Murine isolierten Herzmodell Myocardial Stunning Verbunden mit Kardioplegische Arrest

Abstract

Das folgende Protokoll ist von Nutzen, um Herzfunktionsstörungen oder Herzmuskel atemberaubenden folgenden moderate ischämischen Insulten zu bewerten. Die Technik ist nützlich für die Modellierung von ischämischer Verletzung mit zahlreichen klinisch relevanten Phänomen einschließlich Herzchirurgie mit kardioplegischen Stillstand und Herz-Lungen, off-pump CABG, Transplantation, Angina, kurze Ischämie, etc verbunden. Das Protokoll stellt eine allgemeine Methode, um hypo hyperkaliämische kardioplegischen Stillstand und Reperfusion in Nagerherzen mit Schwerpunkt auf der Messung der Herzmuskelkontraktionsfunktion zu modellieren. In Kürze wird eine Maus Herz in Langendorff-Modus durchströmt, mit einem intraventrikulären Ballon instrumentiert, und Baseline Herzfunktionsparameter werden aufgezeichnet. Nach Stabilisierung, das Herz ist dann einer Infusion einer kardioprotektiven hypo Kardioplegielösung kurz zu diastolischen Verhaftung zu initiieren. Kardioplegie intermittierend über 2 h zugeführt. Das Herz wird dann reperfundiert und warmed auf Normothermie Temperaturen und Wiederherstellung der myokardialen Funktion überwacht wird. Verwendung dieses Protokolls ergibt zuverlässige deprimiert Herzkontraktionsfunktion frei von Brutto myokardialen Gewebeschäden bei Nagern.

Introduction

Myocardial atemberaubenden wird als reversibel reduziert kontraktile Aktivität trotz Wiederherstellung der ausreichende Durchblutung nach einer kurzen Zeit der Ischämie, längere Zeiträume mit ischämischen Herzschutz ^1.2.3.4.5 definiert. Das vorgestellte Verfahren ist speziell zur klinisch relevanten ischämischen Insulten, die in reversible Beeinträchtigungen in der Kontraktionsfunktion führen kann, zu modellieren (dh mit ischämischen Herzchirurgie Verwendung kardioplegischen Stillstand, kurze Zeiträume von Ischämie, Angina, usw. zugeordnet). Im Gegensatz zu schweren Ischämie Studien (Myokardinfarkt, Nekrose) wurde dieses Protokoll entwickelt, um myocardial funktionelle Erholung und Herzschutz ohne Gewebeverletzung, Umbau, und Zelltod zu bewerten. Die Mehrzahl der Papier diskutiert ein Standard kardioplegischen Still Protokoll ähnlich einem Herzchirurgie mit Hypothermie und intermittierende Anlieferung Kardioplegielösung Elemente.

Myocardial protBiegung während des Großteils Herzoperationen beruht auf Kardioplegie und kardiopulmonalen Bypass. Obwohl Kardioplegie (CP) Lösungen und Strategien sehr unterschiedlich (Blut, kristalloiden, kalt, warm etc.) die häufigsten Elemente sind 1) Hyperkaliämie und / oder andere Strategien, um das Herz in der Diastole zu verhaften, wodurch Energienutzung von Herzmuskelkontraktion resultierende Begrenzung, und 2), um den Stoffwechsel zu verlangsamen Hypothermie und zur Erhaltung der ATP und andere Energiereserven während verhaftet. Aktuelle Kardioplegie-Lösungen bieten Schutz für das Herz gegen ischämischen Insulten, die das Gegenteil beweisen tödlich wäre. , Kardioprotektive Strategien bei chirurgischen ischämischen sind jedoch nicht perfekt, und die sich ergebende mild ischämischer Verletzung kann in reversible Herzkontraktionsstörung trotz ausreichender Blutfluss zur Folge haben (myokardiale Betäubung), Azidose, Herzmuskelschäden und Gefäßwirkungen wie reduzierte Koronarperfusion und Vasospasmus.

