida de metabolitos activos through descomposición, reacción, o el apego a cromatográficas medios. Una vez que los metabolitos activos han sido aislados por fraccionamiento guiado por bioensayo, el investigador puede identificar usando técnicas espectroscópicas estándar y también debería hacer lo mismo para las fracciones inactivos que pueden tener metabolitos secundarios. Es igualmente importante saber que los metabolitos secundarios son activos en experimentos ecológicamente relevantes como para saber que los metabolitos no son 8.
Los elementos de este procedimiento también se pueden usar para diseñar nuevas técnicas experimentales. Por ejemplo, este bioensayo fue adaptado para los depredadores invertebrados (por ejemplo, cangrejos y estrellas de mar 39 40), para otras regiones geográficas 41, e incluso para hacer frente a otras cuestiones de investigación (por ejemplo, las defensas estructurales 31,34,42 y aposematismo 27). Los cuatro criterios deben servir como guía para futuras adaptaciones de este método. En resumen, este procedimiento de bioensayo provides un método más ecológico pertinentes para apreciar los defensas químicas antidepredación de los tejidos de organismos marinos. Los estudios que utilizan este procedimiento han avanzado nuestra comprensión de los factores que controlan la distribución y abundancia de invertebrados marinos de los arrecifes de coral del Caribe (por ejemplo, más recientemente, Loh y Pawlik 26) y puede informar a las investigaciones en diversos campos de la investigación, incluyendo la farmacología, biotecnología, y ecología evolutiva.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-20 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A41220 | |
| Anhydrous Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Cryocool Heat Transfer Fluid | Fisher Scientific | 20-548-146 | For vacuum concentrator |
| Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity | MP Biomedicals | 154723 | |
| Squid mantle rings | N/A | N/A | Can be purchased at grocery store |
| Denatonium benzoate | Aldrich | D5765 | |
| 50 ml graduated centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | |
| Disposable Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Rubber bulbs for Pasteur pipets | Fisher Scientific | 03-448-24 | |
| Red bulbs for pellet delivery | Fisher Scientific | 03-448-27 | |
| 250 ml round-bottom flask | Fisher Scientific | 10-067E | |
| Scintillation vial adapter for rotavap | Fisher Scientific | K747130-1324 | |
| Weightboats | Fisher Scientific | 02-202B | |
| Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| 5 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-53 | |
| 10 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-54 | |
| Razor blade | Fisher Scientific | S17302 |
References
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