Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor

Published: February 1, 2015 doi: 10.3791/52504
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 2Q Therapeutics

Introduction

Het vermogen om menselijke somatische cellen herprogrammeren in embryonale stamcel-achtige geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) werd ontdekt door Takahashi et al. In 2007 1. Menselijke huidfibroblasten getransduceerd met retrovirussen expressie vier transcriptiefactoren (de zoge- noemde Yamanaka factoren Oct3 / 4, Sox2, c-Myc en Klf4) bleken vrijwel gelijkwaardig aan menselijke embryonale stamcellen (hESCs) op basis van morfologie, proliferatie, genexpressie en epigenetische status te hebben; cruciaal, iPSCs ook kunnen differentiëren in cellen van alle drie kiembladen 1. De proliferatieve potentie en differentiatie aantal iPSCs maakt hen zeer aantrekkelijk gereedschap; door herprogrammering cellen van patiënten die lijden aan specifieke ziekten, kan iPSCs worden gebruikt als in vitro ziekte modelsystemen en als potentiële therapeutica.

Voor het laatste doel, moet een aantal zaken voordat het volledige potentieel van iPSCs worden aangepaktin een klinische omgeving kan worden gerealiseerd; het tumorigene potentieel van in vitro gekweekte hESCs en iPSCs, het gebruik van xenogene derivaten tijdens herprogrammering en celonderhoud en de noodzaak getransplanteerde cellen te volgen in vivo zijn cruciaal obstakels voor de klinische toepassing van pluripotente stamcellen (Beoordeeld door Hentze et bij. 2). Een ideale oplossing om de noodzaak voor het bijhouden van gedifferentieerde cellen na transplantatie zou een visueel detecteerbare merker die weerstaat zwijgen en schakering ongeacht de toepassing betrekken. Robuuste en duurzame expressie van geïntegreerde transgenen is eerst haalbaar wanneer exogeen DNA wordt ingebracht in safe-harbour loci; dat wil zeggen, genomisch sites die voldoende transcriptie van een geïntegreerde vector mogelijk terwijl tegelijkertijd verzachtende verstoringen van expressie in naburige genen 3. Een zo'n site die is goed gekarakteriseerd sinds zijn ontdekking is het adeno-geassocieerde virus integratie site 1 (AAVS1), in het eerste intron van het proteïne fosfatase 1 regulerende subeenheid 12C (PPP1R12C) gen. Dit gen is aangetoond niet alleen toestaan ​​duurzame en robuuste expressie van transgenen geïntegreerd via uitgebreide tijd in kweek en in vitro differentiatie 3, maar tevens tot omliggende genen van transcriptionele verstoring 4; beide functies zijn waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van endogene chromatine isolatorelementen flankeren de AAVS1 plaats 5.

Vooruitgang in genoom engineering tools in slechts de afgelopen tien jaar aanzienlijk vergemakkelijkt het gemak en de efficiëntie waarmee genetische manipulaties in elk celtype worden bereikt. Terwijl vroege succesvolle experimenten gebruikt buitengewoon lage endogene homologe recombinatie (HR) met een geïntroduceerd donor gen bereiken targeting in SER 6,7, het gebruik van plaats-specifieke nucleasen, zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs), dat significantly induceren van homologe recombinatie door het genereren van een dubbelstrengs DNA-break is sterk toegenomen de efficiëntie van dergelijke experimenten 8,9. De herbestemming van zowel transcriptie activator-achtige effectoren (verhalen) van plantaardige pathogene Xanthomonas geslachten en de prokaryote geclusterd regelmatig afgewisseld korte palindroom herhalingen (CRISPR) / Cas9 systeem in efficiënte site-specific ontwerper nucleases heeft gentargeting gemaakt in pluripotente stamcellen een toegankelijke en uitvoerbaar methodologie 10-13.

Een recent artikel beschreef een efficiënte methode voor de stabiele integratie van een groen fluorescerend reporter cassette in de AAVS1 safe-haven locus in menselijke iPSCs behulp VERHAAL nucleases (Talens) 14. Deze gerichte iPSCs behielden hun fluorescentie zelfs nadat gericht differentiatie naar hartspiercellen en transplantatie in een muismodel van myocardinfarct (MI), het verstrekken van sterk bewijs voor het nut van dergelijkestabiel fluorescerende pluripotente stamcellen 14. Gerichte kolonies te krijgen, werd een gen-trap methode waarbij een splicing-acceptor (SA), 2A zelf-splitsende peptide sequentie plaatst het puromycine N-acetyl-transferase (PAC) gen onder controle van de endogene PPP1R12C promoter; dus, alleen iPSCs dat het DNA schenker ten AAVS1 locus hebben opgenomen uiten PAC, waardoor ze selecteerbaar gebaseerd op puromycine- weerstand; (Figuur 1, 15). Dit protocol beschrijft de procedures voor het genereren van AAVS1-GFP iPSCs gemeld in het recente document 14, met inbegrip van het proces van het transfecteren iPSCs met Talens en een 9,8 kb donor naar een 4.2kb DNA-fragment in de AAVS1 safe-harbour locus integreren, selecteren iPSCs gebaseerd op puromycine-resistentie en plukken kolonies klonale expansie. De hierin beschreven technieken kunnen worden toegepast op vele genoom technische experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van basaalmembraanziekte Matrix en Coating van Plasticware

