Le cause della degenerazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo durante il morbo di Parkinson non sono completamente comprese. I sistemi di coltura cellulare forniscono uno strumento essenziale per lo studio delle proprietà neurofisiologiche di questi neuroni. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato, che può essere utilizzato per la modellazione in vitro della neurodegenerazione.
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Articolo metodologico
Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori
In questo articolo
Sommario
Abstract
La degenerazione dei neuroni dopaminergici mesencefalici (mesDA) è il segno patologico della malattia di Parkinson. Lo studio dei processi biologici coinvolti nelle funzioni fisiologiche e nella vulnerabilità e morte di questi neuroni è utile per comprendere le cause sottostanti e svelare la cura per questa comune malattia neurodegenerativa. Le colture primarie di neuroni mesDA forniscono uno strumento per lo studio delle proprietà molecolari, biochimiche ed elettrofisiologiche, al fine di comprendere lo sviluppo, la sopravvivenza a lungo termine e la degenerazione di questi neuroni durante il decorso della malattia. Qui presentiamo un metodo dettagliato per l'isolamento, la coltura e il mantenimento di neuroni dopaminergici mesencefalici da embrioni di topo E12.5 (o di ratto E14.5). Le condizioni ottimizzate della coltura cellulare in questo protocollo determinano la presenza di proiezioni assonali e dendritiche, connessioni sinaptiche e altre proprietà morfologiche neuronali, che rendono le colture adatte allo studio delle caratteristiche fisiologiche, biologiche cellulari e molecolari di questa popolazione neuronale.
Introduzione
La perdita di neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta conduce ai sintomi motori cardinali della malattia di Parkinson (PD), la seconda malattia neurodegenerativa più diffusa. La causa della morte di questa popolazione neuronale mesencefalica non è nota. Per studiare i meccanismi biochimici responsabili dello sviluppo e modulando le proprietà neurofisiologiche e la sopravvivenza dei neuroni mesDA, diverse colture cellulari e sistemi modello animali sono stati utilizzati. Linee cellulari immortalizzate, compreso il ratto dopaminergica linea cellulare 1RB 3 AN 27 (N27), il dopaminergico umano linea cellulare di neuroblastoma SH-S....
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Protocollo
NOTA: Gli animali sono stati mantenuti e gestiti in conformità con le linee guida istituzionali e tutte le procedure di animali sono stati approvati dal benessere degli animali del Imperial College e Ethical Review Body (AWERB) e il Ministero degli Interni e la Harvard University Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC), in conformità alle normative federali e statali.
1. reagente e installazione attrezzature
- Thaw, aliquota e conservare 1 mg / ml soluzione laminina a -80 ° C. Sciogliere 2 microlitri in 1 ml DMEM / F12, ottenendo una concentrazione di rivestimento di 1-2 mg / cm 2.
NOTA: Thaw laminin....
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Risultati
Immunoistochimica contro tirosina idrossilasi (TH) mostra che tra 0,5-1% delle cellule in coltura sono dopaminergica. Proiezioni neuronali sembrano in 2 ore dopo la placcatura e il primo giorno, assoni e dendriti sono distinguibili (figura 2), utilizzando la tirosina idrossilasi (TH) e proteina 2 (Map2) anticorpi associata ai microtubuli (Figura 3). I neuroni sopravvivono per più di sei settimane e mostrano un'ampia conseguenza. Il rapporto neurone-glia nelle colture è direttamente .......
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Discussione
Neuroni dopaminergici nel mesencefalo sono la principale fonte di dopamina nel sistema nervoso centrale. Sono divisi in tre gruppi, pars compacta della sostanza nera (SNPC), area ventrale tegmentale (VTA) e campo retrorubral (RRF) 10, 11. I neuroni in SNPC e VTA danno luogo a grandi vie dopaminergiche, mesocorticali, mesolimbico e nigrostriatale, coinvolte in funzioni come il controllo delle emozioni, la motivazione e il comportamento del motore. Scomparsa dei neuroni in SNPC e disgregazione funzionale del si.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato svolto utilizzando i fondi della Divisione di Scienze del Cervello, Dipartimento di Medicina, Imperial College di Londra a K.N.A.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Miscela di nutrienti medi Eagle modificata di Dulbecco, F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (1X), siero bovino fetale liquido | Invitrogen | 24020-117 | |
| , inattivato termicamente (FBS), | Invitrogen | 16140 | |
| N2 (100X), liquido | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-glucosio soluzione (45% (wt/vol) in acqua | Sigma | G8769 | |
| Albumina sierica bovina BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminina da membrana basale del sarcoma murino di Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma | L2020 | |
| Penicillina/streptomicina | Invitrogen | 15070 | |
| Tripsina (0,05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Siero bovino coltura cellulare di albumina (BSA) testata | Sigma | A9418 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anticorpo anti-tirosina idrossilasi (Th) | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poli-L-ornitina, soluzione allo 0,01% | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (proteina associata ai microtubuli-2A e -2B) anticorpo | Millipore | MAB3418 | |
| Anticorpo anti-sinapsina-1 | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio IgG anticorpo | Sonde molecolari | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 asino anti-coniglio IgG anticorpi | Sonde molecolari | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 asino anti-pecora IgG anticorpo | Sonde molecolari | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 asino anti-pecora IgG anticorpi | Sonde molecolari | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 asino anti-topo IgG anticorpi | Sonde molecolari | A-21203 | |
| Soluzione di blu di tripano (0,4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereomicroscopio | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Microscopio a contrasto di fase invertito | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forcipe | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Pinze antiscivolo – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Due pinze Dumont #45 – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Portalama/Deruttore Impugnatura piatta - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Forbici per iride per studenti - Dritta 11,5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Illuminatore alogeno in fibra ottica | Nikon | MKII | |
| Monouso in vetro borosilicato Pasteur Pipette | Fisherbrand | Emocitometro 13-678-20C | |
| Proscitech | SVZ2NIOU | ||
| 0,2 &; m unità filtranti sterili | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| piastre di Petri 100x20 mm | BD Biosciences | 351005 | |
| Tondo Cover Slip #1 Spessore Vetro tedesco 12 mm | Vetro Bellco | 1943-10012 |
Riferimenti
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P.
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Ristampe e permessi
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