Introduction
肠道病毒是可感染人体肠道系统并且经由粪 - 口途径被发送的病毒不同群体。这些病毒通过污水处理厂和化粪池污水，设计不当或破损化粪池，下水道坏了线条，结合下水道溢出，等点和非点源1-4进入地表水和地下水。从水性病毒人类感染和疾病经由受污染的或未经消毒的水耗，或通过休闲水接触发生。疾病症状可能涉及轻微到严重胃肠炎;结膜炎;发热;上呼吸道窘迫;手足口病;心肌炎;无菌性脑膜炎;脑炎;麻痹; 5-8败血症，甚至死亡9,10。
USEPA方法1615提供了一个方法来衡量环境和水饮用肠道传染病毒颗粒。这些水域可含有感染性和非感染性病毒体的混合物，但只有感染性颗粒构成潜在的健康危害。感染性病毒颗粒由于可能存在的11-13任何消毒剂丧失感染性超过在从蛋白质衣壳的完整性，核酸由于来自太阳光的紫外线辐射，以及损坏损坏损失环境和饮用水的时间。在该方法中提供的总可培养病毒程序是基于生产的布法罗绿猴肾（BGM）细胞系细胞病变效应（CPE）。该细胞系的选择是因为它在环境病毒学领域14,15的广泛使用，即使检测到的感染性病毒类型的范围主要限于某些肠道病毒15。本文的目的是描述为五英寸的阳电筒式过滤洗脱，仲浓度和总可培养病毒测量方法1615的程序。的评估整个方法中Cashdollar 等人 16进行说明。
Protocol
注：请参阅补充材料S1节为定义列表。与USEPA方法1615相关的质量保证程序的补充资料部分S2描述。
1.过滤程序洗脱
- 首先洗脱
- 放置500毫升缓冲1.5％牛肉提取物，pH为9.0的，温热至室温下，在量筒。打开过滤器滤芯外壳和添加牛肉提取物的足够量的完全覆盖正电的过滤器。更换过滤器外壳盖子，倒入剩余的牛肉膏到无菌烧杯中。
- 的接触时间1分钟后，通过在壳体中的牛肉提取液用缓慢通过过滤器使用压力容器或蠕动泵残留在无菌烧杯一起。收集洗脱液成2升玻璃烧杯中。
- 第二次洗脱
- 重复使用附加500毫升缓冲的1.5％，牛肉膏1.1步的，但增加在步骤1.1.2接触时间为15分钟。
- 从第二次洗脱添加牛肉提取物，以含有从第一洗脱2L烧杯中。无菌搅拌棒加到烧杯中。
2.有机絮凝浓缩过程
- 消毒用0.525％次氯酸钠的组合型pH电极至少5分钟。冲洗用无菌的dh 2 O电极，然后用0.05M硫代硫酸钠脱氯。校准使用pH值为4和7的标准pH计。
- 将装有小的轰动板的洗脱液中的烧杯中。打开板和增加搅拌速度，直到形成涡流。
- 逐滴加入1.2M的HCl与洗脱液缓慢调节洗脱物至3.5±0.1的pH值。添加盐酸滴，因为快速另外将可灭活病毒。在此期间，作为沉淀物开始形成洗脱液将变得浑浊。
- 降低混合SPE编一个缓慢的搅拌，然后继续监控和维护洗脱液在3.5±0.1在室温下的pH 30分钟。
- 倾析出牛肉膏悬浮液到一个或多个离心瓶，离心15分钟，在4℃下2,500 xg离心。从离心机和任一抽吸取出瓶子或慢慢倒出上清液，以防止沉淀沉淀物的损失。弃去上清液。
注意：可以有牛肉提取大量的沉淀物的数量和质量之间的相当大的变化。从有的地段产生的沉淀物会迅速溶解，而从其他许多难以溶解。 - 30毫升的0.15M磷酸钠添加到含有沉淀的离心瓶中。
- 使用的0.15M磷酸钠，用于从牛肉提取大量该5分钟内溶解的沉淀物的pH 9.0。搅拌10分钟后的沉淀物完全溶解，然后转到立即步骤2.7。
- 使用的0.15M磷酸钠，pH 7.0-7.5所有其他沉淀。搅拌10-15分钟以溶解，或者用于更难以析出物，用移液管搅拌期间它们分开用无菌刮刀，通过反复吸取溶液上下摇动，在160转的沉淀定轨振荡器上，或通过这些方法的组合。
注意：当使用一个以上的离心瓶中，结合使用小于30毫升磷酸盐钠的沉淀，然后用30毫升的其余部分上的析出物合并成一个瓶或烧杯后冲洗瓶。 - 如果组合的沉淀物是在一个平底离心瓶中，搅拌棒添加到瓶中。转到步骤2.6.5。
- 如果组合的沉淀物是在离心机瓶具有圆锥形底部，将其转移到一个小玻璃烧杯中，并搅拌棒添加到烧杯中。
- 放置瓶或烧杯上磁力搅拌器，搅拌直至公关ecipitate完全溶解。
- 重新消毒用0.525％的次氯酸钠组合型pH电极和步骤2.1说明用硫代0.05酸钠脱氯。校准用pH 7和10的标准的pH计。缓慢调节完全溶解沉淀至9.0用1M NaOH的pH值，然后搅拌10分钟。