Dieses Protokoll unterscheidetvon Standard-isolierten Herz Ischämiemodellen Auswertung Herzinfarkt und schwere Ischämie, dass es wertet milder ischämischen Insulten, die zu einer Beeinträchtigung der Herzfunktion folgende kurze Ischämie oder ischämischen Insulten mit kardioplegischen Stillstand führen kann. (Für einen Überblick über Langendorff-Perfusion Techniken und I / R Studien siehe ^6-8). Allgemeine Richtlinien und eine gründliche Analyse der mit der Maus isoliert perfundierten Herzen zugehörigen Versuchsparameter siehe Sutherland e t al. 2003 ⁹ Die hier vorgestellte Technik Details die notwendige Ausrüstung, Reagenzien, Schritte, Strategien und Tipps, um zuverlässig zu induzieren atemberaubende in Mäuseherzen. Geringfügige Änderungen erforderlich, um die Technik an Ratten anzuwenden.

Kurz isolierten Maus Herzen nach Langendorff für ca. 30 min bei physiologischen Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) über Abgabe eines Hyperkaliämische HYPOTHERM perfundiert, durch Kälte geschützt Herzstillstand, gefolgtic Kardioplegielösung. Nach der Festnahme wird Herz funktionelle Erholung bei Wiedererwärmung und Reperfusion des Herzens mit KHB überwacht. Veränderungen im Grad der Erholung der Herzkontraktionsfunktion bewertet werden können, um kardioprotektive Mittel und unterschiedliche Kardioprotektion Strategien geprüft.

Protocol

HINWEIS: Alle Verfahren wurden von der Lebensdauer Institutional Animal Care und Verwenden Committee und allen Tieren und Verfahren nach dem National Research Council Leitfaden für Pflege und Verwendung von Labortieren ¹⁰ genehmigt.

1. Balloon Fabrication und linksventrikulärer Drucküberwachungsschaltung

1. Konstruieren LV Ballons nach Miller et al. ¹¹ In einem Becherglas mit einem Rührstab, mischen 9,5 ml destilliertem Wasser, 14,2 ml Licht Maissirup und 33,8 g Saccharose und Hitze auf einer heißen Platte, mischen, bis sich der Zucker aufgelöst . Weiter Heizlösung, bis es etwa 150 ºC erreicht.
   HINWEIS: Zahlreiche Verfahren existieren, um LV Ballons einschließlich Modifikation Kondom Tipps und Frischhaltefolie ^9,12 Bau zu errichten. Wir finden, das obige Verfahren relativ einfach, leckagefreie Ballons zu konstruieren, kann jedoch nur ein Vorteil der Frischhaltefolie Ballons umfasst vorherige Charakterisierung geeignete frequency-Wirkungs-Beziehungen ^9.
2. Brechen trockene Spaghetti-Stränge in Stücke von etwa 5 cm in der Länge und tauchen einer Seite von jedem Stück ca. 1 cm tief in die Zuckerlösung und langsam entfernen.
3. Legen Sie die Trockenpartie der Teigstrang in eine Polystyrolschaumblock und auszusetzen, so dass die Zuckermischung tropft nach unten und bildet eine Tropfenform Schimmel. Lassen Sie O / N in einem Exsikkator so die Form aushärtet.
4. Am nächsten Tag tauchen die Formen in Silikon-Gel-Dispersion. Zeigen Teigstränge zurück in Styropor-Block und in aa 37 ºC Ofen für 2 Stunden oder bis trocken. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal so zwei Schichten aus Silikon aufgebracht sind.
5. Nach dem Trocknen in Wasser für mehrere Stunden, um die Entfernung der Ballon aus der Form zu unterstützen. Shop Luftballons in 0,02% Natriumazid-Lösung.
6. Verwenden Sie eine 23 G Blutsammelset eine maßgeschneiderte Ballon Kanüle durch Schneiden einer Nadel, um eine stumpfe Spitze zu erstellen und platzieren Kerben in der Nadel zu produzieren.
7. Verbinden Sie den Schlauch mit einer Druck transProduzent und mit Wasser spülen und dabei Schlauch und Kanüle vollständig untergetaucht, um Luft in das System zu verhindern. Legen Sie einen Ballon, der mit Wasser auf die Kanüle gefüllt worden ist und verwenden 2-0 Seidenfäden, um auf die Kanüle zu binden. Testballon durch die Fähigkeit, Druck zu halten (~ 100 mm Hg für mindestens 1 h)

