Introduction
Fodret epitelet i mag-tarmkanalen är i ständig förnyelse. Denna process utlöses av proliferation av tarm stamceller (ISCs) som kontinuerligt producerar avkomma att snabbt byta tarmepitelet som det visar över. Den proliferativa avdelning som innefattar de ISCs begränsas till botten av kryptor. De ISCs ger upphov till avkomma som så småningom differentiera till absorberande eller sekretoriska härstamningar. Utflyttning av kryptan och på villus eller ytepitelet, celler differentierar progressivt när de vandrar uppåt innan exfoliering in i lumen 1. ISCs ger upphov till alla intestinala epiteliala celltyper inklusive enterocyter, microfold celler, enteroendocrine celler, bägarceller, tuftade celler och Paneth celler. Kolon präglas av långsträckta kryptor består mestadels av kolonocyter och gobletceller, med spridda enteroendocrine och tuftade celler 2.
Ex vivo cultida system utgör lovande verktyg för att studera ISC underhåll och tarmvävnad homeostas. Det är dock svårt att förlita sig på vävnadsteknik odlings som fysiologiska förhållanden inte är fullt reproduceras och epiteliala mikromiljö ofta förändras 3,4. En stort framsteg i ISC fältet var inrättandet av vävnadsodlingstekniker för att bibehålla och utöka individuella murina ISCs använder definierade tillväxtfaktorerna för att ersätta den normala tarmnischsignaler. Långsiktiga odlingsbetingelser beskrevs av Sato et al., Där enstaka kryptor eller isolerade stamceller från tarmepitelet växa för att bilda 3-dimension epiteliala strukturer inklusive flera crypt-liknande domäner 5-7. Dessa tredimensionella strukturer genomgår klyvningshändelser att kontinuerligt expandera. Intressant är alla tarmcelltyper som är specifika för vävnaden ursprungs produceras och som är väl strängsprutas till en lumen 8. Använda modifieringar av detta system, epitelialorganoids kan genereras från magsäcken, tunntarmen och tjocktarmen. Mer specifikt, epiteliala organoids från tunntarmen är enteroids 9, och de från kolon är colonoids 9,10. Dessa epiteliala organoid kultursystem har använts för att testa förmågan hos isolerade enstaka celler för att fungera som stamceller in vitro, sålunda testa "stemness" av isolerade celler 5,6,10-15. Andra forskare har använt både enteroids och colonoids att studera funktionen hos individuella epitelceller 16-21. Sålunda kan enteroid och colonoid kulturer användas för att utvärdera både stam- och icke-stamcell funktioner och ge nya insikter i grundläggande cellulära interaktioner inom tarmarna.
Under 2011, Sato och kollegor genererade långtidsodling av epiteliala organoids härrör från människans tunntarm och tjocktarm 22,23. Förutom skillnader i mediesammansättning, mänskliga epitelceller enteroidsoch colonoids uppvisar samma funktioner som sin murina motsvarighet. Vidare kan de genereras från sjuka vävnader såsom Barretts esofagus, adenom eller adenokarcinom, och cystisk fibros 22,24. Mänskliga enteroids utgör ett värdefullt system för att studera tarmstamcells och epitelial mucosal biologi och fungera som ett nytt experimentellt system för att studera både normal och onormal Gastrointestinalfysiologi 3.
Här beskriver vi metoder för att etablera enteroids och colonoids från human tunntarm och kolon kryptor (Figur 1). I detta metod översyn, betonar vi kryptan samling från hela vävnad och biopsier. Vi sammanfatta kulturformer som är väsentliga för framgångsrik tillväxt och underhåll av mänskliga enteroids och colonoids och möjliga experimentella strategier som genomförs av den här modellen.
Protocol
OBS: Etik Uttalande: Alla experiment med mänskliga vävnader beskrivs häri godkändes av en IRB vid CCHMC (IRK # 2012-2858; # 2014-0427). Informerat samtycke för vävnads insamling, lagring och användning av proverna erhölls från givare på CCHMC.
1. Förberedelse för kultur
NOTERA: Alla reagenser är listade i tabell 1.
- Bered EDTA stamlösning enligt följande: förbereda 0,5 M etylendiamintetraättiksyra, pH 8 (EDTA) i ultrarent H2O, filtersteriliserades med 0,22 pm filter. Eventuellt lagra EDTA stamlösning vid RT under obegränsad tid.
- Bered kelatbildande buffert följande sätt: Blanda 2% sorbitol, en% sackaros, 1% bovint serumalbumin fraktion V (BSA) och 1x Gentamicin / Amphotericin lösning i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning utan Ca2 + och Mg2 + (DPBS), filtersteriliserades med 0,22 ìm filter. Förbered kelatbildande buffer fräsch.
- Förbered Wnt-3A-medium enligt följande: Wnt-3A-medium görs i huset med hjälp av cellinje L Wnt-3A enligt tillverkarens anvisningar (ATCC, CRL-2647). Komplettera mediet med 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 g / ml streptomycin, 1 N2 supplement, ett B27-tillägg, 1% BSA och filtersteriliserades med 0,22 ^ m filter.
OBS: Testa varje sats för Wnt aktivitet med hjälp av en TOPflash analys. Använd en stabil HEK293 TOPflash cellinje (Hans Clevers lab) med en Renilla luciferasanalysen kit enligt tillverkarens anvisningar. Normalisera TOPflash analysen med 100 ng / ml human rekombinant Wnt-3A. Bekräfta minst en 10 faldsförändring aktiviteten av det konditionerade mediet jämfört med kontroll. Dividera färsk Wnt-3A-konditionerat medium i 10 ml alikvoter i 15 ml koniska rör och frys vid -20 ° C i upp till 6 månader. Store tinade portioner upp till 5 dagar vid 4 ° C utan förlust av aktivitet. - Prepare humant minigut mediet enligt följande: Tillägg Avancerad DMEM / F12-medium med 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 g / ml streptomycin, 1 N2 supplement, ett B27-tillägg, 1% BSA och filtersteriliseras med 0,22 pm filter.
OBS: Dela färsk human minigut medium in 10 ml alikvoter i 15 ml koniska rör och frys vid -20 ° C i upp till 3 månader. Store tinade portioner upp till 5 dagar vid 4 ° C utan förlust av aktivitet. - Förbered fullständiga humana minigut mediet enligt följande: Bered färsk före crypt kultur eller mediumbyte humant minigut medium (se 1,4) kompletterat med 50% Wnt-3A-konditionerat medium (se 1,3), 1 | ig / ml R-spondin 1 (1: 1000 spädning av 1 mg / ml lager), 100 ng / ml Noggin (1: 1000 spädning av 100 g / ml lager), 50 ng / ml EGF (1: 10000 utspädning av 500 | ig / ml lager), 500 nM A-83 -01 (1: 1000 utspädning av 500 M lager), 10 ^ M SB202190 (1: 3000 utspädning av 30 mM lager), 10 nM [Leu] 15-Gastrin 1 (1: 10000 utspädning av 100 iMlager), 10 mM nikotinamid (1: 100 spädning av 1 M stam) och 1 mM N-acetylcystein (1: 1000 spädning av 1 M stam).
OBS: Förvara kompletta humana minigut media upp till 2 dagar vid 4 ° C utan förlust av aktivitet.
2. Crypt Isolering från Whole Tissue
OBS: Från vävnaden samlingen, är det viktigt att hålla provet i saltlösning. Det rekommenderas att hålla vävnaden på is under transporten. Beredning av provet för isolering av kryptan bör utföras så snart som möjligt.
NOTERA: Alla reagenser är listade i tabell 1, verktyg, utrustning och förbrukningsvaror är listade i Tabell 2.
- Förbered alla reagenser innan experimentet. Tina basalmembranmatrisen på is och pre-inkuberas en 24-brunnsplatta i en CO2 inkubator vid 37 ° C.
OBS: Alternativt göra ett tunt skikt av basalmembranmatris med användning av 15 | il / brunn i centrum av en 24-Ja plattan och placera den i en CO2 inkubator vid 37 ° C. Denna fakultativt steg håller basalmembranet matrisen som en droppe under polymerisation. - Tvätta vävnaden med iskall Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning utan Ca2 + och Mg2 + (DPBS). Fortsätt tills innehållet DPBS är tydlig.
- Använda 0,2 mm stift diameter minutien, säkra vävnaden på en silikonbelagd glaspetriskål fylld med iskall DPBS. Sträck och nåla vävnaden platt med mucosal sidan uppåt.
- Enligt en dissekera mikroskop, ta bort den överliggande slemhinnan från submukosa och bindväv använder mikro dissekera sax och fin spets böjd pincett (Figur 2A, B).
- Sträck och nåla dissekerade slemhinnan platt på silikonbelagda glas petriskål med mucosal sidan uppåt. Resterande submukosa och bindväv kan kastas eller användas för ytterligare experiment (figur 2C).
- Försiktigtskrapa ytan av slemhinnan med böjda pincett. Detta steg är nödvändigt för att förbättra kvaliteten på beredningen.
- För tunntarmen, försiktigt skrapa slemhinnan för att ta bort villi.
- För kolon, försiktigt skrapa slemhinnan för att avlägsna slem och skräp.
- Tvätta slemhinnan 3-4 gånger med iskall chela buffert för att avlägsna villi och skräp.
- Täck slemhinnan med nygjord 2 mM EDTA kelering buffert (200 pl 0,5 M EDTA i 49,6 ml kelering buffert).
- Placera petriskål på is och skaka försiktigt i 30 minuter på en horisontell orbitalskak.
- Tvätta vävnaden 3-4 gånger med iskall kelering buffert utan EDTA. Efter tvätt, lämna slemhinnan i iskall kelering buffert.
- Process slemhinnan under ett dissekera mikroskop med hjälp böjda och fin pincett. Skrapa försiktigt slemhinnan att släppa tarm kryptor med hjälp av böjda pincett.
- Ta försiktigt bort kryptan avstängning från petriskål med en piPette och överföra den till en 50 ml koniska rör.
OBS: Kontrollera vävnaden för att se till att nästan alla kryptor har tagits bort från slemhinnan. - Filtrera den kryptor suspensionen genom ett 150 | im mesh två gånger.
OBS: Kontrollera genomströmning för crypt anrikning under ett mikroskop (Figur 2D). - Centrifugera kryptan suspensionen 5 min vid 50 xg, 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Suspendera pelleten i 5 ml iskall kelering buffert.
- Räkna antalet kryptor per 10-l droppe från suspensionen från steg 2,15. Överför antalet kryptor som behövs för plätering av en 5 ml rundbottnad röret. Använd 200-500 kryptor per brunn i en 24-brunnsskål för att upprätta enteroids eller colonoids.
- Centrifugera kryptan fraktionen i 10 min vid 150 g, 4 ° C. Avlägsna supernatanten.
- Använd kryptor för efterföljande kultur.
3. Crypt Isolering från Biopsi
- Förbered alla reagenser förebörjan av experimentet. Tina basalmembranmatrisen på is och pre-inkuberas en 24-brunnsplatta i en CO2 inkubator vid 37 ° C.
- Tvätta biopsi med iskall Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning utan Ca2 + och Mg2 + (DPBS).
- Använda 0,1 mm stift diameter minutien, säkra biopsi på en silikonbelagd glaspetriskål fylld med iskall DPBS. Sträck och nåla slemhinnan platta med mucosal sidan uppåt (Figur 2E).
- Skrapa försiktigt av ytan på slemhinnan med böjda pincett för att ta bort villi och skräp. Detta steg är nödvändigt för att förbättra kvaliteten på beredningen.
- Tvätta biopsin 3-4 gånger med iskall chela buffert för att avlägsna villi och skräp.
- Täck biopsi med nygjord 2 mM EDTA kelering buffert (200 pl 0,5 M EDTA i 49,8 ml kelering buffert).
- Placera petriskål på is och skaka försiktigt i 30 minuter på en horisontell orbitalskak. <li> Tvätta biopsi 3-4 gånger med iskall kelering buffert utan EDTA. Efter tvätt, lämna biopsi i iskall kelering buffert.
- Process biopsin under ett dissekera mikroskop med hjälp böjda och fin pincett. Skrapa försiktigt slemhinnan att släppa tarm kryptor använder böjda pincett.
- Ta försiktigt bort kryptan avstängning från petriskålen med hjälp av en pipett och överföra den till en 50 ml koniska rör.
OBS: Kontrollera vävnaden för att se till att nästan alla kryptor har tagits bort från slemhinnan. - Filtrera kryptan suspensionen genom en 150 pm nylonnät 2 gånger.
OBS: Kontrollera genomströmning för crypt anrikning under ett mikroskop. - Centrifugera kryptan suspensionen 5 min vid 50 xg, 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Suspendera pelleten i 1 ml iskall kelering buffert. Överför kryptan suspension till ett 1,5 ml mikrofugrör.
- Centrifugera kryptan fraktionen i 10 min vid 150 xg, 4 ° C. Avlägsna supernatanten. </ Li>
- Använd kryptor för efterföljande kultur.
4. Crypt kultur i Basement Membrane Matrix
- Använda pre-kylda pipettspetsar, suspendera kryptan pellet (från steg 2,18 eller 3,15) i basalmembranet matris (200 till 500 kryptor / 50 ^ basalmembranmatris).
- Applicera 50 pl kryptan fjädring i basalmembranet matris per brunn på förvärmda plattan. Långsamt mata ut basalmembranmatrisen i mitten av brunnen.
- Placera 24-brunnar i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator under 30 min för att tillåta en fullständig polymerisation av basalmembranmatrisen.
- Överlägg basalmembranet matris med 500 l av fullständig mänsklig minigut medium kompletterat med 2,5 iM CHIR99021 (1: 4000 utspädning av 10 mM lager) och 2,5 iM Thiazovivin (1: 4000 utspädning av 10 mM lager).
- Inkubera plattan i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Ersätt mediet med färskt fullständigt human minigut medel varje 2 dagar.
5. Passaging av odlade Enteroids och Colonoids.
OBS: Passage Enteroids och Colonoids var 7 till 10 dagar efter första plätering. Generellt dela en bit in 3 till 4 brunnar.
- Förbered alla reagenser före början av experimentet. Tina basalmembranmatrisen på is och pre-inkuberas en 24-brunnsplatta i en CO2 inkubator vid 37 ° C.
- Ta bort materialet med hjälp sterila tips och overlay med 1 ml iskall DPBS.
- Pipettera och tillbaka med en 1.000 l spets. Överför lösningen i ett nytt 15 ml koniskt rör.
- Tillsätt 2 ml av humant minigut medium kompletterat med 5% FBS per 1 ml medium.
- Centrifugera lösningen under 5 min vid 50 xg, 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Resuspendera pelleten med 2 ml cell dissociation enzym kompletterat med 10 | iM Y-27632 (1: 1000 spädning av 10 mM stam). Inkubera i 5 mi vid 37 ° C i ett vattenbad.
- Dissociera cellklumpar med användning av en 3 ml Luer-Lock-spruta utrustad med en 18-G fyllning / trubbig nål. Pipett försiktigt lösningen fram och tillbaka med hjälp av sprutan 10 gånger.
- Centrifugera suspensionen under 5 minuter vid 500 xg, 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Använda pre-kylda pipettspetsar, resuspendera cellpelleten i basalmembranet matris.
- Applicera 50 pl kryptan fjädring i basalmembranet matris per brunn på förvärmda plattan. Långsamt mata ut basalmembranmatrisen i mitten av brunnen.
- Placera 24-brunnar i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator under 20 min för att tillåta en fullständig polymerisation av basalmembranmatrisen.
- Överlägg av basalmembranmatrisen med 500 ul av fullständiga humana minigut medium kompletterat med 10 | iM Y-27632 (1: 1000 spädning av 10 mM stam).
- Inkubera plattan i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Efter 2 dagar, Ersätta mediet med färskt fullständigt humant minigut medium kompletterat med 10 | iM Y-27632 (1: 1000 spädning av 10 mM stam). Därefter byter medium med färska, fullständig mänsklig minigut mediet varannan dag.
6. Frysning av odlade Enteroids och Colonoids
OBS: Vanligtvis frysa en bra bit in 2-3 cryovials.
- Upprepa steg 5,1-5,8.
- Resuspendera pelleten med kallt frysmedium. Överför 1 ml fryslösning i en märkt cryovial. Placera cryovial i en frysning behållare innehållande 500 ml isopropylalkohol.
- Överför frysning behållaren till en 80 ° C frys under 24 timmar, sedan överföra köldkärlet till lagring flytande kväve.
OBS: Förvara Enteroids och Colonoids för upp till 1 år.
Representative Results
Figur 2D visar ett typiskt exempel på nyligen isolerade kryptor från hela vävnaden (figur 2D). Antalet kryptor isolerade från en biopsi är lägre än i hela vävnaden. Använda standardkapacitet biopsitänger med nål, oftast utför vi två biopsi bites på ett enda pass. Varje biopsi bite resulterar i en 10 mm 2 yta med ett genomsnitt av 50-100 kryptor per biopsi (Figur 2F).
Efter odling i basalmembranmatrix, kryptor runda upp för att bilda enterospheres för tunntarm och colonospheres för kolon. Kryptan spirande sker oftast inom 5 till 6 dagar efter sådd. Men det är inte ovanligt att se antingen enteroids (enteroids) eller colonoids (colonoids) bildar sfärer i källaren membranmatrisen (Figur 3A-C, Film 1). Den passage kan ske efter 7 dagar, beroende på storleken på enteroids. Den enteroids eller colonoids established från biopsier genomgå samma utveckling i kultur. Men som kryptan densitet vid inokulering är lägre, passagemuffen görs vanligen efter 10 till 12 dagar i odling (figur 4a, b). Enteroids och colonoids kulturer expandera på ett reproducerbart sätt.
Både enteroids och colonoids presentera ett luminala sidan och är fodrade med ett epitel (Figur 5A, B). Proliferativa celler kan observeras inom enteroids och ligger inom de knopp tips (Figur 5C, D). Konfokal avbildning av enteroids färgade med E-cadherin (ECAD) visar epitelcellerna (Figur 5E).
Både enteroids och colonoids kan etableras från vävnad erhållen från patienter med genetiska / medfödda störningar. Figur 6 visar representativa enteroids växer från en patient med cystisk fibros (figur 6A) och en tuftning enteropati grund av en medfödd mutation i epitelceller advidhäft- molekyl genen (EpCAM) (Figur 6B). Bredvid genetisk defekt, gör enteroids inte uppvisa skillnader i basal skick.
Figur 1. Arbetsflöde för kryptor dissociation och generering av mänskliga enteroids och colonoids i kultur. Crypts (från människans tunntarm eller kolon) isoleras genom EDTA kelering. Odlade kryptor bildar enteroids för tunntarmen och colonoids för kolon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Dissektion process för krypta isolering. (A) Tunntarmen specimen sträcks och nålas plant i ett silikonbelagt petriskål. (B) Slemhinnan är separerad från den underliggande submucosan. (C) Den dissekerade slemhinnan sträcks och nålas plant i ett silikonbelagt petriskål. (D) Efter EDTA chela är kryptor isoleras från vävnaden. (E) En biopsi sträcks och nålas plant i ett silikonbelagt petriskål. (F) Efter EDTA kelering, kryptor är isolerade från biopsi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Crypt kultur och mänsklig enteroid och colonoid generationen från hela vävnaden. (A) jejunal kryptor pläterade i basalmembranet matris efter isolering. De kryptor stänger upp efter 3-4 timmar och börjar till ballong upp för att bilda enterospheres bortom denna gången. Vid 7 dagar är de jejunala enteroids bildas. (B) Efter isolering och kultur, ileum kryptor beter sig som de jejunala kryptor och bildar ileal enteroids. (C) Kolon kryptor är pläterade i basalmembranet matris efter isolering. Kryptor nära och bildar colonoids efter 7 dagar (Skala barer: 100 pm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Crypt kultur och mänsklig enteroid och colonoid generationen från biopsi. (A) tolvfingertarmen kryptor pläterade i basalmembranet matris efter isolering. De kryptor stänger upp efter 3-4 timmar och börja ballongen upp BEYOnd denna gång för att bilda enterospheres. Vid 7 dagar finns enteroids bildas. (B) Efter isolering och odling, är colonic kryptor plattströks i basalmembranmatrisen. De kryptor nära håll för att bilda colonospheres sedan colonoids efter 7 dagar (Skala barer: 100 pm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Tarm härstamningar av mänskliga enteroids. (A) Mänsklig enteroid efter 6 dagar i kultur. (B) Hematoxylin-eosin sektioner av enteroids i (A) visar epitelbeklädnaden (Skala barer: 100 ^ m). (CD) Confocal avbildning av enteroids efter EDU färgning (magenta) visar närvaron av proliferativa celler. (E Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Crypt kultur och mänsklig enteroid generationen från sjuk vävnad. (A) Enteroids etablerad från en cystisk fibros exemplar. (B) Enteroids etablerats från en medfödd tuftning enteropathy exemplar (Skala barer: 100 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1. Enterosphere bildar mänsklig enteroid i kultur. 32 tim tids varve filmen visar en enterosphere etablerad från människans tunntarm dras för att bilda en enteroid i kultur. Klicka här för att se filmen.
| Namn på reagens | Företag | Katalognummer | Lösningsmedel | Stock Koncentration | Slutkoncentration | Kommentera |
| Dulbeccos fosfatbuffrade salin Ca2 +, Mg2 + fri (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 | - | - | 1x | |
| Etylendiamin tetraättiksyra (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | Ultrarent dH 2 O | 2 mM | ||
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | DPBS | Pulver | 2% | |
| Sackaros | Fischer Scientific | BP220-1 | DPBS | Pulver | 1% | |
| Bovint serumalbumin (BSA) fraktion V | Fischer Scientific | BP1600-100 | DPBS | Pulver | 1% | |
| Gzntamycin / Amfotericin B-lösning | Life technologies; Gibco | R-015-10 | - | 500x | 1x | |
| Wnt-3A conditionned mediet | i hus | - | - | - | - | |
| Avancerad DMEM / F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 | - | - | - | |
| HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 | - | 1 M | 10 mM | |
| GlutaMAX (glutamin) | Life technologies; Gibco | 35050-061 | - | 100X | 1X | |
| Penicillin-streptomycin (10.000 U / ml) | Life technologies; Gibco | 15140-148 | - | 100X | 1X | |
| N2 supplementet | Life technologies; Gibco | 17502-048 | - | 100X | 1X | |
| B27 supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 | - | 50X | 1X | |
| N-acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165-5G | DPBS | 1 M | 1 mm | </ Td> |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | DPBS | 1 M | 10 mM | |
| Matrigel, GFR, Fenol gratis (basalmembranmatris) | Corning | 356231 | - | - | - | NÖDVÄNDIG |
| humant rekombinant noggin | FoU | 6057-NG / CF | DPBS | 100 | ig / ml | 100 ng / ml | Andra leverantörer: FoU; Anaspec och Preprotech |
| human rekombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 | DPBS | 1 mg / ml | 1 ^ g / ml | |
| human rekombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | DBPS | 500 | ig / ml | 50 ng / ml | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | DPBS | 10 mM | 10 | iM | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | DMSO | 500 pM | 500 nM | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | DMSO | 30 mM | 10 | iM | |
| human [Leu] 15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | DPBS | 100 pM | 10 nM | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | DMSO | 10 mM | 2,5 | iM | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | DMSO | 10 mM | 2,5 | iM | |
| TrypLE Express Enzym (1X), fenolrött (cell dissociation enzym) | Life technologies; Gibco | 12605-010 | - | - | - | För passage |
| Fetalt bovint serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 | - | - | - | För passage |
| CTS Synth-a-Freeze Medium (frysmedium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 | - | - | - | För frysning |
| L Wnt-3A cellinje | ATCC | CRL-2647 | - | - | - | Wnt-3A conditionned medieproduktion |
| Renilla luciferasanalys | Promega | E2710 | - | - | - | Wnt-3A conditionned medieverksamhet |
| human rekombinant Wnt-3A | FoU | 5036-WN / CF | DPBS | 100 | ig / ml | 100 ng / ml | |
| HEK293 TOPflash cellinje | - | - | - | - | - | Wnt-3A conditionned medieverksamhet; Gåva från Hans Clevers laboratorium |
Tabell 1. Detaljerad reagens lista med önskad tillverkare och katalognummer.
| Utrustning | Förbruknings | Verktyg |
| Laminärflödeshuv | 15- och 50 ml koniska rör | Dumont # 5 standard pincett (FST; # 11.251-20) |
| CO2-inkubator | Mikrocentrifugrör | Dumont # 7, böjda fin pincett (FST; # 11.274-20) |
| Stereomikroskop | 24-brunnsplattor | Fina sax (FST; # 14.060-09) | 0.22 um filter (Sartorius) | Vannas våren sax (FST; # 15.018-10) |
| Skakapparat | Serologiska pipetter | Stift 0,2 mm diameter minutien (FST; # 26.002-20) |
| Frysning behållare (Nalgene) | Mikropipett tips | Stift 0,1 mm diameter minutien (FST; # 26.002-10) |
| Sylgard 184 Silikon (Dow Corning) | 150 nm mask, nylon screening (Dynamic Aqua-försörjning) | |
| Glas petriskål | 5 ml rundbottnade polypropenrör (Falcon) | |
| Serologisk pipett | 18G trubbig fyll nål (BD) | |
| Mikropipett | 3 ml lsyringes med Luer-Lock Tips (BD) | |
| Cryovials |
Discussion
Denna metod ger ett komplett system återger intestinala epiteliala härstamningar och epiteliala dynamik som utgör ett användbart verktyg för att studera tarm epitelial biologi. Den metod som presenteras här var anpassad från den ursprungliga murina studie av Sato och Clevers 22 som effektivt leder mänskliga enteroids och colonoids. Här, plockade vi manuellt upp kryptor med microdissection att undvika cellulära föroreningar. Denna metod tillåter en direkt visualisering av kryptor och leder till konsekvens övertid jämfört med den ursprungliga kryptan samlingen av "skaka". Andra grupper utvecklat liknande tekniker använder något olika metoder speciellt ersätter kelering med EDTA med kollagenas 25. Förutom skillnaderna i kryptan samling, dessa tekniker använder en definierad media som krävs för att odla mänskliga enteroids i kultur 22. För att öka tillväxteffektivitet vid krypta sådd, vi lägger en GSK3 hämmare (CHIR99021)för de två första dagarna 12.
Hanteringen av vävnaden eller biopsier är viktigt och kryptan isoleringen bör utföras så snart som vävnaden anländer i labbet. Emellertid kunde försenad crypt isolering och odling utföras upp till 24 h efter vävnadsuppsamlings (data visas ej) som tidigare beskrivits för murin vävnad 26. Den tarmvävnad bör placeras i ett koniskt rör helt fylld med DPBS för att undvika störningar vävnad och bör hållas vid 4 ° C. Den fördröjda preparatet möjliggör vävnads sjöfarten men temperaturvariationer bör undvikas under transport. Den totala tid som krävs för den initiala kryptan pläteringen är ca 2 h med 15 till 30 min för att bearbeta vävnaden och 1-2 h för att isolera och plattan kryptan. Den microdissection av vävnaden är en kritisk faktor och predikat i en ren krypta beredning. Dock är det möjligt kryptan frisättningen hand skakar som beskrivs i olika protokoll 22,23.
Trots likheterna med den murina enteroid (enteroids) systemet, de mänskliga enteroids kräver specifika molekyler för att stärka och behålla sin tillväxt över tiden. Tillväxtfaktorerna är EGF, Noggin, R-spondin används på samma sätt som de murina epiteliala organoids. Dock är kritisk användning av Wnt-3A. Vi noterade att bildandet liksom tillväxteffektiviteten är större med användning av en Wnt-3A konditionerat medium än det humana rekombinanta proteinet. Åtföljande vi visat förbättrade odlingsbetingelser med användning av en inhibitor av glykogensyntaskinas 3 (CHIR99021) 12. Rekombinanta tillväxtfaktorer skulle kunna ersättas med Wnt-3A, R-spondin och Noggin rade-media. En Wnt-3A-uttryckande L-cellinje är kommersiellt tillgängliga (ATCC). Andra grupper har utvecklat R-spondin 1- 23,27, Noggin- 19, och Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 uttrycker cellinjer. Två småmolekylära hämmare används i kulturen migdia och är nödvändiga för att upprätthålla kulturen 29. A-83-01 är en selektiv hämmare av transformerande tillväxtfaktor β och Aktivin / Nodal receptorer (aktivin-liknande kinas 4, 5, 7) och SB202190 är en p38 mitogenaktiverat proteinkinas-inhibitor (MAPK). Båda hämmare har använts respektive att upprätthålla mänskliga inducerade pluripotenta stamceller självförnyelse och upprätta mänskliga naiva pluripotenta stamceller 30-32. Också nikotinamid, en föregångare till nikotinamidadenindinukleotid, krävs för att bibehålla enteroids och colonoids expansion i ett långsiktigt sätt 22,29.
Den EDTA kelering är ett viktigt steg eftersom det avgör avkastningen från kryptan preparatet. Vi har varit framgångsrika med 2 mM EDTA-behandling. Däremot kan EDTA koncentrationen ändras från 2 mM till 15 mM angående vilken typ av vävnad. I det fallet har tid för inkubation att bestämmas empiriskt. Efter den inledande plätering, kommer kryptan runda-up och så småningom bildar enteroids. Men de enteroids eller colonoids visar ofta en "stam" fenotyp genom att bilda sfärer med liten eller ingen differentierade celler. I så fall kan differentiering initieras genom att dra tillbaka Wnt-3A, nikotinamid och p38 MAPK hämmare. Användningen av Notch-hämmare såsom DAPT eller DBZ hjälper förbättra differentiering inom enteroids 22.
Denna modell rekapitulerar tarmfysiologi med ständiga crypt-spirande händelser som härrör från en stamcells samt villus-liknande epiteliala domäner som innehåller både absorberande och sekretoriska differentierade härstamningar. Intressant, fungerar detta system innehåller inga mesenkymala celler och använder specifika medier villkor att uppfylla nisch signalkrav.
Liksom den murina modellen kan humana enteroids genereras från isolerade tarmepitelceller för att testa förmågan för dessa celler att fungera som en stamcell. SeveRAL studier har använt kluster av differentieringsmarkörer (CD44, CD24 eller CD166) och EPHB2 positiva celler att anrika celler med stamceller egenskaper 12,23,33. Tillsammans utgör dessa studier visar nyttan av mänskliga enteroids kulturer för att testa stemness. Andra forskare använder denna modell för att undersöka tarmsjukdomar såsom smittdiarrésjukdomar, cystisk fibros eller kolorektal cancer 22,34-37. Dessa studier visar att mänskliga enteroids utgör en tillförlitlig modell mänsklig sjukdom med en möjlighet att gå mot en personlig screening. Mänskliga enteroids kan genetiskt modifierade med hjälp av DNA-transfektion eller infektion med viruspartiklar 38. Detta ger ett kraftfullt verktyg för att studera genspecifika funktioner inom de mänskliga epitelceller organoids eller korrigera genetiska mutationer. Nyligen Schwank och kollegor visade möjligheten att redigera genomet med CRISPR / Cas9 systemet och korrigera mutationen på CFTR genen orsakar acystic fibros 24. Mänskliga enteroids utgör ett värdefullt system för att studera tarmstamcells och epitelial mucosal biologi och fungera som ett nytt experimentellt system för att studera både normal och onormal gastrointestinal fysiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | |
| Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Fischer Scientific | BP1600-100 | |
| Gzntamycin/Amphotericin B solution | Life technologies; Gibco | R-015-10 | |
| Wnt-3A conditioned medium | in house | ||
| Advanced DMEM/F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 | |
| HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 | |
| GlutaMAX (glutamine) | Life technologies; Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies; Gibco | 15140-148 | |
| N2 Supplement | Life technologies; Gibco | 17502-048 | |
| B27 Supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| human recombinant Noggin | R&D | 6057-NG/CF | |
| human recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 | |
| human recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | |
| human [Leu]15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) | Life technologies; Gibco | 12605-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 | |
| CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 | |
| L Wnt-3A cell line | ATCC | CRL-2647 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2710 | |
| human recombinant Wnt-3A | R&D | 5036-WN/CF | |
| HEK293 TOPflash cell line |
References
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).
- Shroyer, N. F., Kocoshis, S. Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases. Hyams, J. R. W. III , Elsevier. 324-336 (2010).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. , (2014).
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).
- Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).
- Furstenberg, R. J., et al. Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).
- Wang, F., et al. Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay. Gastroenterology. , (2013).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).
- Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Akcora, D., et al. The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche. Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).
- Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
- Lau, W., et al. Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts. Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. , (2014).
- Fuller, M. K., et al. Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage. Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Koo, B. K., Clevers, H. Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5. Gastroenterology. , (2014).
- Li, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).
- Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).
- Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med (Maywood). , (2014).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Kovbasnjuk, O., et al. Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S3 (2013).
- Fujii, M., Sato, T. Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research. Front Genet. 5, 169 (2014).
- Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. Retroviral gene expression control in primary organoid cultures. Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).