  1. Leg de bevroren basaal membraan matrix voorraad van -20 ° C op ijs en het ontdooien overnacht bij 4 ° C.
  2. Na ontdooien pipet 2 mg aliquots van basaalmembraan matrix in vooraf gekoelde eppendorfbuizen. Bewaar deze bij -20 ° C totdat het nodig is.
  3. Voor te bereiden basaal membraan-matrix gecoate platen, ontdooien één portie op ijs tot het laatste stuk ijs in de eppendorfbuis verdwijnt (meestal binnen ~ 2 uur).
  4. Na ontdooien voeg basaalmembraan matrix 12 ml koude (4 ° C) DMEM / F12 basaalmembraan matrix coating oplossing.
  5. Voeg basaal membraan matrix oplossing voor de juiste cultuur vat. Voor een 6-well plaat, afzien van 1 ml per putje. Zwenk de plaat om te zorgen dat het basaal membraan matrix oplossing dekt volledig elk putje.
  6. Parafilm verzegelen het basaal membraan-matrix gecoate plaat / schotel, en incubeer bij room temperatuur gedurende 1 uur voor gebruik. Als alternatief winkel basaal membraan-matrix gecoate platen / borden bij 4 ° C en binnen 2 weken van de coating.
    OPMERKING: Voeg extra DMEM / F12 om het basaal membraan-matrix gecoate plaat / schaal om uitdroging te voorkomen. Voor het gebruik van 4 ° C bewaard basaal membraan-matrix gecoate plaat / schotel, plaats hem in een biologisch veiligheidskabinet en laat deze op kamertemperatuur komen gedurende ten minste 30 min.
  7. Zuig basaalmembraan matrix volledig vóór de toevoeging van medium en cellen.

2. Voorbereiding van de E8 medium

  1. Bereid E8 kweekmedium door het ontdooien van E8 supplement overnacht bij 4 ° C.
  2. Verwijder 10 ml E8 basaal medium uit de 500 ml bouillon en gooi ze weg.
  3. Pipetteer de gehele 10 ml flacon van E8 supplement direct in 490 ml E8 basaal medium. Doe niet warm volledige E8 medium in een 37 ° C waterbad, zo herhaalde temperatuurschommelingen de bFGF kan worden afgebroken in het complete E8 medium.
  4. Gebruik volledige E8 medium binnen 2 weken na toevoeging van het supplement.

3. Het ontdooien van iPSCs

  1. Verwijder een flacon van bevroren iPSCs van vloeibare stikstof en plaats op droog ijs.
  2. Snel ontdooien van de flacon in een 37 ° C waterbad; zwenk de flacon in het waterbad tot er slechts een klein fragment van ijs resten.
  3. Spray de flacon met 70% ethanol en transfer naar een biologisch veiligheidskabinet.
  4. Voeg 1 ml kamertemperatuur E8 medium druppelsgewijs direct aan het flesje.
  5. Met behulp van een pipet 2 ml, breng de celsuspensie druppelsgewijs in 9 ml E8 medium in een 15 ml conische buis. Schud de buis regelmatig zodat de cellen en medium meng goed snel.
  6. Centrifugeer de cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten.
  7. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in een geschikt volume E8 gesupplementeerd met 10 pM Y-27632.
  8. Voeg de cellen om een ​​passend aantal kelder membrane-matrix beklede putjes, en plaats in een 37 ° C, 5% CO2 incubator 's nachts. Het wordt aanbevolen om de plaat ten minste 0,2 x 10 6 iPSC per putje van een 6-wells plaat te snel herstel na ontdooiing mogelijk te maken.

4. Onderhoud en Routine passage van de iPSCs

  1. Vernieuwen E8 medium dagelijks.
  2. Controleer de morfologie en confluentie van cellen met een omgekeerde microscoop. iPSCs van hoge kwaliteit te groeien in flat kolonies met duidelijke grenzen; individuele kolonies bezitten een "geplaveide-achtig 'uiterlijk.
  3. Passage van de iPSCs cellen wanneer ze bereiken ~ 70% confluentie.
  4. Bereid een EDTA passage door toevoeging van 0,9 g NaCl en 500 pi 0,5 M EDTA tot 500 ml DPBS. Meng goed op te lossen NaCl, en vacuüm filter te steriliseren. Warm een ​​hoeveelheid van de passage oplossing in een 37 ° C waterbad voor passage.
  5. Om passage, aspiratie verbruikte kweekmedium en was cellen eenmaal met een gelijk volume warme pasSaging oplossing. Aspireren, en pipet genoeg EDTA passage oplossing voor de vacht van de cellen (1 ml per putje van een 6-wells plaat).
  6. Plaats de cellen onder een omgekeerde microscoop en observeer de iPSC kolonies. Het verschijnen van gaten in kolonies en verhoogde randen moeten duidelijk worden binnen 2 tot 5 minuten.
  7. Zuig het EDTA passage oplossing zorgvuldig.
  8. Pipetteer 10 ml afzien 4 ml E8 medium (bij gebruik van een 6-wells plaat) onder hoge druk direct in elk putje worden gepasseerd.
  9. Verzamel de iPSC bosjes, en opgesplitst in een passend aantal putten, afhankelijk van de split-ratio van 1: 8 tot 1:12. Niet over-pipet, als uitsplitsing van celklonten zal resulteren in slechte levensvatbaarheid.
  10. Plaats de plaat in een couveuse, en rock de plaat heen-en-weer en side-to-side meerdere malen om de cellen te verspreiden.

5. Voorbereiding van de MEF en iPSCs voor Tansfection

  1. 48 uur voorafgaand aan transfection, passage iPSCs bij ~ 1: 6 in vier of meer putjes van een basaalmembraan matrix beklede 6-well plaat, waardoor ze 70% confluent twee dagen vandaar zijn.
  2. De volgende dag ontdooien DR4 MEFs in MEF medium dat bestaat uit DMEM (hoog glucose) aangevuld met 10% FBS en 1x MEM-NEAA.
  3. Plaat DR4 MEFs in twee 10-cm schalen bij ~ 2 x 10 4 cellen / cm2 en incubeer overnacht bij 37 ° C.
  4. Op de dag van transfectie veranderen MEF medium E8 gesupplementeerd met 10 pM Y-27632 30 min alvorens transfectie op iPSCs.
  5. Optioneel: Als flowcytometrische analyse van iPSCs na transfectie wordt gewenst, verwijderen van een basaal membraan-matrix gecoate plaat van 4 ° C en plaats bij kamertemperatuur.
  6. Optioneel: 4 uur voorafgaand aan transfectie, vullen vóór transfectie iPSC kweek met Y-27632 bij de eindconcentratie van 10 uM.

6. Gentle-cel dissociatie reagens Treatment eennd Transfectie van iPSCs met een Electroporation System

  1. Verwijder P3 primaire cel transfectie oplossing bij 4 ° C en laat op kamertemperatuur komen gedurende ~ 30 min. Voeg de gehele 100 ul aanvulling op de transfectie oplossing vóór gebruik.
  2. Warme zachte-cel dissociatie reagens in een 37 ° C waterbad.
  3. Verkrijgen AAVS1 Talens (PZT-AAVS1-L1 en PZT-AAVS1-R1) en AAVS1-CAG-EGFP donor van -20 ° C.
  4. Verwijder iPSCs uit de incubator en een keer wassen met DPBS.
  5. Voeg 1 ml zachte cel dissociatie reagens per putje en incubeer iPSCs bij 37 ° C gedurende 5 minuten, of totdat meer dan 50% van de cellen losgemaakt van het kweekvat.
  6. Pipetteer de cellen en neer een paar keer met een P1000 pipet om alle resterende cellen van het kweekvat dissociëren en te breken iPSC klonten.
  7. Voeg 2 ml van E8 medium aan elk putje en pipet op en neer meerdere malen met een pipet 10 ml naar Fürtheh disaggregeren celklonten in enkele cellen
    OPMERKING: De transfectie efficiëntie daalt aanzienlijk als celklonten zijn niet voldoende uitgesplitst.
  8. Verzamel iPSCs in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 100 xg gedurende 3 min.
  9. Zuig supernatant en resuspendeer cellen in een minimale hoeveelheid E8 medium.
  10. Tel de cellen met een hemocytometer na toepassing van een vitale kleurstof zoals 0,4% trypan blauw. Zorg ervoor dat de cellen voldoende kunnen worden gescheiden, terwijl het tellen (1-3 cellen per "klomp").
  11. Afzien van 3 x 10 6 cellen in elk van de twee 15 ml conische buizen en spin down opnieuw bij 100 xg gedurende 3 min.
    OPMERKING: Lage snelheid centrifugeren vermindert de cel stress en maakt een eenvoudige re-opschorting van iPSCs vóór elektroporatie.
  12. Stel de elektroporatie systeem om het celtype specifieke programma voor de menselijke embryonale stamcellen lijn H9 (Program CB-150).
  13. Na centrifugeren zuig het supernatant van de CELl pellets. Om één pellet, voeg 10 ug van het HR-donor als controle monster. Aan de andere pellet voeg 10 ug van het HR-donor, samen met 5 ug van elk TALEN (PZT-AAVS1-L1 en PZT-AAVS1-R1) als experimenteel monster.
  14. Resuspendeer elk celpellet in 100 ui P3 primaire cel transfectie oplossing en naar een cuvette.
  15. Voer de transfectie en onmiddellijk 500 ul van kamertemperatuur E8 medium toe te voegen aan elke cuvette.
  16. Breng de getransfecteerde iPSCs druppelsgewijs aan een 10-cm schotel met DR4 MEF bereid in stap 5.4.
  17. Optioneel: Voeg enige druppels van elk experiment in een putje van een basaalmembraan matrix beklede 6-well plaat of flowcytometrie anaylsis transfectie efficiëntie gewenst.
  18. Herhaal de stappen 6,15-6,17 voor beide monsters afmaken. De volgende dag, wassen cellen met DPBS tweemaal en schakelen kweekmedium NutriStem, die lijkt te iPSC cultuur steunen op feeders beter dan E8.
  19. Transient EGFP expressie pieken bij 48 tot 72 uur na transfectie; beoordelen transfectie-efficiëntie zoals gewenst.

7. Puromycine keuze van gerichte iPSCs

  1. Begin puromycineselectie 72 uur na transfectie wanneer de iPSCs oplopen tot 70% samenvloeiing.
  2. Voor NCRM5 iPSCs, beginnen puromycineselectie bij 0,5 ug / ml puromycine (1/2 van de volledige dosis) verdund in NutriStem kweekmedium. De optimale puromycine concentratie kan variëren 0,25-1 ug / MLL enige iPSC lijnen.
  3. Cultuur iPSCs in NutriStem + 0,5 ug / ml puromycine voor 3 dagen, het verversen van het medium dagelijks.
  4. Na 3 dagen, verhoging van de concentratie van puromycine tot 1 ug / ml.
  5. Culture iPSCs onder 1 ug / ml puromycine selectie voor een 7 tot 8 dagen of tot afzonderlijke kolonies verschijnen groot genoeg voor colony picking.

8. Colony Picking en uitbreiden van Gerichte iPSCs

  1. Gebruik basaal membraanmatrix bekleden een 96-well plaat door het afgeven 50 ui basaalmembraan matrix bekledingsoplossing (2 mg basaalmembraan matrix verdund in 12 ml DMEM / F12) in elk putje. Bewaar de plaat staan ​​bij 4 ° C gedurende de nacht voor het gebruik.
  2. Nadat men de basaalmembraan matrix beklede plaat kamertemperatuur komen, zuigen de basaalmembraan matrix en breng 100 ui E8 gesupplementeerd met 10 pM Y-27632 in elk putje.
  3. Een omgekeerde microscoop in een biologisch veiligheidskabinet, en spray licht met 70% EtOH te steriliseren.
  4. Trek een glazen Pasteur pipet over een bunsenbrander om een ​​ideale kolonie-picking tool die een kleine "haak" aan het uiteinde heeft te verkrijgen. Steriliseer met 70% EtOH, en plaats in de kap te drogen.
  5. Verwijder het schaaltje met gerichte iPSC kolonies uit de incubator en plaats in de kap onder de microscoop.
  6. Pick iPSCs door het traceren van een cirkel rond de kolonie grens met de kolonie picking tool.
  7. Gebruik de "haak" van de kolonie-picking middel om voorzichtig schrapen en verwijder de iPSC kolonie van het oppervlak van de plaat. Voor grotere kolonies, tekenen een X met de kolonie-picking tool om kwart de kolonie zal celgroei na re-plating te vergemakkelijken.
  8. Zodra celklonten zijn vrijstaand en vrij zwevende, gebruik dan een P200 pipet ingesteld op ~ 30 pi aan de iPSCs verzamelen. Plaat cellen direct in de 96-well plaat.
  9. Optioneel: gebruik een p20 pipet op ~ 5 ul de iPSCs verzamelen in een eppendorfbuisje, voeg 50 ul zacht-cel dissociatie reagens verteerbaar gedurende 5 min bij 37 ° C. Na de spijsvertering, voeg 500 ul E8 medium in de eppendorfbuis naar de zachte-cel dissociatie reagens te verdunnen en spin down de cellen op 200 xg in een standaard tafelblad microcentrifuge gedurende 5 minuten. Zuig vervolgens meeste van het medium en laat ~ 30 pi te resuspenderen en breng de cellen in 96-well plaat.
    LET OP: Dezeaanpak zal de dissociatie van de cel klomp en snelle uitbreiding van geplukt kolonie te vergemakkelijken.
  10. Ga kolonie picking totdat een voldoende aantal iPSC kolonies werden verzameld (ongeveer 20-30 kolonies per experiment wordt aanbevolen).
  11. Na kolonie plukken, plaats de 96-wells plaat in een incubator 's nachts. Vernieuwen met complete E8 medium de volgende dag, en de cultuur tot ~ 70% confluent.
