Abstract
Geboorte asfyxie, die hypoxisch-ischemische encefalopathie (HIE) veroorzaakt, is goed voor 0.660.000 doden wereldwijd elk jaar, ongeveer een kwart van de wereld 2,9 miljoen neonatale sterfte. Diermodellen van HIE hebben bijgedragen aan het begrip van de pathofysiologie in HIE, en hebben gewezen op het dynamische proces dat zich in hersenletsel als gevolg van perinatale asfyxie. Zo hebben dierstudies een time-window voor post-belediging behandelingsstrategieën voorgesteld. Hypothermie is getest als een behandeling voor HIE in pdiglet modellen vervolgens effectief gebleken in klinische studies. Variaties van het model zijn in de studie van adjuvante neuroprotectieve methoden en biggen studies van xenon en melatonine toegepast geleid tot klinische fase I en II studies 1,2. Het biggetje HIE model wordt verder gebruikt voor neonatale resuscitation- en hemodynamische studies alsook in onderzoeken van cerebrale hypoxie op een cellulair niveau. Het is echter technisch moeilijkmodel en variaties in het protocol kan ofwel te zacht of te ernstig hersenletsel. In dit artikel tonen we de nodige technische procedures voor de oprichting van een stabiele big model van neonatale HIE. Eerst wordt de pasgeboren big (<24 uur oud, gemiddelde gewicht 1500 g) geanesthetiseerd, geïntubeerd, en bewaakt een opstelling vergelijkbaar met die in een neonatale intensive care unit. Globaal hypoxie-ischemie wordt veroorzaakt door het verlagen van de ingeademde zuurstof fractie tot wereldwijde hypoxie, ischemie door middel van hypotensie en een flatscreen trace amplitude geïntegreerd EEG (aEEG) indicatief cerebrale hypoxie bereiken. Overleving wordt bevorderd door aanpassing oxydatie volgens de aEEG response en bloeddruk. Hersenletsel wordt gekwantificeerd door histopathologie en magnetische resonantie imaging na 72 uur.
Introduction
Perinatale asfyxie is een acute en vaak onverwachte aandoening geassocieerd met hypoxisch-ischemische encefalopathie (HIE). Het algemene doel van dit protocol is om een bigoverleving model van perinatale hypoxisch-ischemische encefalopathie demonstreren. Dit model kan worden gebruikt om het effect van verschillende mate van hypoxie-ischemie te onderzoeken op de hersenschade en experimentele behandelingen neuropathologie, magnetische resonantie beeldvorming en spectroscopie (MRS en MRI) en biomarkers in lichaamsvloeistoffen zoals bloed, cerebrospinale vloeistof en urine . Het model is ook nuttig gebleken voor het onderzoeken van het cardiovasculaire systeem, het ademhalingsstelsel, de nieren en de lever, die zijn getroffen in globale hypoxie-ischemie.
Perinatale asfyxie is het gevolg van gecompromitteerde zuurstoftoevoer bevalling of in de onmiddellijke post-partum periode. Intrapartum hypoxie evenementen zijn goed voor 0.660.000 doden wereldwijd elk jaar, ongeveer een kwart van de wereld 2,9 molenion neonatale sterfgevallen in 2012 3. In 2010 is 1,15 miljoen baby's werden geschat neonatale encefalopathie te hebben ontwikkeld na de geboorte asfyxie 4. HIE gedefinieerd als encefalopathie bij kinderen geboren na 34 weken zwangerschap komt in 1-3 / 1000 levendgeborenen 5 in de geïndustrialiseerde wereld en tot 8,5 / 1000 levendgeborenen in ontwikkelingslanden 4. Het risico op overlijden is 10-60%, en het risico van neurologische handicap bij overlevenden 30-100% 6,7. 50.200.000 disability adjusted life years (DALY's) worden toegeschreven aan intrapartum hypoxie gebeurtenissen 4. Momenteel is de enige andere behandeling dan ondersteunend voor HIE is posthypoxische onderkoeling. Zo vooruitgang in diagnostische procedures en de behandeling van strategieën zijn essentieel voor het beheer van de HIE 8 te verbeteren.
Verbeteringen in de prognose na perinatale asfyxie en het beheer van neonatale hersenletsel zijn gebaseerd op het uitbreiden van de kennis van de onderliggende ziektemechanismen eend mogelijke behandelingen. Diermodellen van HIE zijn bijzonder bruikbaar als verschillende klinische gebeurtenissen kunnen leiden tot HIE en de incidentie in een enkele geboortecentrum is laag 5. Een experimentele opstelling waarin de invloed van de biologische variatie kan worden geminimaliseerd, is essentieel bij het testen van nieuwe prognostische en diagnostische instrumenten en therapeutische strategieën. Een diermodel dient de klinische situatie zo dicht mogelijk benaderen, wat bijdraagt tot het begrip van de pathologische mechanismen waardoor geïnduceerd letsel en dynamisch proces betrokken zijn bij de ziekte en it's resultaat 9. Diermodellen van neonatale HIE hebben een aantal species, waaronder knaagdieren, lammeren en varkens inbegrepen. In vergelijking, de pasgeboren biggen een hogere gelijkenis met menselijke pasgeborene betreft maat, cardiovasculair systeem 10 en hersenrijping op de levering 11,12. Monitoring, instrumentatie en evaluatie van de resultaten in de biggen model is vergelijkbaar met that in de klinische verzorging van kinderen met HIE. Dienovereenkomstig is er een grote mate van vertaling in pasgeboren zorg van dit model.
Biggen modellen van perinatale hypoxie en HIE worden door vele groepen en variëren in verschillende gebieden 13. Volgens het doel van het experiment, moet aandacht worden besteed aan de keuze van geneesmiddelen, werkwijze voor het induceren van hypoxie-ischemie, werkwijze voor het regelen insult duur en ernst, na insult reanimatie en zorg en evaluatie van de resultaten. Om vertekening een gerandomiseerde trial ontwerp moet altijd worden gebruikt in interventionele studies te vermijden.
De methode die wordt toegepast bij het opwekken van hypoxisch-ischemische letsel is belangrijk. Globaal hypoxie leidt tot HIE resulteert vaak in multi-orgaanfalen met hersenen, hart, longen, nieren en lever. Afhankelijk van de resultaten geëvalueerd moeten modellen HIE op basis van globale hypoxie en ischemie plaats van te vertrouwen op focale ischemie, bijv. Door ligatie autootid slagaders 14. Een recente studie paste een combinatie van hypoxie (FiO 2 12%) en halsslagader compressie behoud gemiddelde arteriële bloeddruk> 40 mm Hg 2. Een andere groep veroorzaakte globale hypoxie met 8% O 2 tot negatieve base overschot> 20 mmol / L of de gemiddelde arteriële bloeddruk (MABP) <15 mm Hg, en offerden de dieren in 4 uur 15. Hypoxie is ook getitreerd door cardiale output (tot 30-40% van de uitgangswaarde), MABP (30-35 mm Hg) en arteriële pH (6,95-7,05) 16.
Modellen globale hypoxie-ischemie getitreerd door aEEG onderdrukking vergelijkbaar met die in dit rapport, hebben aangetoond encefalopathie die klinisch, elektrofysiologische en neuropathologie te vergelijken met de toestand in het asfyxie term zuigeling 17,18.
De mate van HIE geïnduceerde is essentieel. Een nuttig diermodel van HIE moet ook zorgen voor het testen van nieuwe diagnostische procedures en behandeling opties. Om dit mogelijk te maken dient de modellen gematigde HIE waar een behandeling potentieel ernstig hersenletsel met weinig of geen behandeling mogelijk zou minder relevant zijn bij het evalueren van nieuwe behandelingen induceren. Tolerantie voor hypoxie verschilt aanzienlijk tussen de proefdieren. Eerdere studies hebben aangetoond dat een meer consistente hersenletsel kan worden bereikt en dat er meer dieren overleven 17,19 individualiseren van de geïnduceerde hypoxia volgens cerebrale antwoord Elke big geëvalueerd door amplitude geïntegreerde elektro (aEEG) in plaats van een ingestelde waarde 2 FiO gehele hypoxische gebeurtenis. De duur van aEEG onderdrukking correleert met de mate van hersenletsel, met weinig histopathologische veranderingen op <20 min aEEG onderdrukking en ernstige convulsies toeneemt met> 45 min aEEG onderdrukken. Een recente beoordeling van neuroprotectieve behandelingen voor HIE gewezen op de noodzaak om te overleven modellen waardoor gedragsproblemen uitkomst measgelen in diermodellen 20.
Er zijn tal van voordelen van de gepresenteerde HIE biggen model. Het is gebaseerd op een soort waar de resultaten zeer waarschijnlijk vertalen naar de menselijke fysiologie. Globaal hypoxie-ischemie modellen multi-orgaanfalen en titratie van hypoxie-ischemie aEEG induceert een consistente mate van hersenletsel met overleving klinisch relevante resultaten zoals die biomarkers, MRI en gedrag kan worden op relevante tijdstippen geëvalueerd.
Knorretje modellen van perinatale asfyxie en HIE hebben niet alleen in belangrijke mate bijgedragen aan de huidige inzicht in HIE pathofysiologie, maar hebben ook met succes voorafgegaan klinische proeven, uiteindelijk resulterend in nieuwe behandelingen bij mensen. Knorretje modelstudies speelde een belangrijke rol bij het vaststellen van onderkoeling als een behandeling voor HIE 21, en worden gebruikt in neonatale reanimatie onderzoek 22. Verschillende groepen hebben gebruikt biggen modellen bij het uitvoeren van onderzoek binnen verstikking en HIE, eend studies omvatten hypothermie 23, alfa-melanocyt stimulerend hormoon 24, hartstilstand 25, tyrosine hydroxylase activiteit 26 herhaalde hypoxische blootstelling 27, NMDA receptoractiviteit 14 en nabij-infraroodspectroscopie 28.
De biggen HIE model gepresenteerd in dit rapport is technisch uitdagend om mee te werken, als kleine aanpassingen in de loop van de procedure kan leiden tot ofwel te licht of te zwaar hersenletsel 29,2. We vonden dat de bestaande literatuur ontbrak voldoende gedetailleerd zijn om eerder gepubliceerde modellen reproduceren. Zo hebben we hier te tonen elke stap van de nodige technische procedures voor de oprichting van een biggetje 72 uur overleven model in dit verslag, waardoor de onderzoekers om dit geavanceerde model vast te stellen voor de studie van HIE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het huidige protocol werd goedgekeurd door de Deense Inspectie Dierproeven. Alle testdieren werden geanesthetiseerd gehele procedures. Reproductie van dit protocol moet in overeenstemming met de nationale ethiek en richtlijnen voor dierenwelzijn worden uitgevoerd en door de lokale ethische comités goedgekeurd.
1. Dieren
- Deense Landras biggen <24 hr oude gewicht van ongeveer 1.500 - 2.000 g.
2. Anesthesie en Onderhoud Fluids
- Bereid de apparatuur die nodig is voor anesthesie (Figuur 1): Een masker voor sevofluraan toediening alcoholdoekjes perifere intraveneuze katheter, elastiek, spuiten met zoutoplossing, propofol (5 mg / kg), fentanyl (10 ug / kg), en procaine benzylpenicilline (15.000 IU / kg).
- Induceren verdoving door het leveren van 1-2% sevofluraan via een beademingsmasker.
- Beoordeel de diepte van de anesthesie door beoordeling voor palpebrale en intrekking reflexen. Wanneer bepaalde dat de biggen is diep verdoofd, percutaan plaats een perifere intraveneuze katheter in het oor ader.
- Om doorgankelijkheid van de perifere intraveneuze katheter te bevestigen, spoelt de katheter met 1-2 ml steriele 0,9% zoutoplossing. Dien bolusinjecties van propofol (5 mg / kg) en fentanyl (10 ug / kg). Na bolusinjectie administratie spoelen de intraveneuze katheter een tweede keer met 1-2 ml steriele 0,9% zoutoplossing.
- Plaats spuiten met propofol (10 mg / ml) en fentanyl (10 ug / ml) in twee afzonderlijke injectiespuit infusiepompen. Verbinding iv buizen uit beide spuitpompen een driewegkraan verbinden infusies in een enkele lijn die is verbonden met de intraveneuze catheter. Start continue intraveneuze infusie van propofol (4-12 mg / kg / uur) en fentanyl (10 ug / kg / h). Zodra continue infusies actief zijn, niet verder bolus injecties van propofol en fentanyl geven.
- Stop de toediening van de sevofluraan gas anesthesia.
- Injecteren procaine benzylpenicilline (15.000 IE / kg) subcutaan of intramusculair als per lokale richtsnoeren voor antibiotische profylaxe. Herhaal dagelijks. De video toont sc toediening, die bij biggen is aangetoond dat het resulteert in een hogere plasmaconcentratie en langere halfwaardetijd in vergelijking met im toediening.
- Breng oogzalf zalf om uitdroging van de ogen te voorkomen. Trek het onderste ooglid zachtjes naar een pocket-achtige opening te vormen. Knijp een kleine hoeveelheid zalf in de zak. Nauwlettend in de gaten te zalf verdelen. Controleer voor droogte per uur en opnieuw toe te passen als dat nodig is.
- Start een continue snelheid infusie van 5% dextrose / 0,45% NaCl iv bij 10 ml / kg / uur. Verlaag snelheid tot 5 ml / kg / uur gedurende en na hypoxie. Pas infusiesnelheid om de bloedsuikerspiegel te houden tussen 2-10 mmol / L.
FiguAd 1. Apparatuur voor anesthesie en intubatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. intubatie en ventilatie
- Bereid de apparatuur die nodig is voor intubatie (Figuur 1): rocuronium bromide (1 mg / kg) voor spierverslapping een stroppen (bind beide uiteinden van dezelfde 4 mm nylon touw samen om een cirkel te vormen zoals weergegeven in figuur 1) voor het openen de mond, een wattenstaafje en veterinaire laryngoscoop met rechte mes, xylocaine spray (100 mg / ml), verschillende maten endotracheale tubes met cuff (maten 3,0 mm, 2,5 mm, 2,0 mm), 500 ml zelfopblazende zak (bag ventiel masker) voor ventilatie, 2 ml spuit voor cuff inflatie en stethoscoop.
- Intuberen door de volgende stappen:
- Plaats biggetje in rugligging het ondersteunen van de nek van elke kant een rechte larynx pas veiligsalie voor intubatie.
- Schat de lengte van de endotracheale tube door het meten van de punt van de snuit tot het borstbeen (typisch ongeveer 13 cm).
- Plaats touw strop rond de bovenkaak (naar beneden) en houdt de onderkaak en tong omhoog om de mond open te houden.
- Dien rocuroniumbromide (1 mg / kg) iv tot ontspanning van de spieren te veroorzaken.
- Gebruik laryngoscoop aan de tong omhoog tillen.
- Gebruik het wattenstaafje om de big lange epiglottis, die ofwel kunnen worden retroverted in de slokdarm of gevangen achter het zachte gehemelte te bevrijden.
- Advance laryngoscoop om de epiglottis opgeheven tegen de tong base waardoor het volle zicht van de arytenoid kraakbeen en de stembanden te houden.
- Breng Xylocaine spray (100 mg / ml) topisch in de larynx naar larynx spasmen.
- Advance endotracheale tube door de stembanden. Gebruik een draaiende beweging om het passeren van de smalle tracheale kraakbeen te helpen. Advance buis According naar de afgemeten afstand en aansluiten op een zelfopblazende zak (AmbuBallon) voor handmatige ventilatie. Te helpen verminderen wrijving tijdens intubatie spuit de distale 1/3 van de endotracheale buis met Xylocaine spray.
- Om juiste endotracheale tube plaatsing bevestigen: acht voor een indicatie van ademhalingsproblemen, ausculate de borst te luisteren voor de bilaterale lucht binnenkomst in beide longen, visueel bevestigen de aanwezigheid van condensatie in de proximale aspect van de endotracheale tube, en controleren op de aanwezigheid van end tidal koolstof dioxide met een colorimetrische kooldioxide detector of door expiratoire CO 2 lezing over de mechanische ventilator indien beschikbaar. Normale end tidal kooldioxide is ongeveer 5%. Een waarde boven 2% tezamen met een normaal weergegeven golfvorm bevestigen dat de endotracheale buis in de luchtpijp.
- Pomp de endotracheale tube manchet om aspiratie te voorkomen. Oppompdruk moet minder zijn dan 25 cm H 2 O ischemische schade te voorkomen aan het omringende weefsel. Houd de endotracheale tube in de plaats, de wind een stuk tape rond de buis, sluit de kaak en blijven tapen rond de snuit tot de slang vast te zetten. Trek voorzichtig aan de buis om ervoor te zorgen dat het blijft op zijn plaats.
- Sluit endotracheale buis mechanische ventilator.
- Pas ventilator instellingen: volume gecontroleerde ventilatie, tidal volume (TV): 10 ml / kg [of piek inspiratoire druk (PIP) 15 cm met een druk gecontroleerde ventilatie]. Positieve eind expiratoire druk (PEEP): 5 cm. I: E-verhouding 1: 2. Rate van de ademhalingswegen: 35 (aan te passen tarief end-tidal CO 2 te behouden tussen 4.5-5.5 kPa).
4. Monitoring en Body Fluid Sampling
Figuur 2. apparatuur voor monitoring.ank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bereid de apparatuur die nodig is voor de controle (Figuur 2): plakband, steriel glijmiddel, voor continue rectale temperatuurmeting, elektrocardiogram (ECG) elektroden pulse oximeter, scheermes en EEG-elektroden.
- Plaats verzadiging sonde op een achterpoot, smeer rectale temperatuur sonde en steek 6 cm in het rectum, plaats overhead straalkachel en / of verwarmde opblaasbaar luchtbed aan de rectale temperatuur op het fysiologische niveau van 38,5-39 ° C te houden, en de plaats ECG elektroden.
- Plaats biggetje in buikligging op gebieden die van 1 cm x 1 cm voor de plaatsing van onderhuidse naald EEG-elektroden scheren; een voor elk oor, en de referentie-elektrode in de middellijn net achter de ogen. Reinig de elektrode site met een alcoholdoekje, steek de naald elektrode onderhuids. Secure elektroden met plakband en terugkeer biggen naar de liggende positie.
- Schakel aEEG monitor.
LET OP: De amplitude geïntegreerde EEG bestaat uit een dichte trace met de bovenste en lagere marges. Lagere en hogere marges in dit model zijn meestal 15-50 mV, vaak hoger dan gezien bij zuigelingen. Tijdens hypoxie is het belangrijk om op te merken, dat artefact van de ECG kunnen valselijk verheffen het aEEG spoor. Bolus medicijnen (propofol of fentanyl) kan ook tijdelijk onderdrukken de aEEG spoor en moet worden vermeden indien mogelijk tijdens het experiment. Toediening van geneesmiddelen en klinische gebeurtenissen moet worden gemarkeerd om de interpretatie van de aEEG spoor te vergemakkelijken.
- Bereid de apparatuur die nodig is voor het plaatsen van umbilical catheters voor centrale arteriële bloeddrukmeting en bloedafname (Figuur 3): steriele handschoenen, steriel draperen, scalpel, alcohol gedrenkte doekjes, steriele doekjes, navelstreng katheter (5 Fr), navelstreng slagader katheter (3,5 Fr ), hechtdraad set met een tang, gebogen micro tang, schaar, naald houder en de hechting (bijvoorbeeld, grootte 3-0), transparante lijm patch, 5 ml spuiten voor bloedafname.
Figuur 3. apparatuur voor navelstreng lijnen en bloedafname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Steriliseren en drapeer het gebied rond de navel. Met een scalpel om de navelstreng zo dicht mogelijk bij de huid mogelijk te snijden. Als dit niet de navelstreng schepen in de verdoofde biggen doet bloot, snijd de navelstreng huid 2 mm onder de navelstreng om de schepen te ontmaskeren. Neem de twee kleine navelstreng slagaders en een grotere navelstrengader (figuur 4).
- Gebruik gebogen micro tang om de slagader (figuur 4) verwijden en steek de navelstreng arteriële katheter(3,5 Fr). Raming insteeklengte in cm tot 3 x gewicht (kg) + 10 (empirische formule op basis van correcte plaatsing in aflopende aorta boven de nierslagaders op autopsie).
- Plaats een tweede 5 Fr katheter 5 cm in de navelstrengader (figuur 4). Controleer intravasculaire katheter door bloed terugkeer. Secure katheters door het plaatsen van een portemonnee-string hechtdraad rond de navel, langs de hechtdraad eindigt rond elk van de navelstreng katheters en een knoop. Bedek katheters met transparante lijm dressing.
- Verzamel bloedmonsters op vooraf vastgestelde tijdstippen: 1) onmiddellijk voor hypoxie, 2) 30 min in hypoxische insult 3) aan het eind van de 45 min hypoxische insult 4) 2 uur na hypoxische insult. Afhankelijk van het doel van het experiment andere tijdstippen bloedmonsters worden gekozen.
- Gebruik arteriële bloed gas analyse van bloedmonsters genomen tijdens hypoxie om bloed gas veranderingen veroorzaakt door hypoxie-ischemie (tabel 1) te controleren. Merk op dat biggen hebben een lage hemoglobine eent geboorte (ongeveer 8 g / dl) en kunnen bloedarmoede frequente bloedafname geworden. Trekken minder dan 2 ml bloed / kg lichaamsgewicht per loting, op minder dan 5 ml bloed / kg lichaamsgewicht binnen 24 uur en zich houden aan de lokale richtlijnen voor bloedafname. Tekenen van anemie onder dalende hematocriet en tachycardie.
- Sluit arteriële lijn naar een monitor voor verder intra-arteriële bloeddrukcontrole (MABP). Gebruik veneuze lijn voor vocht en toediening van het geneesmiddel.
Figuur 4. Umbilical schepen. Umbilical ader (rechts) en één van de twee navelstreng slagaders (links). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Hypoxie
- Wacht 60 minuten na het voltooien monitoring. Induceren hypoxie overschakelt op een 4% O 2 N2 gasmengsel. Monitor vitale parameters en aEEG de voet en blijven hypoxie gedurende 45 min.
- Zodra de aEEG trace vlak (bovenste randgebied <7 mV), aanpassen door het wijzigen van de oxygenatie zuustofhoeveelheid (FiO 2) en gemiddelde luchtwegdruk het hoogste FiO 2 niveau handhaven van een vlak tracé aEEG volgens de in figuur 5 stroomschema. Doel voor MABP dan 70% van de basislijn gedurende tenminste 10 minuten en eventueel lager FiO 2 hypotensie en ischemie waarborgen. De beschreven niveau van hypotensie Eerder is aangetoond door anderen 19,13,30 relevante hypoxisch-ischemische hersenbeschadiging te produceren.
- Bij ernstige hypotensie (MABP <25 mm Hg) behandelen stapsgewijs als volgt kort verhogen FiO 2 met 1-5% zoutoplossing bolus (10 ml / kg), infusie van dopamine (5-20 ug / kg / min), en infusie van noradrenaline (20 ng-1 ug / kg / min).
- In het geval van de toevallen blijvende> 10 min (clonische, tonic or myoclonische aanvallen, meestal focale of zoals aangegeven door de plotselinge veranderingen in aEEG amplitude) te behandelen stapsgewijs met (waardoor 30 minuten voordat u verder gaat met de volgende injectie): langzame bolus van fenobarbital iv 20 mg / kg, herhaal fenobarbital iv 20 mg / kg, en iv midazolam 0,5 mg / kg.
- Als aanvallen ontwikkelen en zijn reageert niet op therapie euthanasie wordt aangegeven.
Figuur 5. hypoxie-ischemie stroomschema. Flowchart toont aanpassingen in oxygenatie (F i O 2 en P aw) volgens aEEG reactie. De gemiddelde luchtwegdruk (P aw) werd aangepast door het veranderen van PIP / TV (onderste PIP geeft lagere P aw) en de ademhalingsfrequentie (lagere RR geeft lagere P aw). Target aEEG = bovenste marge van trace <5 mV en een lagere marge van trace> 3 mV (gemiddeld 4 mV). Doelwithartslag (HR) => 80. Target gemiddelde arteriële bloeddruk (MABP) = MABP> 25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. 72 hr overleving
- Bewaak de big nauw na de hypoxische belediging, en geleidelijk verminderen van de tarieven van de infusie van propofol en fentanyl. Extuberen op het punt waar de dieren vrijwillig ademt.
- Tijdens de overleving periode, houden biggen op een dier faciliteit met 24 hr horloge door personeel getraind in intensive care en monitoring. Dien iv glucose infusies 20 ml / kg 2-3 per uur. Op 26-48 uur na hypoxie-ischemie gedeeltelijke flesvoeding kan worden ingeleid. Streven naar de luchtpijp en de longen kan gebeuren door flesvoeding als de gag reflex is niet aanwezig.
- Indien het experiment betrokken, evalueren neurologische status aan de hand scoresysteem ontwikkeld Thoresen et al., Beschrevendetail in de oorspronkelijke publicatie 17.
7. Resultaat Evaluatie
- Na 72 uur, verdoven en ventileren weer zoals beschreven in paragraaf 2 en 3. Voer MRI-scan met relevante beeldvormende modaliteiten zoals beschreven door Munkeby et al 31 en anderen 2.
- Aan het eind van het experiment euthanize biggen met een letale dosis van pentobarbital (5 g / kg iv).
- Bereid de hersenen voor de behandeling afhankelijk van de doelstelling van het experiment.
- Voor hersenen histologie op formaline gefixeerd weefsel:.. Gebruiken cardiale perfusie met 4% paraformaldehyde in PBS, gevolgd door dissectie en post-fixing in paraformaldehyde zoals beschreven door Robertson et al 2, Chakkarapani et al 1 of Liu et al 18 of verwijder de hersenen en onder te dompelen in 4% paraformaldehyde zoals is beschreven door Andresen et al. 32
- Voor analyse vereisen snap-ingevroren weefsel (bv RNAanalyse of enzymactiviteit assays 33). Verwijder de hersenen, ontleden uit hersengebieden van belang en snap-vries weefsel blokken van maximaal 1 cm x 1 cm in vloeibare stikstof zoals beschreven door Munkeby et al 33
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De effecten van hypoxie-ischemie van de hersenen die tijdens de geïnduceerde insult worden gedocumenteerd door het opnemen AEEG trace. Een representatieve aEEG trace is getoond in figuur 6.
Figuur 6. Vertegenwoordiger aEEG spoor. Lage amplitude vanwege hypoxie-ischemie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De extreme waarden van pH, base overschot, en lactaat tijdens hypoxie worden opgenomen, samen met de hartslag en bloeddruk. Klinische neurologie scoring wordt uitgevoerd 17. Gegevens uit een proefdier met een duur van 38 min van lage amplitude aEEG en een insult leidt tot HIE met lage pH en relatieve hypotensie, zijn weergegeven in tabel 1.
| aEEG <7uV (min) | pH laag tijdens belediging | Base overtollige laag tijdens belediging | Lactaat hoog tijdens belediging | MABP basislijn | MABP hoog | MABP laag | HR hoog | HR laag |
| 37.5 | 6.93 | -19,80 | 19 | 48 | 72 | 33 | 219 | 162 |
Tabel 1. Vertegenwoordiger fysiologische data. Voor een biggetje met 38 min van aEEG <7 mV de extreme waarden van de pH, base overschot, lactaat, hartslag (HR) en de bloeddruk (MABP) binnen de 45 minuten van hypoxie worden vermeld.
MRI bij 72 uur kan letsel tonen afhankelijk van de modaliteiten. Figuur 7 toont een T2-gewogen MRI-beeld met hypoxisch-ischemisch letsel.
Figuur 7. Representatieve T2-gewogen MRI-afbeelding. T2-wighted afbeelding in axiale vlak, 72 uur na hypoxie-ischemie. Normaal signaal intensiteit binnen het mesencephalon, pons en verlengde merg. Diffuse abnormale intensiteit van het signaal gedurende de witte stof in beide halfronden. De T2-gewogen MRI toont laesies die overeenkomt met ischemische infarct te verspreiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
H & E kleuring toont neuronale schade zoals te zien op hematoxyline en eosine kleuring. Verschillende groepen hebben diverse scoren systemen voor het kwantificeren van de mate van histologische letsel op ofwel een 0,5 interval schaal van 0-4 17 of een schaal van 0-9 voor 5 verschillende gebieden van de hersenen met een maximum blessure score van 45 13 gepubliceerd.
Lichte microscoop afbeelding met hematoxyline en eosine kleuring Figuur 8. Vertegenwoordiger histopathologie.. Beschadigde neuronen zijn eosinofiele met een kleine kern (pijlen). Het beeld werd gevangen bij 200x vergroting. Schaal bar = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De verwachte uitkomst van model: eerder gepubliceerde studies met vergelijkbare modellen resulteerde in ongeveer 20% dode biggen, 10% zonder schade en 70% overlevende met hersenletsel 19. Deze studies correleren goed met onze bevindingen. Multi orgaanschade manifesteert door 1) lactaat acidose 2) anurie (nierschade) 3) hypotensie (ischemische letsel) en kan worden gecontroleerd door visuele inspectie en histopathologie van organen post mortem. In dit model, hartdisfunctieis aangetoond door toename van de cardiale troponine T en ischemische laesies op hartonderzoek 18. Klinische verschijnselen van encefalopathie kan worden gekwantificeerd door neurologische scoren en omvatten veranderingen in de ademhaling, bewustzijn, oriëntatie, wandelen, toon, activiteitenniveau, zuigen, vocalisatie en de aanwezigheid van pathologische bewegingen zoals beschreven door anderen 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege de complexiteit, de beschreven model kan alleen worden in faciliteiten geaccrediteerd geïmplementeerd en ervaren in dierproeven. Goedkeuring door de lokale ethische commissies moet worden verkregen vóór het begin van de experimenten, en optimale welzijn van dieren moet worden gewaarborgd op alle tijden. Aangezien het model is gebaseerd op de overleving van de proefdieren, is het belangrijk dat een steriele omgeving tijdens invasieve procedures om infecties te voorkomen wordt gehandhaafd.
De keuze van anesthesie is belangrijk omdat de meeste, zo niet alle anesthetica potentie hebben neuroprotectieve eigenschappen. Verschillen in resultaten tussen eerder gepubliceerde modellen kan het gevolg zijn gedeeltelijk verschillen in anesthesie toegepast zoals halothaan en propofol 17,19. Dit is een punt dat zelden aangestipt in de literatuur, anesthesie niet worden weggelaten en er een gebrek aan gegevens die gelden voor dit model zou zijn. Onze pragmatische aanpak is om te gebruiken als enkele different anesthetica mogelijk, dat is sevofluraan wordt slechts kort gebruikt en vervolgens op propofol en fentanyl continu infuus. In onze experimenten medicatie bolussen van invloed op de aEEG tijdelijk, tijdens een verblijf binnen de aangegeven grenzen voor continue infusie niet. Bij het testen van neuroprotectieve behandelingen partijdigheid wordt vermeden door het gebruik van een gerandomiseerde trial design.
De meest cruciale stap in het model oprichting van de hypoxische-ischemie, als het primaire doel is om een matige tot ernstige hypoxisch-ischemische insult terwijl tegelijkertijd waarborgen dieroverleving induceren. De unieke kwaliteit van dit HIE model is de mogelijkheid om de verschillende biologische responsen op hypoxie plaats van dier naar dier. Titratie van de zuurstofafgifte aan de hoogst mogelijke fractie resulteert in een depressieve aEEG (<7 mV), zodat de regeling volgens elk afzonderlijk piglet's tolerantie voor hypoxie, waardoor een hoog overlevingspercentage combinatie met maximum neurologische letsel 19. De duur van vlakke tracé aEEG tijdens de 45 min hypoxie moet worden vergeleken met de mate van histopathologische schade voor de beoordeling en optimalisering van letselernst. Andere onderzoekers het model zijn eveneens ingedeeld de hypoxische-ischemie van mild tot ernstig afhankelijk van de duur van aEEG onderdrukking. Zoals aanvallen bij dit model zijn eerder blijkt te correleren met de ernst van hersenletsel op histopathologie 17 met weinig behandeling potentieel, raden we een niveau van hypoxie-ischemie ernst niet produceren aanvallen.
De meeste studies met behulp van de biggen HIE model onder 10 min van lage MABP (MABP <70% van de uitgangswaarde) 19. Björkman et al. dat indien zuurstofafgifte varieerde in hypoxie, de mate van hersenletsel was onafhankelijk van de tijdsduur MABP werd dan 35 mm Hg 19. Pilot experimenten uitgevoerd bij de vaststelling van het huidige HIE model, bleek dat sustained hypotensie waarbij MABP was lager dan 25 mm Hg werd in verband gebracht met ernstig hersenletsel en permanent vlak tracé aEEG. Aldus moet onmiddellijke reactie op ernstige hypotensie worden gegarandeerd uitgebreide hersenischemie gevolgd door hersendood voorkomen.
De posthypoxische periode is ook kritisch. Veel eerdere studies hebben proefdieren zuurstof voorzien met behulp van 100% zuurstof, waarvan bekend is dat hersenletsel verergeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Warm-touch-pediatric blanket | Covidien | 5030840 | |
| Adhesive Apertrue Drape | Barrier | 915447 | |
| Utility Drape (sterile) 75x80 cm | Barrier | 800530 | |
| Neoflon | BD - Luer | 391350 | |
| Laryngoscope | Miller | 85-0045 | |
| Endotracheal tube 2.5 mm | Covidien | 111-25 | |
| Endotracheal tube 3.0 mm with cuff | Unomedical | MM61110030 | |
| Endotracheal tube 3.5 mm with cuff | Unomedical | MM61110035 | |
| Anesthesia machine | GE Healthcare | 1009-9002-000 | |
| EEG - electrodes/disposable subdermal needle electrode | Cephalon | ACCE120550 | |
| ECG - electrodes | medtronic | 3010107-003 | |
| ECG-electrodes for MR | philips | ACCE120550 | |
| Arterial blood sampler - aspirator | Radiometer medical ApS | 956552 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch) | Covidien | 8888160341 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch) | Covidien | 8888160333 | |
| Suture set (size 3-0) | Covidien | 8886 623341 | |
| BD Spinal needle 0.7x38mm | BD needles | 405254 | |
| Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen | Air Liquide | made on order | |
| NeuroMonitor (CFM) system | Natus Medical Incorporated | OBM70002 |
References
- Chakkarapani, E., et al. Xenon enhances hypothermic neuroprotection in asphyxiated newborn pigs. Annals of. 68, 330-341 (2010).
- Robertson, N. J., et al. Melatonin augments hypothermic neuroprotection in a perinatal asphyxia model. Brain : a journal of neurology. 136, 90-105 (2013).
- Lawn, J. E., et al. Every Newborn: progress, priorities, and potential beyond survival. Lancet. 384, 189-205 (2014).
- Lee, A. C., et al. Intrapartum-related neonatal encephalopathy incidence and impairment at regional and global levels for 2010 with trends from 1990. Pediatric research. 74, Suppl 1. 50-72 (2013).
- Kurinczuk, J. J., White-Koning, M., Badawi, N. Epidemiology of neonatal encephalopathy and hypoxic-ischaemic encephalopathy. Early human development. 86, 329-338 (2010).
- Shankaran, S., Woldt, E., Koepke, T., Bedard, M. P., Nandyal, R. Acute neonatal morbidity and long-term central nervous system sequelae of perinatal asphyxia in term infants. Early human development. 25, 135-148 (1991).
- Robertson, C. M., Finer, N. N., Grace, M. G. School performance of survivors of neonatal encephalopathy associated with birth asphyxia at term. The Journal of pediatrics. 114, 753-760 (1989).
- Bennet, L., Booth, L., Gunn, A. J. Potential biomarkers for hypoxic-ischemic encephalopathy. Seminars in feta., & neonatal medicine. 15, 253-260 (2010).
- Yager, J. Y., Ashwal, S. Animal models of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Pediatric neurology. 40, 156-167 (2009).
- Buckley, N. M. Maturation of circulatory system in three mammalian models of human development. Comparative biochemistry and physiology. A, Comparative. 83, 1-7 (1986).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early human development. 3, 79-83 (1979).
- Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Archives of disease in childhood. 48, 757-767 (1973).
- Foster, K. A., et al. An improved survival model of hypoxia/ischaemia in the piglet suitable for neuroprotection studies. Brain research. 919, 122-131 (2001).
- LeBlanc, M. H., Li, X. Q., Huang, M., Patel, D. M., Smith, E. E. AMPA antagonist LY293558 does not affect the severity of hypoxic-ischemic injury in newborn pigs. Stroke; a journal of cerebral circulation. 26, 1908-1914 (1995).
- Andresen, J. H., et al. Nicotine affects the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the hippocampus of hypoxic newborn piglets. J Perinat Med. 37, 553-560 (2009).
- Cheung, P. Y., Gill, R. S., Bigam, D. L. A swine model of neonatal asphyxia. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Thoresen, M., et al. A piglet survival model of posthypoxic encephalopathy. Pediatric research. 40, 738-748 (1996).
- Liu, X., Tooley, J., Loberg, E. M., Suleiman, M. S., Thoresen, M. Immediate hypothermia reduces cardiac troponin I after hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn pigs. Pediatric research. 70, 352-356 (2011).
- Bjorkman, S. T., et al. Hypoxic/Ischemic models in newborn piglet: comparison of constant FiO2 versus variable FiO2 delivery. Brain research. 1100, 110-117 (2006).
- Robertson, N. J., et al. Which neuroprotective agents are ready for bench to bedside translation in the newborn infant. The Journal of pediatrics. 160, 544-552 (2012).
- Jacobs, S. E., et al. Cooling for newborns with hypoxic ischaemic encephalopathy. Cochrane Database Syst Rev. 1, CD003311 (2013).
- Andresen, J. H., et al. Resuscitation with 21 or 100% oxygen in hypoxic nicotine-pretreated newborn piglets: possible neuroprotective effects of nicotine. Neonatology. 93, 36-44 (2008).
- Karlsson, M., et al. Delayed hypothermia as selective head cooling or whole body cooling does not protect brain or body in newborn pig subjected to hypoxia-ischemia. Pediatric research. 64, 74-78 (2008).
- Kovacs, J., et al. Asphyxia-induced release of alpha-melanocyte-stimulating hormone in newborn pigs. Peptides. 22, 1049-1053 (2001).
- Varvarousi, G., et al. Asphyxial cardiac arrest, resuscitation and neurological outcome in a Landrace/Large-White swine model. Laboratory animals. 45, 184-190 (2011).
- Tammela, O., Pastuszko, A., Lajevardi, N. S., Delivoria-Papadopoulos, M., Wilson, D. F. Activity of tyrosine hydroxylase in the striatum of newborn piglets in response to hypocapnic hypoxia. Journal of neurochemistry. 60, 1399-1406 (1993).
- Cote, A., Barter, J., Meehan, B. Age-dependent metabolic effects of repeated hypoxemia in piglets. Canadian journal of physiology and pharmacology. 78, 321-328 (2000).
- Tichauer, K. M., et al. Assessing the severity of perinatal hypoxia-ischemia in piglets using near-infrared spectroscopy to measure the cerebral metabolic rate of oxygen. Pediatric research. 65, 301-306 (2009).
- Jasani, M. S., Salzman, S. K., Tice, L. L., Ginn, A., Nadkarni, V. M. Anesthetic regimen effects on a pediatric porcine model of asphyxial arrest. Resuscitation. 35, 69-75 (1997).
- Chakkarapani, E., Thoresen, M., Liu, X., Walloe, L., Dingley, J. Xenon offers stable haemodynamics independent of induced hypothermia after hypoxia-ischaemia in newborn pigs. Intensive care medicine. 38, 316-323 (2012).
- Munkeby, B. H., et al. A piglet model for detection of hypoxic-ischemic brain injury with magnetic resonance imaging. Acta radiologica. 49, 1049-1057 (2008).
- Andresen, J. H., et al. Newborn piglets exposed to hypoxia after nicotine or saline pretreatment: long-term effects on brain and heart. J Matern Fetal Neonatal Med. 22, 161-168 (2009).
- Munkeby, B. H., et al. Resuscitation with 100% O2 increases cerebral injury in hypoxemic piglets. Pediatric research. 56, 783-790 (2004).