- 取出搅拌棒，并在4,000-10,000 XG，4℃离心沉淀溶解10分钟。
- 小心倾上清液到玻璃烧杯中，而不会干扰沉淀。搅拌棒添加到烧杯中，并弃沉淀。
- 放置烧杯上磁力搅拌器，并搅拌该溶液。添加1.2 M盐酸逐滴以调节pH至7.0-7.5。
- 滤波器通过包含已预处理用15毫升的1.5％牛肉膏，0.05M的甘氨酸，pH值7.0-7.5预滤器灭菌过滤消毒由通道上清液。
- 分析样品VolumE（S）计算：
- 使用公式1来计算S表示，除了实验室筑堡垒空白，实验室试剂空白的所有测试样本，
式（1）
其中D（检测大鼠原水样量）是500升的地下水，TSV（总样本量）是通过实验室收到的5英寸阳电滤芯过滤器通过现场样品的体积和FCSV（最终浓缩样品体积）是以下步骤2.10过滤的体积。一个例子示于补充材料节S4.1。 - 计算S为实验室空白加标（LFB; 即使用种子试剂级水阳性质控）和实验室试剂空白（LRB; 即使用试剂级水阴性质量控制）由0.3 FCSV相乘。
- 使用公式1来计算S表示，除了实验室筑堡垒空白，实验室试剂空白的所有测试样本，
- 划分成FCSV THREê子样本。
- 准备副样1和2等于1.04倍的测定样品体积的体积。冻结这些子样本在或低于-70℃，如果他们不能使用的总可培养病毒试验（次采样1，步骤4）进行分析，或24小时内的分子检测（未示出）进行处理;否则，保持在4℃。
- 在等于或低于冻结剩余体积（子样本3）-70℃。
- 通过除以10在S计算接种量 。
式（1） 3.总可培养病毒量子含量
注：对于所有的步骤，始终仔细添加解决方案，以避免干扰细胞单层。
- 滗析或从含有BGM细胞单层在3-6天后分裂试验容器抽吸介质，然后添加平衡盐溶液的等于除去培养基的体积。
- 倒出或抽吸从细胞培养德的平衡盐溶液使用圣血管再接种细胞培养物测试容器
- 10接种试验容器与子样本1等于接种量 ，总可培养病毒检测量子控制（补充材料部分S2.4）沿的体积每个测试样本。
- 为LFB和实验室强化样品基质（LFSM; 也就是 ，接种水基质样品），准备用子样本3和0.15M的磷酸钠，pH 7.0-7.5作为稀释剂5-，25-，和125倍稀释液。用于使稀释的过程的一个例子中的补充材料部分S3中给出。接种使用上除了在步骤3.2.1未稀释子样本1接种容器各试验容器中的接种物体积各稀释系列10洗涤的细胞培养试验容器。
- 从步骤3.2.1（高于3.2.2步接种除外）的任何测试样品有CPE在孵化后14天的所有10个重复（见步骤3.3），预削子样本3的5-，25-，和125-和625倍稀释液接种10洗涤的细胞培养试验容器使用上的每个测试容器中的接种物体积与一组新的总可培养病毒量子沿着各稀释系列实验对照组（补充资料部分S2.4）。
- 通过倾斜容器来回分发细胞单层表面上的接种物。在室温下孵育试验容器为80-120分钟在机械摇动平台在1-5振荡/分或与血管的摆动每15-20分钟，以允许任何存在的病毒吸附到细胞。
- 添加预热的维持培养基，然后在36.5±1℃下孵育试验容器。
- 用显微镜寻找的CPE中的每个测试容器外观每日为第3天，然后检查它们每2-3天至第14天转移任何试验容器，显示≥75％的CPE到冷冻机设定在或低于-70℃。冻结所有剩余的文化，总培养的病毒检测量子控制在或低于-70℃考察的最后一天血管后。
- 解冻所有培养物，并通过0.2μm的无菌过滤器过滤从每个CPE阳性测试容器中的介质的≥15％。如果指定的卷不能穿过过滤器在1,500-18,000 XG传递由于堵塞，离心培养基10分钟，4℃之前过滤。
- 执行使用洗BGM测试所有的船只1 日通过测定容器的第二通道。
- 接种与表示从所有阴性试验容器和从阳性血管的过滤介质的解冻介质的10％的接种量的新的试验容器。
- 重复步骤3.2.4-3.4.3，但冻结任何试验容器如步骤3.3描述的是在1 日通过的消极和积极的第二位 。执行第三通作为仅使用阴性测定对照和分别在第二通道中的1 次通过期间的阴性和阳性细胞培养物中的第 2 次通道描述的年龄。
- 确定各个测试容器如病毒阳性时，显示出在第1 次和第2 次传代或两者的CPE，在CPE不发生，直到第二通道，同时在第 2 次和第3 次传代的情况下。
- 使用美国环保局的最大可能数计算器与见表S2中计算所有测试样品的病毒滴度设置的默认程 序设置。
- 输入来自步骤3.6的每个测试样品的病毒阳性复制试验容器的数量到计算器确定MPN / ml的值（M 毫升 ）和上部（CL UML）和下（CL 为1mL）95％置信限/ ml的值。
- Øbtain使用等式2相应的测试样品的MPN / L值（M L）。
公式（2）
中号毫升是在步骤3.7 MPN / ml的值，S是测定样品体积 ，D是检测大鼠原水样品的体积 。 - 通过替换用于M 毫升值为CL值UML计算置信上限/ L。通过替换用于M 毫升值CL 为1mL值计算置信下限/ L。一个例子计算显示在补充材料科S4.2。
- 0为≤-1 / D报告中号 毫升值。例如，≤0.002 MPN / L（≤1/500 L）地下水样本。
- 计算MPN和95％可信限值为每个实验室强化空白和实验室的重复剂通过第一乘以用S计算器获得的值/毫升，然后通过0.3除以结果空白。
公式（2） Representative Results
病毒从三个饮用水处理厂和私人以及使用正电的过滤器的源地下水浓缩。两个样本集，它由一个场样品和LFSM控制的，从该处理厂收集在不同的场合，以及一个样品组从私人井收集。使用LFSM样品测定从两个植物和私人井（从一种植物和从另一个样品两个样品的整体病毒回收被排除在计算，因为与各样品中使用的种子的MPN值不能被准确地，由于确定复制烧瓶中异常CPE结果）。从地下水样品意味着脊髓灰质炎病毒回收率平均为79％变异系数58％（ 图2）16。在任何重复的未接种的地下水字段样品中没有检测到可培养病毒。
方法表现也使用测量LFB小号amples通过使用两个不同的种子水平修改。脊髓灰质炎病毒的300 MPN的“低”价被用来评估在低于“标准”的500 MPN LFB在USEPA方法1615年“高”价平使用性能级别的脊髓灰质炎病毒1000 MPN被用来在测试性能在LFSM控制水平。这些控制用的111％的平均回收率为100％的变化系数（ 图2）执行类似。所有样品LRB均为阴性和接受范围（补充材料表S1）内执行的所有LFB样本。
图1.过滤洗脱。一种使用的滤芯过滤器洗脱的压力容器原理图。正空气压力用于通过暗盒壳体CON推在压力容器牛肉提取液泰宁阳电筒式过滤器。蠕动泵可以取代的压力容器，与泵的入口被置于容器中保持的牛肉提取液。
图2.脊髓灰质炎病毒的平均回收率（％）从地面和水面试剂级，平均回收率显示从地面脊髓灰质炎病毒（ 
; N = 4）和试剂级水（ 
; N = 12）的样品。十二试剂级水样包括6种入300 MPN和六脊髓灰质炎病毒的1000 MPN接种。误差条代表标准误差。
Discussion
USEPA方法1615是为无管制的污染物监测法规的第三监视周期（UCMR3）17中使用而开发的，并主要用于测量地下水发生病毒设计。这股数与信息收集规则（ICR）方法，15,18常见的步骤，但有两个细微的差别。两者都使用量子实验来测量被基于最大可能数（MPN）的计算产生CPE的BGM细胞单层与定量病毒。方法1615允许从各种水基体集中的病毒采用了较新的正电过滤器，并减少细胞培养试验容器的数量每稀释重复20至10这两个微小的变化降低整体成本的方法。在重复的数量的减少降低了劳动，但导致略微较低的检测极限。虽然地下水预期具有较低浓度的病毒比表层水，19,20第测定样品电子量是五倍地表水，在用于不同部分补偿。使用更少的重复的将是足以满足大多数地表水，但有些需要稀释样品。
方法1615有几个关键的步骤和限制。牛肉提取物有所不同批次。每批应进行病毒洗脱效率和通过二级浓缩步骤的能力，病毒浓度测试所描述的是补充材料部分S2.3。该方法使用精确的公式，用于计算样品的量接种到BGM的细胞培养物，并确定病毒滴度。如果这些式不严格遵循不准确的结果将生成。必须用于维持细胞培养物适当无菌技术。该显示在14天的潜伏期窘迫未感染的BGM细胞培养控件可能表明与细胞培养维护问题。大保养也必须TA肯中吹打涉及的接种和培养基除了细胞培养瓶中，以避免交叉污染的步骤。在补充材料S2节中描述的质量控制必须严格的执行。第S2还提供故障排除建议的质量问题。
病毒吸附的主要机制，以正电的过滤器是与过滤器上的正电荷的强度和病毒的有关它的等电点负电荷的强度和被测试21的水的pH值的电荷相互作用。从过滤洗脱也由这些相互作用的强度的影响。因为它们之间病毒类型和甚至在相同类型的内菌株而变化，从过滤器的洗脱不统一。这意味着，任何结果可能低估病毒存在于环境水的实际水平。使用单一的BGM细胞系也低估了病毒的发生。范围的，可以在该细胞系主要被限制为脊髓灰质炎病毒和肠病毒乙物种的血清型，以及一些呼肠孤病毒14,15,22产生的CPE肠溶病毒。其他传染性病毒类型将不被检测到。
从地面和试剂级水脊髓灰质炎病毒回收率满足USEPA方法1615性能验收标准为性能评价（PE; 也就是 ，接种试剂级水样与用于评估分析之前的起动性能滴度未知分析师一项研究）和LFB样品（补充材料表S1）的。从使用培养过程地下水58％的回收率是类似于由其他人使用自来水23,24的报道。从111％的LFB样本变异的100％（CV）的系数，平均回收率也达到了性能的方法验收标准，即使他们比，对于PE样品观察到更高DURING的ICR。 ICR意味着实验室间回收率为56％与92％的变化（CV）的一个系数而平均实验室内回收率从36变化到85％（的CV 58至131％;从所述ICR体育数据库未公布的数据）。在这项研究中用于低种子LFB样品比更高的种子样品（122对比42％）观察到更高的回收率。在该ICR正在计划的时候，有人预计，接受较低的种子值PE样品将具有更低的复苏，那些接受高种子。类似于这里观察到LFB样品，ICR PE样品脊髓灰质炎病毒回收率为71％（CV 100％），54％（CV 69％），和44％（CV 71％）为种子值≤300MPN，300- 1500 MPN和> 1500 MPN，分别为。
有水样25测量传染性病毒许多方法。这种方法是在相对于在标准化程度的其它方法显著。标准化不仅包括质量和性能的控制，而且还使用定义的卷和公式，以确保所有的分析实验室进行相同的方法。没有标准化，所以很难在整个实验室比较的结果，并且因此导通在多个分析实验室规模的研究，当标准化是必不可少的。与内置在标准化此方法可以在将来进行扩展以包括额外的病毒类型和细胞系。研究正在进行中，以纳入腺病毒的进入方法提供数据。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beef extract, desiccated powder | BD Bacto | 211520 | |
| Cryogenic tubes | Thermo Fisher | 3775/945373 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| Mechanical rocking platform | Daigger | EF4907G | |
| Orbital shaker | Thermo Fisher | 14-285-729 | |
| Sterilizing filter with prefilter | VWR | 28143-295 | |
| Sterilizing syringe filter | Corning | 431219 | |
| pH Standards | Sigma-Aldrich | 33643, 33646, 33648 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M1018 or M4642 | |
| Leibovitz L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | |
| Sodium bicarbonate, 7.5% | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Trypsin, EDTA | Invitrogen | 25200072 |
References
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