  12. Passage cellen van de 96-well in een 24-well, dan in een 6-well, zoals beschreven in de stappen 4,5-4,10.
    OPMERKING: de hoeveelheden EDTA-oplossing en E8 medium verhoudingsgewijs worden verlaagd bij gebruik putjes kleiner dan een 6-wells plaat.
  13. Beoordelen targeting succes door het knooppunt PCR en Southern blot analyse om gerichte cassette integratie en de afwezigheid van willekeurig geplaatste vectoren 16 bevestigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een visualisatie van het protocol is gegeven in Figuur 2, met perioden waarin iPSCs worden gekweekt in verschillende middelgrote gemarkeerd door een groen voor E8 of blauw voor NutriStem. Het is belangrijk om alleen hoogwaardige iPSCs transfecteren; onderzoeken cultuur gerechten gedurende routine-onderhoud en controleer of iPSC culturen bevatten voornamelijk verschillende kolonies, voorzien van een geplaveide-achtige morfologie (figuur 3A); gedifferentieerde cellen niet bezetten meer dan 10% van de kweek. Transfecteerbaarheid van iPSCs wordt beoordeeld en geoptimaliseerd met behulp van de kleine Pmax-GFP vector (Figuur 4A-B), zoals transfectie met Pmax-GFP doorgaans staat voor het maximaal haalbare rendement door zijn kleine formaat. Zo hebben we bereikt 68,6% transfectie-efficiëntie met Pmax-GFP (Figuur 4B). Om de AAVS1 safe-harbour richten, iPSCs worden gepasseerd met een zachte single-cell dissociatie reagens en zijn getransfecteerd met AAVS1-Talens en AAVS1-CAG-EGFP (plasmiden afgebeeld in figuur 1A). Getransfecteerde iPSCs worden daarna uitgeplaat op een geschikte dichtheid van DR4 MEF (figuur 3B). Tijdelijke expressie van AAVS1-CAG-EGFP pieken bij 48 tot 72 uur na transfectie (Figuur 3C); indien gewenst, kan een klein deel van getransfecteerde iPSCs FACS geanalyseerd. NCRM5 iPSCs kunnen worden getransfecteerd met het rendement van 60,9% met AAVS1-CAG-EGFP donor (figuur 4C). De transfectie efficiëntie kan sterk variëren; Voor experimenten waarbij de GFP + fractie, zelfs zo laag als 10%, blijven puromycine selectie. Na het uitvoeren van puromycineselectie moeten individuele klonen weergeven van uniforme fluorescentie groot genoeg voor kolonie plukken (Figuur 3D) zijn. Om klonen te halen, is een geschikte kolonie zich onder lage vergroting (figuur 3E) en wordt geïsoleerd door eerst tracing en vierendelen het (Figuren 3F-G). De gevierendeeld kolonies worden vervolgens voorzichtig schrapend van de cultuur vat (Figuur 3H). Met een p200 pipet worden celklonten vervolgens overgebracht in een putje van een basaalmembraan matrix beklede plaat met 96 putjes. iPSCs moeten hechten binnen 2-4 uur in de platen (Figuur 3I). Als bevestiging niet binnen 24 uur wordt waargenomen, Basement membraanmatrix-coating of Y-27632 behandeling waren waarschijnlijk suboptimaal; Basaal membraan matrix-coat een nieuwe 96-well plaat en voor te bereiden verse E8 + 10 M Y-27632 alvorens ze meer kolonies. Eenmaal in een 96-well formaat, doelgerichte iPSC klonen geëxpandeerd en stabiel en uniforme expressie van GFP (Figuren 4D-E) vertonen.

Figuur 1
Figuur 1: Gene targeting vectoren en targeting schema. (A) Vertegenwoordigers van de AAVS1-CAG-EGFP en PZT-AAVS1-L1 / R1 Talens plasmiden gebruikt in deze studie. De SA-2A element in de AAVS1-CAG-EGFP plasmide representeert de splice-acceptor en 2A zelf-splitsende peptide gebruikt puromycine N-acetyl-transferase (PAC) genexpressie gerichte integratiegebeurtenissen beperken. De kip β-actine globine (CAG) promoter wordt gebruikt om expressie van EGFP drijven. (B) De AAVS1 safe harbour, vervat in Intron 1 van de PPP1R12C gen wordt gericht met Talens een dubbelstrengs DNA break genereren. Dit activeert de homologe recombinatie (HR) reparatie machines, die vervolgens gebruikt AAVS1-CAG-EGFP donor (lager homologie-armen aan weerszijden van de snede plaatse) als een substraat voor reparatie. De cassette is geïntegreerd en de PAC gen onder controle van de endogene PPP1R12C promoter.

Figuur 2
Figuur 2. Tijdlijn van gentargeting experiment. IPSCs worden gekweekttot 70% confluentie en gepasseerd ~ 1: 6 op dag -2 (d-2). MEF worden uitgeplaat bij d-1, en iPSCs verzameld en getransfecteerd in d0. Bij d1, wordt media geschakeld NutriStem en iPSCs worden gedurende twee dagen voor puromycine toegevoegd aan het medium bij d3. Kolonies zijn meestal klaar voor het plukken van d12. Perioden waarin iPSCs worden gekweekt in E8 medium zijn groen gemarkeerd, terwijl periodes van NutriStem cultuur zijn in het blauw.

Figuur 3
(A) Fase beeld van hoge kwaliteit iPSCs iPSC gentargeting representatieve beelden: figuur 3.. Let op de fase-heldere grens en geplaveide morfologie. (B) DR4 MEFs uitgeplaat bij 2 x 10 4 cellen / cm2 vierentwintig uur na ontdooien. (C) tweeënzeventig uur na transfectie EGFP + cellen duidelijk blijkt wanneer bekeken onder een fluorescentie microscope. (D) Na puromycine- gebaseerde selectie voor ~ 14 dagen, kolonies weergeven van uniforme GFP fluorescentie zijn groot genoeg om geplukt te worden. (EH) Vertegenwoordiger beelden van de kolonie plukken proces. Kolonies worden opgepikt met een getrokken Pasteur pipet, eerst door waarin de kolonie en vervolgens kwartieren aan kleinere celklonten verkrijgen. (I) uitgezocht iPSC kolonies hechten aan de basaalmembraan matrix gecoate oppervlak van de plaat met 96 putjes in 2 à 4 uur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: FACS analyse van transfectie efficiency en klonale gerichte iPSCs. (A) Controle NCRM5 iPSCs zonder transfectie van een plasmide. (B) NCRM5iPSCs getransfecteerd met de kleine testvector Pmax-GFP zijn FACS geanalyseerd op GFP-expressie. (C) Tijdelijke expressie van de AAVS1-CAG-EGFP-plasmide wordt beoordeeld door FACS. (D) Een NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP kloon displays uniform positieve EGFP expressie zoals is getest door FACS. Let op de strakke bundeling van de geanalyseerde iPSCs in vergelijking met C). (E) Fluorescentie beeld van een uitgebreid NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP gerichte kloon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De meest kritische stappen voor de succesvolle generatie AAVS1 safe-haven gerichte menselijke iPSCs zijn: (1) efficiënt leveren van TALEN en donorplasmiden in iPSCs door transfectie; (2) het optimaliseren van dissociatie van iPSCs in enkele cellen voor transfectie en uitplaatdichtheid na transfectie; (3) optimalisatie van de dosis en de geneesmiddel-selectie op basis van de groei van iPSC lijn; (4) voorzichtig ontleden en het plukken van gerichte koloniën en de overdracht aan de nieuwe plaat / goed. In vergelijking met soortgelijke methoden in document Hockemeyer's 10, dit protocol een paar open source AAVS1-Talens, verschillende iPSC dissociatie reagens en verschillende transfectie apparaat Talens en donor vectoren leveren, die hielpen om het aantal iPSCs in het verminderen experiment terwijl het bereiken van een hoge transfectie en targeting efficiëntie.

Hoogrendabele gen montagewerk menselijke iPSCs bereiken, is het noodzakelijk om eerst optimaliseren aflevering van gen editing reagentia (DNA / RNA), terwijl de afweging van de acute celdood de levering methode en reagentia veroorzaken iPSCs. Het doel is om de levering te maximaliseren terwijl een tamelijk lage celdood. Aangezien het zeer gemakkelijk om grote hoeveelheden AAVS1-TALEN plasmiden die> 50% HF efficiëntie met behulp van drugs-selectie in menselijke iPSCs kan bereiken bereiden, is het niet noodzakelijk om mRNA te maken uit TALEN plasmiden. De uitdaging van de levering komt van grote donorplasmiden, die in dit geval is ~ 10 kb. Het wordt aanbevolen de AAVS1-CAG-EGFP donor gebruiken om de vrijgave efficiëntie testen specifieke menselijke iPSC lijnen in plaats van pMaxGFP in de transfectie kit, omdat pMaxGFP een ~ 3,5 kb plasmide klein en zeer eenvoudig te geven in alle cellen. AAVS1-CAG-EGFP donor kan worden gewijzigd met behulp van restrictie-enzymen afgebeeld in Figuur 1A verschillende transgenen in AAVS1 locus richten. Een 12 kb donor, die een 6,4 kb cassette CAG-EGFP vervangen bevat, heeft zijnen met succes gebruikt om soortgelijke transfectie en targeting efficiëntie (gegevens niet getoond) te bereiken. In het algemeen zullen iPSCs behoren de moeilijk te transfecteren celtypes en de levering efficiëntie van grote plasmiden zo laag als 5-10% als gemeten door flow cytometrie analyse van GFP + cellen. Verdere optimalisatie van transfectie efficiëntie is afhankelijk van de juiste dissociatie van menselijke iPSCs in enkelvoudige cellen, omdat celklonten de kans maakt gen bewerken reagentia in elke cel zal verminderen. Dit protocol maakt gebruik van een zachte en snel werkende cel dissociatie reagens, maar de behandeling van iPSCs voor meer dan 10 minuten wordt niet aanbevolen. Gewoonlijk iPSC cultuur minder dan 80% confluent als na stap 5.1, die een 5 minuten incubatie met voorverwarmd zachte cel dissociatie reagens gewoonlijk voldoende om de iPSCs dissociëren in afzonderlijke cellen met zacht pipetteren. Wanneer niet alle cellen kunnen worden gedissocieerd tot afzonderlijke cellen na 10 min behandeling omdat celkweek over-convloeiend of kolonies worden zeer compact, gewoon verzamel het aanbevolen aantal afzonderlijke cellen uit meer putjes / plaat en laat het stevig aangehechte cellen achter. Zware pipetteren wordt niet aanbevolen omdat mechanische afschuiving is meer schadelijk voor de cellen dan enzymatische dissociatie. Bij het werken met vroege passage iPSCs (vóór passage nummer 15), zwakke dissociatie praktijk zeer belangrijk voor celoverleving omdat de cellen al gevoeliger voor transfectie stress dan laat de passage iPSCs. Als het moeilijk is om een ​​hoog rendement in zowel transfectie en celoverleving bereiken, kiest de praktijk die hoogste transfectie efficiëntie geeft. Na transfectie, moeten de cellen worden uitgeplaat bij de dichtheid dat 50-80% samenvloeiing zal bereiken op dag 3 als drug-selectie begint. Aangezien elke iPSC lijn groeit anders, zou het na transfectie uitplaatdichtheid moeten worden geoptimaliseerd voor elke cellijn. Een hoge uitplaatdichtheid kan leiden tot over-confluentie dat de werkzaamheid van dru vermindertG-selectie, terwijl een extreem lage uitplaatdichtheid vertraagd herstel en groei van resistente kolonies veroorzaken. Meestal 3.000.000 beginnen iPSCs genoeg worden uitgeplaat in ½ tot 2 schalen van 10 cm, afhankelijk van de overleving en groei van specifieke iPSCs. Evenzo, als een zojuist gegenereerd of nog niet geteste iPSC lijn, waardoor een puromycine doden curve de laagst effectieve dosis in getransfecteerde cellen noodzakelijk acht; iPSC lijnen aanzienlijk in hun gevoeligheid voor puromycine selectie variëren. De MEF werden gebruikt voor selectie, omdat ze lijken te iPSC groei beter te ondersteunen dan sommige extracellulaire matrices tijdens drug selectie. Als vuistregel minimaal 5 dagen puromycine bij 1 ug / ml of 7 dagen bij 0,5 ug / ml nodig zijn selectie te voltooien. Tenslotte kolonie picking techniek is cruciaal voor de beoogde kolonies na geneesmiddelselectie behouden. Gentle pipetteren of dissociatie reagens behandeling helpt om de kolonies gelijkmatig breken in meerdere delenverdeeld over de nieuwe put, en daarom kan versnellen kolonie expansie. Bij gebruik van een dissociatie reagens om vooraf de geplukt kolonies disaggregeren aan plating, zorg ervoor dat het voldoende is met> 10x medium na behandeling verdund, omdat de resterende dissociatie reagens de overgedragen cellen kunnen doden als 's nachts vertrokken op. Het maakt niet uit welke techniek wordt gebruikt, het beoefenen kolonie plukken voordat de echte experimenten wordt sterk aangemoedigd.

Zoals beschreven strategie maakt gebruik van een gen-trap werkwijze om expressie van het gen PAC wegrijden van de endogene promoter PPP1R2C aanzienlijk plukken meer dan 30 kolonies niet nodig blijken. De SA-2A gekoppeld PAC selectie theoretisch elimineert willekeurige alleen-integratie cellen, maar extra willekeurige integratie (s) kunnen optreden in iPSCs dragende succesvolle gerichte integraties. In de meeste gevallen, bijna 100% van geneesmiddel gekozen klonen gericht integraties en ~ 10-40% heeft extra willekeurige integrations. De meerderheid van gerichte klonen hebben de neiging om single-allel targeting hebben, al experimenten waarin> 50% dubbel-allel targeting optreedt. De variabele frequentie bijkomende willekeurige integraties, evenals de verhouding van single- versus dubbele-allel targeting, moeilijk te regelen. Daarom plukken ~ 20 kolonies wordt aanbevolen om enkel- of dubbel-allel zorgen targeting alleen klonen worden verkregen. In het licht van mislukte targeting experimenten, re-evaluatie van de doelcellen 'transfecteerbaarheid, overleving en groei, wordt de werkzaamheid van nucleases in de specifieke cellijn, en de kwaliteit van de donor en nuclease voorbereidingen zeer aan te bevelen voor het opnieuw proberen het experiment in zijn geheel.

Opgemerkt wordt dat soortgelijke gen-trap donor strategieën kunnen worden gebruikt voor het richten andere actieve genen, maar is niet geschikt voor stille gen targeting een onafhankelijke promoter vereist selecteerbaar genexpressie. Ook, terwijl the AAVS1 veilige haven wordt beschouwd als geopend chromatine structuur hebben, is dit geen garantie dat elke transgen sterk op dit locus kan worden uitgedrukt. Inderdaad, onze recent rapport toonde aan dat een aantal zwakke promotors waren niet in staat om detecteerbaar fluorescerende reporter genexpressie na gerichte integratie op AAVS1 locus 14.

Dit protocol richt zich op het gebruik van goed gevalideerde Talens naar een goed bestudeerde veilige haven locus in het menselijk genoom richten. De technieken zijn zeer reproduceerbaar en gemakkelijk aan vele toepassingen op elk transgen. Vergeleken genoom engineeringmethoden behulp van willekeurige integraties AAVS1-TALEN gemedieerde gen-targeting is zeer efficiënt en specifiek, en bij iPSCs, resulteert in stabiel fluorescerende cellen die de mogelijkheden voor uitbreiding en differentiëren in menselijke celtype hebben. Hoewel dit protocol niet het ontwerp en de validatie van designer nucleasen of de beoordeling van gerichte iPSC kolonies voor p beschrijventouwslager cassette integratie en off-target analyse, hebben een aantal uitstekende protocollen deze aspecten van de methodiek in detail beschreven 16-18. De voedingsvrije iPSC cultuur passage technieken gebruiken E8 medium worden ook in detail beschreven in voorgaande publicatie 19. De bovengenoemde protocol, maar geoptimaliseerd voor gen toevoeging in de AAVS1 safe haven van menselijke iPSCs kan als algemeen sjabloon voor experimenten met plaatsspecifieke-nuclease gemedieerde gen-editing / toevoeging middels homologe recombinatie donor in elk type cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml Corning 354230 Store at -20 °C.
DMEM/F-12 Life Technologies 11320-033 Store at 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3506
Essential 8 Medium Life Technologies A1517001 Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C.
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254 Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C.
Sodium Chloride Sigma S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-250
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic GlobalStem GSC-6204G Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-040 Store at 4 °C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin HyClone SH30070.03 Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050 Store at 4 °C.
4D-Nucleofector Core unit  Lonza AAF-1001B part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit  Lonza AAF-1001X part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) Lonza V4XP-3024 Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501 Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium Stemgent 01-0005 Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) Addgene 52637 and 52638
Name Company Catalog Number Comments
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor Addgene 22212
Puromycin Dihydrochloride Life Technologies A11138-03 Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz Thermo Scientific 75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor Thermo Scientific 75003607
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
  3. Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
  4. Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
  5. Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
  6. Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
  7. Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
  8. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  9. Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
  10. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
  11. Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
  12. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  13. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  14. Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
  15. Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
  16. Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
  17. Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: http://www.stembook.org/node/1438 (2008-2013).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).

Tags

Developmental Biology geïnduceerde pluripotente stamcellen gen-editing AAVS1 TALEN GFP
Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cerbini, T., Luo, Y., Rao, M. S.,… More

Cerbini, T., Luo, Y., Rao, M. S., Zou, J. Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor. J. Vis. Exp. (96), e52504, doi:10.3791/52504 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter