Macrofagen Cholesterol Uitputting en het effect daarvan op de Fagocytose van Cryptococcus neoformans

Summary

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

Cryptokokkose is een levensbedreigende infectie veroorzaakt door ziekteverwekkende schimmels van het geslacht Cryptococcus. Infectie gebeurt bij inhalatie van sporen die kunnen repliceren in de diepe long zijn. Fagocytose van Cryptococcus door macrofagen is een van de manieren waarop de ziekte kan verspreiden in het centrale zenuwstelsel dodelijke hersenvliesontsteking veroorzaken. Daarom is onderzoek naar de associatie tussen Cryptococcus en macrofagen is belangrijk voor het begrijpen van de progressie van de infectie. De onderhavige studie beschrijft stap voor stap protocol macrofaag infectiviteit bestuderen door C. neoformans in vitro. Met behulp van dit protocol, wordt de rol van gastheer sterolen op gastheer-pathogeen interacties bestudeerd. Verschillende concentraties van methyl - cyclodextrine (MCD) gebruikt om cholesterol uit muizen reticulum sarcoom macrofaag cellijn J774A.1 afbreken. Cholesterol uitputting werd bevestigd en gekwantificeerd met behulp van zowel een commercieel beschike cholesterol kwantificering kit en dunnelaagchromatografie. Cholesterol uitgeputte cellen geactiveerd met lipopolysaccharide (LPS) en interferon gamma (IFNy) en geïnfecteerd met antilichaam opsonized Cryptococcus neoformans wildtype H99 cellen bij een effector-tot-doel-verhouding van 1: 1. Geïnfecteerde cellen werden gevolgd na 2 uur incubatie met C. neoformans en de fagocytose index werd berekend. Cholesterol depletie resulteerde in een significante vermindering van de fagocytose index. De gepresenteerde protocollen bieden een handige methode om de inleiding van de infectie proces na te bootsen in een laboratoriumomgeving en bestuderen van de rol van gastheer lipidesamenstelling op besmettelijkheid.

Introduction

Fagocytose is een proces waarbij extracellulaire entiteiten worden geïnternaliseerd door gastheercellen. Het is een belangrijk wapen in het arsenaal van het immuunsysteem om te beschermen tegen pathogenen, maar het proces kan vaak worden ondermijnd door pathogenen te zorgen voor internalisatie en verspreidt zich door het lichaam ^1. Fagocytose wordt gemedieerd door verschillende signalering gebeurtenissen die de hechting en afblazen via herschikkingen van het cytoskelet gastheercel. 'Professionele fagocyten kunnen herkennen en binden opsoninen op het oppervlak van de pathogeen te signaleren bevestigen van de vorming van lamellipodia die de pathogeen ove....

Protocol

1. Cholesterol Uitputting van J774A.1 Cellen met MβCD

1. In een steriele bioveiligheid kast, zaad 10 ⁵ J774A.1 macrofaag-achtige cellen per putje op een 96-well celkweek plaat in 200 pl Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S). Incubeer bij 37 ° C en 5% CO ₂ O / N.
2. Verwijder media uit de celmonolaag en was de cellen tweemaal met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die is gefilterd en geautoclaveerd.
3. Voeg 200 ul van MβCD oplossing in de gewenste concentratie (10 mM of 30 mM in PBS) of 1x PBS als controle en incubeer gedurende....

Results

Cholesterol Uitputting

Analyse van het supernatans gereserveerd stap 1.3 van het protocol volgens de instructies van de fabrikant in de Amplex Red Cholesterol Assay kit levert een verhoogd cholesterolgehalte in MβCD behandelde monster vergeleken met de 1x PBS controle. Afhankelijk van celtype en MβCD gebruikte concentratie cholesterol depletie kan variëren. Voor J774 behandeld met 10 mM MβCD, werd een afname van ongeveer 50% waargenomen. Uitputting kan worden berekend met waarden verkregen uit .......

Discussion

Bij het ​​werken met dit protocol is het belangrijk om nauwkeurige celtellingen wanneer plating zoogdiercellen en opsoniserende C. verkrijgen neoformans-cellen. Dit minimaliseert de variatie tussen onderzoeken en zeer nauwkeurig 1: 1 tot doel effectorverhouding gedurende de studie. Het is ook kritisch om de timing van de cholesterol uitputting en infectie coördineren voorkomen opsonized gistcellen of behandelde macrofaag cellen uit rusten bij kamertemperatuur tussen de procedures. Periodes lange wachtt.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Class II type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	3460009
J774A.1 cell line	ATCC	TIB-67	Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus	Gibco	10082-147	Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator	Fisher Scientific		Model # 3530
96-Well culture dish	Corning Inc. Costar	3595
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific BioReagents	BP3994	Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-cyclodextrin	Sigma Life Science	C4555-10G	Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations
Orbital shaker	Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Life Technologies Molecular Probes	A12216	All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate	Corning Inc. Costar	3603
FilterMax microplate reader	Molecular Devices		Model F5
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z126195-1EA
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498-4L
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-2L-R
TLC Paper	Whatman	3030917	Cut down to size needed for TLC tank
Fume hood			Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards
6-Well plate	Corning Inc. Costar	3506
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Cell scraper	Corning Inc. Costar	3010
Hemocytometer	Hausser Scientific	1490
Centrifuge	Beckman Coulter		Model Alegra x-30R
Votex mixer	Fisher Scientific	12-812
Balance	Mettler Toledo		Model # MS104S meaures down to 0.1 mg
Glass Pasteur pipette	Fisherbrand	13-678-20A
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000
SpeedVac concentrator	Thermo Scientific		Model # SPD2010
Petroleum ether	Fisher Scientific	E139-1
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone	Analytical Chromatograhy Millipore	1.11845.0001
Iodine chips	Sigma-Aldrich	376558-50G
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	320501
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	244589
UVP EC3 Imaging System	Ultra-Violet Products Ltd.		Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass bottom confocal dish	MatTek	P35G-1.5-10C	www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)			Obtained from Duke University Medical Center
YNB	BD	239210	See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide	Sigma	L4391-1MG	Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma	Sigma	I4777	Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)			Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml
Giemsa	MP Biomedicals	194591	Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope	Zeiss		Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images