2. Herstellung des isolierten Herzens Perfusionssystem

1. Zunächst waschen und wärmen das System. Schalten Sie auf einem 37 ºC warmen Wasserbad Zirkulator, die der Langendorff-Apparatur angeschlossen ist, und füllen Pufferbehälter mit destilliertem Wasser. Schließen Sie eine neue Glasfaserfilter in die Vorrichtung fließt, um die Rohrleitung an und schalten Sie Pumpe zu spülen, das System. Während der Vorbereitungszeit, überwachen die Temperatur von Wasser aus dem Langendorff-Block mit einem Temperaturfühler ausgestoßen, um sicherzustellen, dass Wasserbad genau eingestellt. Außerdem schalten Sie einen gekühlten Umwälzpumpe und 20 ºC, die während der kardioplegischen Stillstand des Herzens verwendet wird eingestellt.
2. ICHn der Zwischenzeit bereiten die folgenden Lösungen. Bereiten Sie 1 l Kardioplegielösung (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl _2, 1,5 mM CaCl _2, 10 mM NaHCO ₃₎ und Filter. Auch bereiten 2 l KHB (118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,7 mM MgSO _4, 2 mM Na-Pyruvat, 6 mM Dextrose, 24,9 mM NaHCO ₃ (vorge belüftet mit CO ₂₎ , 1,4 mM CaCl ₂ (zuletzt zugegeben). Nach dem Auflösen zu entfernen Präzipitate durch Filtrieren in einen Kolben mit einem 5 um Glasfrittentrichter. Legen Sie einige in eine kleine Schüssel auf Eis, um während der Operation und Isolierung verwendet werden.
3. Oxygenieren Perfusat (KHB) und mit 95% O _2/5% CO ₂ für mindestens 30 min vor der Verwendung. Perfuse Langendorff-System mit KHB um das restliche Wasser aus dem System zu entfernen und Pufferbehälter. Bei Mäusen, stellen Sie die ursprüngliche Pumpendrehzahl auf ca. 2,0 ml / min. Zeigen 2-0 und 4-0 Seidenfäden in der Nähe Perfusionskanüle. Lassen Sie die Pumpe, bis der Schlauch und eine Vorrichtung Witz gefüllth Perfusat und sorgen für die Blase strup mit Perfusat gefüllt.
   HINWEIS: Bei längerer Durchblutung und stabile Funktion ist es sehr empfehlenswert, um eine In-line-Glasfaserfilter (~ 1 & mgr; m) in der Perfusionskreislauf installieren, um keine Niederschläge, die Blutgerinnsel im Herzen bilden könnten sammeln

3. Maus-Chirurgie

3.1) Maus Anästhesie und Handhabung

1. Bereiten Sie Spritze mit Narkosedosis von 80 mg / kg Ketamin und 5 mg / ml Xylazin-Gemisch, und fügen Sie steriler 0,9% iger Kochsalzlösung, um die Lautstärke zu 0,2 ml bringen. Heparin spritzen IP (50 ul von 1.000 U / ml Lösung).
2. Bewegen Sie die Maus wieder in Transportbehälter (~ 10-20 min) und warten Sie, das Bewusstsein zu verlieren, wie Heparin wirksam wird. Von Zeit zu Zeit tun, eine Zehe Prise, um Schmerzen Reflex überwachen.

3.2) Entfernen Sie die Herz-

1. Sobald der Maus ist komplett bewusstlos ist und nicht bis zu den Zehen Prise reagieren, sichern Sie sie auf einen geeigneten Operationstisch mit Stiften oder 25 G Spritzenansätze durch den Extremitäten. Führen Sie eine Thorakotomie, um das Herz freizulegen. Geschnitten ein kleines Loch gerade unterhalb des Brustbeins und verlängern die geschnitten, um die Seiten des Maus Vermeidung der Membran.
2. Schnell schneiden Sie die Membran und dann schnell an den Seiten des Brustkorbs zu schneiden. Flip wieder den Brustkorb wie eine Muschel, die Brusthöhle freizulegen. Nehmen vorsichtig aus dem Herzen, platzieren Schere unter und nehmen Sie den Herz.
   HINWEIS: Es ist wichtig, um das Herz zu schnell zu entfernen, sobald es in der Brusthöhle ausgesetzt ist und die Lungen sind nicht funktionsfähig.

3.3) Reinigen Sie das Herz

1. Legen Sie die Herzen in die Schale mit eiskaltem KHB und schneiden Sie alle große Stücke von Lungengewebe befestigt. Verwenden einer Pinzette zu holen die Herzen und suchen Sie die Aorta. Drücken Sie leicht die Herzen und suchen Sie nach jeder Blut, das angezeigt wird, da dies sollte das offene Ende der Aorta können. Verwenden Sie feine Spitze Pinzette, um das Herz von dem offenen Ende der Aorta zu halten.

e "> 4. Montage des Herz, Starten Perfusion und Platzieren der Ballon

4.1) Montage und Kanülierung der Herz

1. Vor dem Transport des Herzens auf die Langendorff-Apparatur, schalten Sie die Pumpe dafür, dass die Perfusion Druck niedrig (~ 20 mmHg). Halten Sie die Herzen durch die Aorta knapp die Kanüle. Mit einem anderen Satz von feine Spitze Pinzette, öffnen Sie vorsichtig die Aorta und schieben Herz bis auf die Kanüle. Halten Sie es fest mit einem Satz Pinzette und dann mit einem weichen Kanten Clip vorübergehend befestigen Sie sie Kanüle.
   HINWEIS: Schnell Montage des Herzens auf die Perfusionskanüle ist entscheidend für eine gute Vorbereitung. Mit Erfahrung, sollten die Verfahren Öffnen der Brusthöhle, bis die Montage des Herzens von zwischen 1 und 2 min zu nehmen.
2. Krawatte und initiieren Perfusion wie folgt, mit 4-0 Seidennaht sichere Aorta an die Kanüle direkt unter dem Clip. Stellen Sie sicher, das Band ist ebenfalls rund um die Metall Aortenkanüle, so die Aorta nicht off beim Anziehen gebunden bekommender Knoten. Sobald eine Bindung ist fest gelegt, entfernen Sie den Clip.
3. Verwenden Sie zusätzliche Seidenfäden, die Aorta sicher an der Kanüle und achten Sie auf binden Sie unterhalb jedes Schiff, Zweige, die aus der Aorta kommen kann befestigen. Diese können oft durch Perfusat undicht oder aus der Aufnahme von der Aorta beobachtet werden.
   HINWEIS: Während der Anfangsphase der Durchblutung der Blut sollte aus dem Herzen Waschen und das gesamte Herz sollte eine weiche rosa Farbe. Dunkle Verfärbungen, die nicht waschen out anzuzeigen ischämischen Gebiete, die voraussichtlich aufgrund von Luftembolien oder Blutgerinnsel und Herzen sollten nicht verwendet werden.

4.2) Festlegung Perfusion und LVP Measurement

1. Erhöhen Sie langsam die Perfusionsdruck und Pumpendrehzahl erhöhen, bis der Perfusionsdruck 70 mmHg erreicht.
   HINWEIS: Standard Perfusionsdrücken für Maus Perfusion 70-90 mmHg, aber konstant von Tier zu Tier innerhalb eines Experiments gehalten werden.
2. Reinigen Sie das verbleibende Gewebe (Lunge, Schilddrüse usw.), Die noch an das Herz befestigt werden kann. Mit einer Schere, um eine Öffnung in der linken Herzkammer zu erstellen schneiden Sie die linken Vorhof.
3. Setzen Sie den Ballon auf den Halter und zu entleeren. Positionieren Sie den Ballon in der Nähe der Kanüle Aortenkanüle, direkt über der Öffnung in der linken Herzkammer. Ballon vorsichtig nach unten legen Sie in den linken Ventrikel, während das Herz in Position halten, so dass die Aorta nicht reißt.
4. Sobald es in Kraft ist, langsam zu beginnen, um den Ballon aufzublasen, bis die LVEDP erreicht ~ 8 mmHg. Platzieren des Temperaturfühlers gegen die Unterseite des Herzens, damit er die Temperatur des Abgases misst.

4.3) Basal Measurement

1. Dichten Sie das Herz in einem Wassermantel Perfusionskammer. Während dieser Zeit kontinuierlich durchströmen das Herz mit KHB, und sicherzustellen, dass die Temperatur weiter steigt. Überwachen Sie die Temperatur und stellen Sie das Wasserbad entsprechend, bis es etwa ~ 37 ° C erreicht.
   HINWEIS: Überwachung temperature in den Anfangsphasen der Perfusion ist kritisch, da koronaren fließt und anschließend Temperatur kann von Herz zu Herz variieren. Temperatur des Abgases Perfusat für gewünschte myokardialen Temperatur über einen Temperaturfühler an der Spitze des Herzens platziert überwacht. Darüber hinaus im Vergleich zu anderen Langendorff-Perfusion Protokollen das Herz nicht in CP oder KHB während der Perfusion oder Arrest untergetaucht ist diese hauptsächlich durchgeführt, um schnell Temperatur einzustellen sowie effiziente CP Lieferung ohne Diffusion.
2. Beginnen Sie zur ständigen Aufzeichnung Funktionsmessung mit einem Datenerfassungssystem an die entsprechenden Sensoren angeschlossen, darunter Perfusionsdruck, linksventrikuläre Druck (Druckwandler zum LVP Ballon befestigt), Temperatur und elektrophysiologischer Parameter (EKG, MAP falls vorhanden) (Anlage werden nach Herstellung und spezifisch für den einzelnen Sensoren und Datenerfassungssystem). Sobald das Abwasser KHB erreicht ~ 37 ºC für mindestens 15 min und Herzfunktionsparameter sind stabil, notieren Sie die Zeit für die Baseline-Messungen.
   HINWEIS: Ein- / Ausschlusskriterien werden für jeden Herz angewendet. A LVDP von <60 mmHg zu Beginn der Studie zeigt, ein Herz, das von der Analyse entfernt werden sollte. Außerdem Koronarfluss> 4,5 ml / min, oder der Unfähigkeit, Perfusionsdruck zu Studienbeginn zu halten wahrscheinlich zeigt eine undichte oder zerrissen Aorta. Auch alle Herzen, die klare ischämische Bereiche, die visuell bestätigt werden kann (dh Blutgerinnsel) oder Ausstellungs Ischämie-assoziierten Senkung der Herzfunktion (dh Erhöhung LVEDP, extrem arrhythmic) haben, werden aus der Analyse entfernt.
3. Messen Koronarfluss über Sammlung des koronaren Abflusses in einen Meßzylinder für 1 min. Schließen Sie die Kammer und ermöglichen Temperatur und funktionieren, um auf die Ausgangswerte zurück. Alternativ messen die koronare Fluss kontinuierlich in der Perfusion Leitung über einen Strömungssonde nach dem Druckentlastungskreis gelegt.

"> 5. Initiating Kardioplegische Arrest

1. Zeigen 100 ml kaltem Kardioplegie Puffer in einen anderen Behälter und. übertragen die KHB Reservoir Kanüle in die Kardioplegie-Reservoir.
2. Nehmen Sie den Wassermantel Gehäuse und die Perfusion Erwärmung Schaltung von der warmen Wasserbad und eine Verbindung zum Kältemaschine mit Hilfe von Schläuchen Schnellkupplungen. Verwenden Sie separate Heizung und Kühlung Umwälzpumpen starken Temperaturschwankungen des Herzens und Perfusat ermöglichen.
3. Befolgen Sie die Luftblase, die während der Schalter in die Rohrleitung eingeführt wird, und wenn es in der Nähe von dem isolierten Herzen erreicht starten Sie den Zeitpunkt für die Kardioplegie. Liefern Kardioplegie für 2 min. Nach der ersten Dosis die Pumpe stoppen. Stellen Sie sicher, das Herz in der Diastole zu verhaften und die Nähe zu den gewünschten CP Temperatur.
   ANMERKUNG: Eine ausreichende Blasenfalle ist notwendig, um Luftembolien im Herzen zu vermeiden. Alternativ kann ein Abgabesystem für beide Reservoirs durch einen Absperrhahn schaltet leicht konstruiert werden, aber wir finden, folgening die kleine Luftblase, die eingeführt wird, wenn Vertauschen der Kanüle zwischen Stauseen, eine einfache Methode der Zeit CP Lieferung gegeben potenziell unterschiedlichen Pumpendrehzahlen zwischen den Experimenten (dh aufgrund von Maus / Ratte, Perfusionsdruck, Filterwiderstand, etc.)
4. Halten Sie das Herz in Kardioplegie für 2 Stunden bei ~ 20 ° C. Jede halbe Stunde während der CP schalten Sie die Pumpe wieder auf 1 min, so eine weitere Dosis verabreicht wird.
   HINWEIS: Intermittent Dosen von CP alle 30 min führt zu Funktionsstörungen des Herzens, ohne Nekrose des Gewebes. Längere Zeiträume zwischen Dosen von CP (dh> 45 min) kann in Nekrose und ischämischen Kontraktur führen und mehr für ein Modell der nekrotischen Schädigung mit ungeschützten Ischämie geeignet.

6. Reperfusion

1. Am Ende des CP, überweisen Sie den Behälter Kanüle zurück in die sauerstoffreiches KHB. Schließen Sie die Temperaturregelkreise auf die Heizungspumpe und schalten Sie die Pumpeauf der Reperfusion zu starten. An diesem Punkt der Kardioplegie wäscht, beachten Sie den Temperaturanstieg und das Herz beginnt nach 2-4 min der Reperfusion wieder zu schlagen. Wenn das Herz beginnt der Herzschlag langsam und oft arrhythmischen.
   Hinweis: Es ist in der Regel nicht ein großer Anstieg der diastolischen LVP (dh ≤10 mmHg Anstieg), die oft in charakteristischen pure Ischämie-Modellen ist. Herzrhythmusstörungen können auch in der Reperfusion bestehen und gelegentlich das Herz muss defibrilliert werden. Dies kann mit der Verwendung eines Stimulators Satz zu höheren Spannungen (~ 10-50 V) und Elektroden, die an der Basis und dem Apex des Herzens platziert erreicht werden.
2. Ermöglichen das Herz für 30 min reperfuse, und während dieser Zeit nehmen Koronarfluss Messungen notwendig. Messen Sie Koronarfluss durch Sammeln des Abwassers mit einem Messzylinder für 30-60 sec.

7. Sammeln des Gewebes

1. Die Luft aus dem Ballon und entfernen Sie sie aus der linken Herzkammer. Nehmen Sie das Herz aus derKanüle und gewogen. In anfänglichen Experimenten sollte mindestens eine Querscheibe des Herzens aufgenommen und TTC angefärbt, um Nekrose bewerten, um sicherzustellen, dass das Herz frei von nekrotischen Schädigung.
2. Sammeln Sie Herzen Scheiben für die Mikroskopie Studien, nass / trocken Gewichte etc. Der Rest oder ganzes Herz sollte rasch, indem in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Shop eingefroren Herzen in einem -80 ° C Tiefkühltruhe.
   HINWEIS: Für die Messung der energiereichen Phosphatverbindungen (dh, ATP, Kreatin-Phosphat), die Herzen sofort eingefroren werden.

Representative Results

Abbildung 1 zeigt typische Ergebnisse von einem Maus-Experiment. LVP (rote Linie), dP / dt (grüne Linie) und Temperatur (lila Linie) wurden continusouly über ~ 3 Stunden aufgezeichnet. Buchstaben geben a - Baseline-Messung, b, c, d, e - Lieferung von Kardioplegielösung, f - Start der Reperfusion, g, h, i, j - Messung der cornary Fluss während der Reperfusion. Hinweis, deprimiert LVDP und dP / dt nach Reperfusion im Vergleich zum Ausgangswert. 1B enthält die Daten von einem überzeichneten ~ 2 sec. Beachten Sie, die Abnahme der LVP und dP / dt ähnlich A, leichten Rückgängen in HR und ein leichter Anstieg der LVEDP. In der Regel nach 30 min Reperfusion gibt es eine ~ 40% ige Abnahme der Herzfunktion, wie durch die in 1C dargestellt linksventrikulären entwickelte Druck LVDP belegt.

Abbildung 1. Representative Ergebniss eine ganze Experiment. (A) Aufnahme linksventrikuläre Druck (oben), erste Ableitung des LV Druck und Temperatur. (B) Short-Intervall-Aufnahmen, um Spuren Detail und (C) Quantifizierung der linksventrikulären entwickelten Druck (LVDP) für mehrere Versuche zu sehen (n = 6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Die vorhergehenden Protokolldetails Methoden zu bewerten myocardial stunning sekundär zu einer globalen Ischämie mit kardioplegischen Stillstand. In unseren Händen dieses Protokoll erzeugt eine ungefähre ~ 40% ige Reduktion der Herzfunktion (LVDP, +/- dP / dt) mit minimalen Veränderungen der Herzfrequenz an der 30 min nach der Reperfusion Zeitpunkt. Da das Herz perfundiert und wiedererwärmt alle Parameter der Herzfunktion bei Anfangszeitpunkte mit einem stark reduzierten Herzfrequenz vor Stabilität zwischen 20 und 30 min reduziert. Koronarfluss ist in der Regel stark während der frühen Reperfusion erhöhten sich aufgrund Hyperämie, und fällt dann auf ~ 20-30% weniger als Steuerungsebenen nach 30 min Reperfusion.

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass myokardiale Betäubung durch Definition sollte das Herz frei von Zelltod und Nekrose, die charakteristisch für pure Ischämie verlassen / MI-Modelle (dh> 20 Minuten kein Durchfluss regionalen Ischämie). Erste Studien sollten Gewebe Histol bewertenlogie, um einen Mangel an nekrotischen Schädigung zu gewährleisten. Darüber hinaus, obwohl myokardiale Betäubung durch Definition sollte in normale Funktion nach längerer Reperfusion (hr bis Tage) zur Folge haben, ist es wahrscheinlich, dieses Protokoll wird nicht nachweisen vollständig erholt Funktion aufgrund der Ex-vivo-Langendorff-Perfusion, die mit reductons der Herzfunktion in der Steuerung verbunden ist, perfundierten Herzen über die Zeit. Dennoch ändert sich in der akuten Erholung der Herzfunktion bei Abwesenheit von Zelltod / Nekrose als Indizes für die Schwere der Betäubung der Hauptunterschied in diesem Protokoll vs. klassischen No-Flow-Ischämie Protokollen verwendet werden wird die Verwendung eines Herzschutz-Strategie, in dieser Fall ist hyperkaliämische Kardioplegie. Hyperkaliämische Kardioplegie-Lösungen bieten Schutz vor Verletzungen und nekrotischen Zelltod, indem diastolischen Herzstillstand. Diastolischen Stillstand des Herzens fördert Erhaltung der Energiereserven. Zudem sind die meisten klinisch verwendeten Herzschutz-Protokolle verwenden Hypothermie weiter limit Myokard-Schädigung durch Reduzierung metabolischen Bedarf. Andere Faktoren, die bei dem obigen Protokoll moduliert werden können, umfassen verschiedene Formulierungen Kardioplegie-Lösungen (hyperpolarisierende Formulierungen, Mg ++, K + -Konzentrationen, etc.), Strategien (Warm gegen Kälte, "Hot Shot ', etc.) und verschiedene Medikamente (kinase Inhibitoren, Ionenkanalmodulatoren, kardioprotektiven Mittel, etc.).

Da das Herz ist in einem relativ gut geschützt Zustand, um reproduzierbare Funktionsbeeinträchtigungen kommen in dieses Modell erfordert zwangsläufig mehr Ischämie Zeiten (dh mehr als 2 Stunden). Wir haben festgestellt, dass Nager Herzen sind in diesem Modell relativ resistent gegen Verletzungen, vor allem im Vergleich zu den größeren Tieren (Schweine, Menschen), die zuverlässig betäubt Myokard Anzeige während viel kürzere Zeiträume (dh, 30 min). Wir haben auch festgestellt, dass eine intermittierende Lieferung ist notwendig, um das Herz von schweren ischämischen Schaden als 45-60 min Intervall Follo schützenFlügel CP Lieferung kann in grober diastolische Dysfunktion, ischämische Kontraktur und Gewebeverletzung bei der Reperfusion führen. Andere leicht an Komponenten des Protokolls können Untersuchungen an CP Bestandteile und die Rolle der Hypo / normothermen Verhaftung sowie verschiedene Strategien Verhaftung auf K + nicht angewiesen (Na-Kanal-Blocker, Hyperpolarisation Mittel) ³ bezogen sind.

Es gibt auch eine Reihe von wichtigen Beschränkungen dieser Technik, wenn sie verwendet werden, zu modellieren Betäubung mit klinischen Herzchirurgie verbunden sind. Zuerst werden die Brutto Mehrzahl der klinischen CP Lösungen mit Blut (1 CP-Verhältnis ~ 4 Blut) gemischt. Dies ist im allgemeinen nicht machbar bei Mäusen durch die Perfusion Schaltungsvolumen sowie die Notwendigkeit für behandelte Schlauch und Faser Oxygenatoren. Oft für größere Tiere (Meerschweinchen / Kaninchen) Spendertieren würde auch erforderlich sein. Zusätzlich kann, wie in allen isolierten Organmodelle, der Einfluß der peripheren Faktoren (dh inflammatorische Signale, BlutwiederPerfusion, etc.) wird komplett ignoriert. Dennoch ist es eine praktische, effiziente und wirtschaftliche Modell für Vorstudien zur pharmakologischen Additiven und anderen Herzschutz-Strategien zu testen.

Das Protokoll ist im Wesentlichen identisch an Rattenherzen gefunden, mit der Ausnahme eines größeren Ballon und Aortenkanüle ^13,14. Darüber hinaus ist die Rattenherz Herstellung benötigt erheblich größeren Strömungsraten (12-20 ml / min). Aufgrund seiner Größe ist der Rattenherz Vorbereitung wesentlich einfacher zu erlernen und reproduzierbar durchzuführen. Auf andere Arten von Verletzungen, die sich in myocardial stunning Protokoll beurteilen kann leicht geändert werden. Um reversible ischämische Verletzung emulieren, einfach aufhören die Perfusionspumpe für kurze Zeit. Bei Ratten ~ 20 min globale Ischämie führt zu verminderter Kontraktionsfunktion ohne grobe Auswirkungen auf Zelltod und Infarkt führen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters - 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures