Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l'homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor

Introduction

La possibilité de reprogrammer des cellules somatiques humaines en cellules souches pluripotentes souches embryonnaires cellulaires comme induites (CSPi) a été découvert par Takahashi et al. En 2007 ^1. Fibroblastes dermiques humaines transduites avec rétrovirus exprimant quatre facteurs de transcription (Le Yamanaka soi-surnommé facteurs Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, et Klf4) ont été montrés être très similaire à des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) en fonction de la morphologie, la prolifération, l'expression du gène, et l'état épigénétique; surtout, iPSCs sont également capables de se différencier en cellules des trois couches germinales ^1. La capacité potentielle et la différenciation de prolifération des CSPi les rend très attractifs outils; par reprogrammation des cellules provenant de patients souffrant de maladies spécifiques, iPSCs peuvent être utilisés à la fois comme systèmes de modèle in vitro de la maladie et en tant qu'agents thérapeutiques potentiels.

Pour ce dernier objectif, plusieurs questions doivent être réglées avant que le plein potentiel de CSPidans un cadre clinique peut être réalisé; le potentiel tumorigène des CSEh et CSPi, l'utilisation de dérivés xénogéniques lors de la reprogrammation et l'entretien des cellules cultivées in vitro, et la nécessité de suivre les cellules transplantées in vivo sont tous les obstacles cruciaux à l'application clinique des cellules souches pluripotentes (Commenté par Hentze et au. ^2). Une solution idéale pour la nécessité pour le suivi des cellules différenciées post-transplantation impliquerait un marqueur visuellement détectable qui résiste taire et panachées indépendamment de l'application. Expression forte et soutenue de transgènes intégrés est plus facilement réalisable lorsque l'ADN exogène est introduit dans Coffre-port loci; ce est-à emplacements génomiques qui permettent la transcription suffisante d'un vecteur intégré en même temps l'atténuation des perturbations de l'expression dans ^trois gènes voisins. Un tel site qui a été très bien caractérisé depuis sa découverte est le virus intégr adéno-associésite ation 1 (AAVS1), dans le premier intron de la protéine phosphatase une sous-unité régulatrice 12C (PPP1R12C) gène. Ce lieu a été démontré non seulement pour permettre l'expression soutenue et robuste de transgènes intégrés dans le temps étendu dans la culture et dans la différenciation in vitro ^3, mais aussi pour protéger les gènes de la perturbation de la transcription ⁴ entourant; les deux éléments sont considérées comme étant dues à la présence d'éléments d'isolateur chromatine endogènes flanquant le site de AAVS1 ^5.

Les progrès dans les outils d'ingénierie des génomes plus juste de la dernière décennie ont grandement facilité la facilité et l'efficacité avec lesquelles les manipulations génétiques dans ne importe quel type de cellule peuvent être atteints. Bien que les expériences réussies début invoqués excessivement faibles niveaux de recombinaison homologue endogène (HR) avec un donneur présenter à atteindre ciblage de gène dans les CES ^6,7, l'utilisation des nucléases spécifiques au site, tels que les nucléases à doigts de zinc (de ZFN), qui signitivement induire la recombinaison homologue grâce à la génération d'une rupture d'ADN double brin a considérablement augmenté l'efficacité de ces expériences ^8,9. La réorientation des deux transcription activateur comme effecteurs (contes) de plantes pathogène Xanthomonas genres et les cluster régulièrement espacées répétitions palindromiques courts procaryotes (CRISPR) / système Cas9 dans efficaces nucléases de créateurs propres à chaque site a fait le ciblage de gènes dans les cellules souches pluripotentes un accessible et méthodologie possible ^10-13.

Un article récent décrit une méthode efficace pour l'intégration stable d'une cassette de rapporteur fluorescent vert dans le AAVS1 Coffre-port locus CSPi humaines à l'aide de nucléases TALE (Talens) ^14. Ces CSPi ciblées ont maintenu leur fluorescence même après la différenciation dirigé vers les cardiomyocytes et la transplantation dans un modèle de souris de l'infarctus du myocarde (IM), fournissant des preuves solides pour l'utilité de cettede manière stable des cellules souches pluripotentes ¹⁴ fluorescent. Pour obtenir des colonies cibles, un procédé de piégeage de gènes a été utilisé dans lequel un épissage accepteur (SA), une séquence de peptide de l'auto-clivage 2A place la puromycine N-acétyl-transférase (PAC) gène sous le contrôle du promoteur PPP1R12C endogène; Ainsi, seules iPSCs qui ont incorporé le donneur d'ADN au locus AAVS1 expriment PAC, les rendant sélectionnable sur la base de la résistance à la puromycine; (Figure 1, ^15). Ce protocole détaille les procédures de générer AAVS1-GFP CSPi signalé dans le récent article ^14, y compris le processus de transfection CSPi avec TALENs et un donneur de 9,8 kb pour intégrer un fragment d'ADN de 4,2 kb dans le locus AAVS1 Coffre-port, la sélection CSPi basé sur puromycine-résistance, et les colonies de cueillette pour l'expansion clonale. Les techniques décrites ici peuvent être appliqués à de nombreuses expériences d'ingénierie du génome.

Protocol

1. Préparation de la membrane basale Matrix et Revêtement de Plasticware

1. Placez le congelé membrane basale matrice stocks de -20 ° C sur de la glace et décongeler une nuit à 4 ° C.
2. Après décongélation, la pipette des parties aliquotes de 2 mg matrice de membrane basale dans des tubes Eppendorf pré-réfrigérés. Stocker ces à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
3. Pour préparer des plaques de matrice revêtu la membrane basale, dégeler une aliquote sur la glace jusqu'à ce que le dernier morceau de glace dans les disparaît tube Eppendorf (généralement dans ~ 2 h).
4. Après décongélation, ajouter matrice de membrane basale de 12 ml de froid (4 ° C) du milieu DMEM / F12 pour faire une solution de revêtement de la matrice de membrane basale.
5. Ajouter la solution de matrice de membrane basale dans le récipient de culture approprié. Pour une plaque à 6 puits, distribuer 1 ml par puits. Agiter la plaque pour se assurer que la solution de la matrice de la membrane basale couvre complètement chaque puits.
6. Parafilm sceller la membrane basale matrice plaque revêtue / plat, et incuber à room température pendant 1 heure avant utilisation. Alternativement, plaques de matrice revêtu de la membrane basale du magasin / plats à 4 ° C et utiliser dans les 2 semaines de revêtement.
   REMARQUE: Ajout frais de DMEM / F12 pour la membrane basale matrice plaque revêtue / plat pour éviter le dessèchement. Avant d'utiliser 4 ° C membrane basale stockée matrice plaque revêtue / plat, placez-le dans une enceinte de sécurité biologique et de lui permettre de revenir à la température ambiante pendant au moins 30 min.
7. Aspirer matrice de membrane basale complètement avant l'addition de milieu et de cellules.

2. Préparation du milieu E8

1. Préparer un milieu de culture en décongelant E8 E8 supplément pendant une nuit à 4 ° C.
2. Retirer 10 ml de E8 milieu de base de la 500 ml stock et le jeter.
3. Pipeter l'ensemble flacon de 10 ml de supplément E8 directement dans 490 ml de milieu de base E8. Avez moyenne E8 complète pas chaud dans un bain-marie à 37 ° C, que les fluctuations de température répétées peuvent dégrader le bFGF dans l'achèvementmoyenne te E8.
4. Utilisez milieu complet E8 dans les 2 semaines de plus du supplément.

3. Le dégel des CSPi

1. Retirer un flacon de CSPi congelés de l'azote liquide et le placer sur la glace sèche.
2. Décongeler rapidement le flacon dans un bain d'eau à 37 ° C; agiter le flacon dans le bain d'eau jusqu'à ce que seule une infime fragment de restes de glace.
3. Vaporisez le flacon avec 70% d'éthanol et le transfert à une enceinte de sécurité biologique.
4. Ajouter 1 ml de la température ambiante, goutte à goutte E8 milieu directement dans le flacon.
5. Utilisation d'une pipette 2 ml, goutte à goutte de transférer la suspension de cellules dans 9 ml de milieu E8 dans un tube conique de 15 ml. Agiter le tube fréquemment pour se assurer que les cellules et le milieu bien mélanger rapidement.
6. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min.
7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans un volume approprié de E8 supplémenté avec 10 pM de Y-27632.
8. Ajouter les cellules à un nombre approprié de sous-sol membrane matrice puits revêtus, et placer dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur nuit. Il est recommandé à l'assiette au moins 0,2 x 10 ⁶ iPSC par puits d'une plaque à 6 puits pour permettre la récupération rapide après décongélation.

4. Maintenance et repiquage systématique des CSPi

1. Actualiser moyenne quotidienne E8.
2. Surveiller la morphologie et la confluence de cellules avec un microscope inversé. CSPi de haute qualité dans les colonies grandissent plats avec des aréoles distinctes; colonies individuelles possèdent une apparence "pavée-like".
3. Passage des cellules CISP quand ils atteignent ~ 70% de confluence.
4. Préparer une solution EDTA de passages en ajoutant 0,9 g de NaCl et 500 pi d'EDTA 0,5 M à 500 ml DPBS. Mélangez bien pour dissoudre NaCl, et le filtre à vide à stériliser. Chauffer une partie aliquote de la solution de passages dans un bain d'eau à 37 ° avant le repiquage.
5. Au passage, aspirer passé milieu de culture et laver les cellules une fois avec un volume égal de pas chaudssaging solution. Aspirer et pipette assez EDTA solution de passages pour enrober les cellules (1 ml par puits d'une plaque à 6 puits).
6. Placez les cellules sous un microscope inversé et observer les colonies iPSC. L'apparition de trous dans les colonies et des frontières soulevées devrait devenir apparente dans les 2-5 min.
7. Aspirer soigneusement la solution EDTA de passages.
8. En utilisant une pipette de 10 ml, passer 4 ml de milieu E8 (si vous utilisez une plaque de 6 puits) sous haute pression directement dans chaque puits pour être repiquées.
9. Recueillir les touffes iPSC, et divisée en un nombre approprié de puits selon le rapport de division de 1: 8 à 1:12. Ne pas trop-pipette, que la désagrégation des amas de cellules entraînera faible viabilité.
10. Placer la plaque dans un incubateur, et basculer la plaque de va-et-vient et côte à côte plusieurs fois pour disperser les cellules.

5. Préparation du MEF et CSPi pour Tansfection

1. 48 heures avant la transfection, CSPi de passage à ~ 1: 6 en quatre ou plusieurs puits d'une matrice revêtu plaque de 6 puits membrane basale, de sorte qu'ils seront 70% de confluence dans deux jours.
2. Le lendemain, décongeler DR4 MEF MEF dans le milieu constitué de DMEM (glucose élevé) complété avec 10% de FBS et 1x MEM-NEAA.
3. Plate DR4 MEF en deux plats de 10 cm à 2 x 10 ~ ⁴ cellules / cm ² et incuber une nuit à 37 ° C.
4. Le jour de la transfection, changer MEF à E8 milieu supplémenté avec 10 uM Y-27632 30 min avant d'effectuer la transfection sur iPSCs.
5. Facultatif: Si l'analyse de cytométrie en flux de post-transfection CSPi est désiré, retirer une matrice-plaque revêtue de la membrane basale de 4 ° C et le lieu à la température ambiante.
6. Facultatif: 4 h avant la transfection, compléter pré-transfection de la culture avec COPSi Y-27632 à la concentration finale de 10 uM.

6. brise-cellule de dissociation de traitement réactif Ae transfection de CSPi l'aide d'un système d'électroporation

1. Retirer P3 solution de transfection de cellules primaires de 4 ° C et lui permettre de revenir à la température ambiante pendant ~ 30 min. Ajouter la totalité du supplément de 100 ul de la solution de transfection avant utilisation.
2. Douce et chaude cellules réactif de dissociation dans un bain d'eau à 37 C °.
3. Obtenir AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 et PZT-AAVS1-R1) et AAVS1-CAG-EGFP donateurs de -20 ° C.
4. Retirer CSPi de l'incubateur et laver une fois avec du DPBS.
5. Ajouter 1 ml de douce-cellulaire réactif de dissociation par puits, et incuber CSPi à 37 ° C pendant 5 minutes, ou jusqu'à ce que plus de 50% des cellules ont dissocié du récipient de culture.
6. Introduire à la pipette les cellules de haut en bas à quelques reprises à l'aide d'une pipette de p1000 de dissocier toutes les cellules restantes de la cuve de culture, et de briser les mottes iPSC.
7. Ajouter 2 ml de milieu E8 à chaque puits, et pipette de haut en bas plusieurs fois en utilisant une pipette de 10 ml à Fürther désagréger amas de cellules en cellules individuelles
   NOTE: L'efficacité de transfection diminue significativement si des agrégats cellulaires ne sont pas suffisamment désagrégées.
8. Recueillir iPSCs dans un tube conique de 15 ml, et centrifuger à 100 g pendant 3 min.
9. Aspirer le surnageant et remettre les cellules dans une quantité minimale de milieu E8.
10. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre après application d'un colorant vital tel que 0,4% de bleu trypan. Veiller à ce que les cellules sont suffisamment dissociées en comptant (1-3 cellules par "bouquet").
11. Distribuer 3 x 10 ⁶ cellules dans chacun des deux tubes coniques de 15 ml, et centrifuger à nouveau à 100 g pendant 3 min.
    NOTE: centrifugation à basse vitesse réduit le stress cellulaire et permet facilement remise en suspension des CSPi avant électroporation.
12. Réglez le système d'électroporation au programme spécifique de type cellulaire pour la embryonnaires lignée de cellules souches humaines H9 (Programme CB-150).
13. Après centrifugation, aspirer le surnageant de la cell pellets. Pour une pastille, ajouter 10 ug du donneur de RH comme échantillon témoin. Pour ajouter l'autre pastille 10 pg du donneur d'HR, avec 5 pg de chaque TALEN (PZT-AAVS1 et PZT-L1-R1-AAVS1) comme échantillon expérimental.
14. Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 100 pi de solution de transfection de cellules primaires P3, et la transfère dans une cuvette.
15. Effectuer la transfection et ajouter immédiatement 500 ul de milieu de E8 de la température ambiante à chaque cuvette.
16. Transférer le CSPi goutte à goutte transfectées à une boîte de 10 cm contenant MEF DR4 préparés à l'étape 5.4.
17. Facultatif: ajouter quelques gouttes de chaque expérience dans un puits d'une matrice revêtue plaque à 6 puits membrane basale si ANALYSES cytométrie de flux de l'efficacité de transfection est souhaitée.
18. Répétez les étapes 6.15 à 6.17 pour finir les deux échantillons. Le lendemain, laver les cellules avec du DPBS deux fois et basculer milieu de culture pour NutriStem, qui semble soutenir la culture iPSC sur les départs mieux que E8.
19. Transient pics d'expression de EGFP dans les 48 à 72 heures après la transfection; évaluer l'efficacité de transfection comme vous le souhaitez.

7. puromycine Sélection des CSPi ciblés

1. Début sélection puromycine 72 heures après transfection lorsque les CSPi atteignent 70% de confluence.
2. Pour NCRM5 CSPi, commencer la sélection de la puromycine à 0,5 pg / ml de puromycine (1/2 de la dose complète) dilué dans un milieu de culture NutriStem. La concentration optimale de la puromycine peut varier de 0,25 à 1 ug / mIL pour certaines lignes iPSC.
3. CSPi de la culture dans NutriStem + 0,5 pg / ml de puromycine pendant 3 jours, le milieu rafraîchissantes quotidienne.
4. Après 3 jours, augmenter la concentration de la puromycine à 1 ug / ml.
5. CSPi de Culture de moins de 1 ug / ml de sélection puromycine pendant 7-8 jours, ou jusqu'à colonies distinctes apparaissent assez grand pour la cueillette colonie.

8. prélèvement de colonie et expansion des CSPi ciblées

1. Utilisez membrane basalematrice pour revêtir une plaque de 96 puits en distribuant 50 ul d'une solution de revêtement de la matrice de membrane basale (2 mg matrice de membrane basale dilué dans 12 ml de DMEM / F12) dans chaque puits. Conservez la plaque à 4 ° C pendant la nuit avant de l'utiliser.
2. Après avoir laissé la plaque de matrice revêtu membrane basale à venir à la température ambiante, aspirer la matrice de la membrane basale et distribuer 100 pi E8 complété avec 10 uM Y-27632 dans chaque puits.
3. Placez un microscope inversé dans une enceinte de sécurité biologique, et vaporiser légèrement avec 70% EtOH à stériliser.
4. Tirez une pipette Pasteur en verre au-dessus d'un bec Bunsen pour obtenir un outil colonie cueillette idéal qui a un «crochet» minuscule à la pointe. Stériliser avec EtOH à 70%, et le placer dans la hotte pour sécher.
5. Retirer le plat contenant colonies iPSC ciblées de l'incubateur, et la placer dans la hotte sous le microscope.
6. Choisissez CSPi en traçant un cercle autour de la frontière de la colonie avec l'outil de la colonie-picking.
7. Utilisez le «crochet» de l'outil colonie-cueillette à gratter délicatement et retirez la colonie iPSC de la surface de la plaque. Pour les grandes colonies, dessinant un X avec l'outil de la colonie-picking à la colonie trimestre facilitera la croissance des cellules après re-placage.
8. Une fois amas de cellules sont détachées et flottant librement, utiliser une pipette de p200 mis à ~ 30 pi de recueillir les CSPi. cellules de la plaque directement dans la plaque à 96 puits.
9. En option: utiliser une pipette de p20 mis à ~ 5 pi de recueillir les CSPi dans un tube Eppendorf, puis ajouter 50 ul douce cellules réactif de dissociation à digérer pendant 5 min à 37 ° C. Après digestion, ajouter 500 pi de milieu E8 dans le tube Eppendorf pour diluer le réactif de dissociation douce cellules et centrifuger les cellules à 200 xg dans une microcentrifugeuse de table standard pour 5 min. Puis aspirer plus du milieu et de laisser ~ 30 pi Pour resuspendre et transférer les cellules dans la plaque 96 puits.
   NOTE: Ceapproche facilitera la dissociation de la touffe de la cellule et l'expansion rapide de colonie ramassé.
10. Continuer colonie cueillette jusqu'à ce qu'un nombre suffisant de colonies iPSC ont été collectées (environ 20 à 30 colonies par expérience est recommandé).
11. Après prélèvement de colonie, placer la plaque 96 puits dans un incubateur pendant la nuit. Rafraîchir avec un milieu complet de E8 le lendemain, et la culture jusqu'à ~ 70% de confluence.
12. cellules de passage de la 96 puits dans un 24 puits, puis dans un 6 puits, comme décrit dans les étapes 4.5 à 4.10.
    NOTE: les volumes de solution d'EDTA et E8 milieu devraient être proportionnellement réduite lors de l'utilisation de plus petites que les puits d'une plaque à 6 puits.
13. Évaluer ciblage succès en jonction PCR et l'analyse par transfert de Southern pour confirmer l'intégration de la cassette ciblée et l'absence de vecteurs insérées au hasard ^16.

Representative Results

Une visualisation du protocole est fourni à la figure 2, avec des périodes au cours de laquelle CSPi sont cultivées dans un milieu différent, mis en évidence par soit vert pour E8 ou bleu pour NutriStem. Il est important pour la transfection seulement CSPi de haute qualité; examiner les boîtes de culture tout au long de l'entretien de routine et de vérifier que les cultures iPSC contiennent des colonies distinctes portant principalement une morphologie pavée comme (figure 3A); les cellules différenciées ne doivent pas occuper plus de 10% de la culture. Transfectabilité des CSPi est évalué et optimisé à l'aide du petit vecteur pMax-GFP (figure 4A-B) que la transfection avec pMax-GFP représente généralement le maximum d'efficacité possible à cause de sa petite taille. Par exemple, nous avons réalisé 68,6% d'efficacité de la transfection avec pMax-GFP (figure 4B). Pour cibler le AAVS1 Coffre-port, CSPi sont des passages en utilisant un réactif de dissociation unicellulaire doux et sont transfectées avec AAVS1-TALENs et AAVS1-CAG-EGFP (plasmides représentés à la figure 1A). IPSCs transfectées sont ensuite étalés sur une densité convenable de DR4 MEF (figure 3B). L'expression transitoire de pics AAVS1-CAG-EGFP à 48 à 72 heures après la transfection (figure 3C); si on le désire, une petite partie de iPSCs transfectées peut être analysée par FACS. NCRM5 CSPi peuvent être transfectées avec le rendement de 60,9% en utilisant AAVS1-CAG-EGFP donneur (figure 4C). L'efficacité de transfection peut varier considérablement; pour des expériences dans lequel la GFP + fraction est encore aussi bas que 10%, continuera à la sélection de la puromycine. Après avoir effectué la sélection à la puromycine, clones individuels affichant fluorescence uniforme devrait être assez grand pour prélèvement de colonie (Figure 3D). Pour chercher des clones, une colonie approprié est situé sous faible grossissement (figure 3E) et est isolé par la première traçage et de cantonnement, il (figures 3F-G). Les colonies quartiers sont ensuite gratter délicatementd à partir du récipient de culture (figure 3H). Aide d'une pipette de p200, amas de cellules sont ensuite transférés dans un puits d'une plaque de 96 puits membrane basale matrice revêtu. CSPi devraient attacher dans les 2-4 heures de plaquage (figure 3I). Si l'attachement ne est pas observée dans les 24 heures, la membrane basale matrice revêtement ou Y-27632 traitement étaient susceptibles sous-optimale; membrane basale matrice revêtir une nouvelle plaque de 96 puits et préparer frais E8 + 10 uM Y-27632 avant de prendre tout plus de colonies. Une fois dans un format de 96 puits, ciblées clones iPSC sont élargis et doivent présenter une expression stable et uniforme de la GFP (figures 4D-E).

Figure 1: Gene vecteurs de ciblage et le ciblage schématique. (A) Représentations de la AAVS1-CAG-EGFP, et plasmides PZT-AAVS1-L1 / R1 Talens utilisées dans cette étude. Le SA-Elément de 2A dans le plasmide AAVS1-CAG-EGFP représente l'accepteur d'épissage et 2A d'auto-clivage de peptide utilisé pour limiter la puromycine N-acétyl-transférase (PAC) l'expression des gènes à des événements d'intégration ciblée. Le poulet globine β-actine (CAG) promoteur est utilisé pour commander l'expression de EGFP. (B) Le AAVS1 Coffre-port, contenue dans l'intron 1 du gène PPP1R12C, se adresse en utilisant TALENs pour générer une pause d'ADN double brin. Ceci active la recombinaison homologue (RH) des machines de réparation, qui utilise ensuite les (bras d'homologie portant flanquant le site de coupe) AAVS1-CAG-EGFP donateurs comme substrat pour la réparation. La cassette est intégré et le gène PAC est placé sous le contrôle du promoteur endogène PPP1R12C.

Figure 2. Chronologie de gène expérience de ciblage. CSPi sont cultivéesà 70% de confluence et passé ~ 1: 6 à jour -2 (d-2). MEF sont étalées au d-1, et CSPi sont recueillies et transfectées au d0. Au d1, médias est commuté sur NutriStem, et iPSCs sont cultivées pendant deux jours de plus avant de la puromycine est ajouté au milieu à d3. Les colonies sont généralement prêt pour la cueillette par d12. Périodes pendant lesquelles CSPi sont cultivées dans un milieu E8 sont en évidence en vert, alors que les périodes de la culture NutriStem sont en bleu.

Figure 3: gène iPSC ciblage des images représentatives (A) l'image de phase des CSPi de haute qualité.. Remarque la frontière de phase-lumineux et pavée comme la morphologie. (B) DR4 MEF plaqué à 2 x 10 ⁴ cellules / cm ² 24 heures après décongélation. (C) Soixante-douze heures après la transfection, EGFP cellules + sont clairement lorsqu'on les examine sous un micr de fluorescenceoscope. (D) Après sélection basée puromycine pour ~ 14 jours, colonies présentant fluorescence de la GFP uniforme sont assez grands pour être cueillis. (EH) des images représentatives de l'processus de préparation de la colonie. Les colonies sont cueillis aide d'une pipette Pasteur tiré, d'abord en décrivant la colonie, puis par cantonnement à obtenir des amas de cellules plus petites. (I) ramassé colonies iPSC attachent à la surface de la matrice revêtu membrane basale de la plaque 96 puits dans les 2 à 4 h. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: analyse de FACS de l'efficacité de la transfection et CSPi ciblées clonales. (A) contrôle NCRM5 CSPi sans transfection d'un plasmide. (B) NCRM5CSPi transfectées avec le vecteur de test pMax petite-GFP sont FACS analysé pour l'expression de la GFP. (C) L'expression transitoire du plasmide AAVS1-CAG-EGFP est évaluée par FACS. (D) Un NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP clone affiche uniforme d'expression de EGFP positif dosé par FACS. Remarque le regroupement serré des CSPi analysés par rapport à C). (Photo E) fluorescence d'une NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP clone ciblé élargi.

Discussion

Les étapes les plus critiques pour la génération réussie de AAVS1 Coffre-port ciblées CSPi humaines sont: (1) délivrant efficacement Talen et donateurs plasmides dans CSPi par transfection; (2) optimiser la dissociation des CSPi dans des cellules individuelles avant la transfection et le placage densité après transfection; (3) l'optimisation dose et l'heure de la drogue sélection basée sur la croissance de la ligne iPSC; (4) disséquant soigneusement et choisir colonies ciblées et le transfert à la nouvelle plaque / puits. Comparé aux méthodes similaires utilisées dans le document de Hockemeyer ^10, ce protocole utilisé une paire de open-source AAVS1-TALENs, différente iPSC réactif de dissociation, et le dispositif de transfection différente de livrer Talens et donateurs vecteurs, qui a contribué à réduire le nombre de CSPi utilisé dans le expérience tout en réalisant la transfection à haut et en ciblant l'efficacité.

Pour atteindre édition génique à haute efficacité dans les CSPi humaines, il est essentiel de commencer par optimiser la livraison de l'EDI de gèneréactifs Ting (ADN / ARN), tout en équilibrant la mort cellulaire aiguë la méthode de livraison et réactifs causent à CSPi. L'objectif est de maximiser l'efficacité de livraison tout en maintenant un niveau de la mort cellulaire assez faible. Comme il est très facile à préparer de grandes quantités de plasmides AAVS1-Talen qui peuvent atteindre> 50% l'efficacité des ressources humaines avec l'aide de médicament-sélection dans CSPi humaines, il ne est pas nécessaire de faire ARNm de plasmides Talen. Le défi de livraison provient de grandes plasmides donneurs, qui dans ce cas est d'environ 10 kb. Il est recommandé d'utiliser le donateur AAVS1-CAG-EGFP pour tester l'efficacité de la livraison dans les lignes iPSC humaines spécifiques plutôt que d'utiliser pMaxGFP inclus dans le kit de transfection, parce pMaxGFP est un ~ 3,5 kb petite plasmidiques et très facile à livrer entre les cellules. AAVS1-CAG-EGFP donneur peut être modifiée à l'aide des enzymes de restriction de la Figure 1A pour cibler différents transgènes dans locus AAVS1. Un autre donneur de 12 kb, qui contient une cassette de 6,4 kb de remplacer CAG-EGFP, soit afr utilisée avec succès pour réaliser la transfection et de l'efficacité de ciblage similaire (données non présentées). En général, iPSCs humaines sont parmi les types de cellules difficiles à transfecter et l'efficacité d'administration pour les grands plasmides peuvent être aussi bas que 5 à 10% telle que mesurée par analyse de cytométrie de flux de cellules GFP +. En outre l'optimisation de l'efficacité de transfection dépend de la bonne dissociation de iPSCs humains dans des cellules individuelles, car amas cellulaires réduiront la possibilité de délivrer des gènes édition réactifs dans chaque cellule. Ce protocole utilise un réactif doux et rapide travail de dissociation cellulaire, mais le traitement des CSPi pendant plus de 10 minutes ne est pas recommandé. Habituellement la culture iPSC est inférieure à 80% de confluence, si après l'étape 5.1, faisant une incubation de 5 minutes avec préchauffé douce cellules réactif de dissociation généralement suffisante pour dissocier les CSPi en cellules individuelles avec pipetage douce. Si toutes les cellules ne peuvent être dissociées en cellules individuelles après 10 minutes de traitement parce que la culture cellulaire est trop concouramment ou les colonies deviennent très compact, simplement recueillir le nombre recommandé de cellules uniques de plus de puits / plaques et laisser les cellules étroitement attachés derrière. Pipetage lourd ne est pas recommandé car cisaillement mécanique est plus néfaste pour les cellules que la dissociation enzymatique. Lorsque vous travaillez avec CSPi début de passage (avant passage n ° 15), la pratique de dissociation douce est très important pour la survie des cellules parce que les cellules sont déjà plus sensibles au stress de transfection de CSPi de passage fin. Se il est difficile d'atteindre à haute efficacité à la fois dans la transfection et la cellule de survie, choisir la pratique qui donne plus l'efficacité de transfection. Après transfection, les cellules doivent être étalées à la densité qui atteindra 50 à 80% de confluence au jour 3 quand la drogue sélection commence. Depuis chaque ligne iPSC pousse différemment, la densité de placage post-transfection peut avoir besoin d'être optimisé pour chaque lignée cellulaire. Une forte densité de placage peut conduire à une confluence qui réduit l'efficacité de drug-sélection, tandis qu'une densité de placage extrême basse peut provoquer une reprise retardée et la croissance de colonies résistantes aux médicaments. Habituellement 3000000 iPSCs de départ sont suffisamment pour être plaqué en ½ à 2 boîtes de 10 cm en fonction de la survie et la croissance de iPSCs spécifiques. De même, si vous utilisez une ligne iPSC nouvellement généré ou non encore non testé, générant une courbe puromycine kill pour établir la dose efficace la plus faible dans les cellules non transfectées peuvent être nécessaires; lignes iPSC peuvent varier considérablement dans leur sensibilité à la sélection de la puromycine. Les MEF ont été utilisés pour la sélection parce qu'ils semblent soutenir la croissance iPSC mieux que certains matrices extracellulaires pendant la sélection des médicaments. En règle générale, un minimum de cinq jours de puromycine aux jours 1 ug / ml ou 7 à 0,5 ug / ml sont nécessaires pour terminer la sélection. Enfin, la technique de la colonie-picking est crucial de préserver toutes les colonies ciblées après la sélection des médicaments. Pipetage doux ou le traitement de réactif de dissociation aide à briser les colonies en plusieurs morceaux uniformémentdistribué dans le nouveau puits, et donc peut accélérer l'expansion de la colonie. Si vous utilisez un réactif de dissociation de désagréger les colonies cueillies avant le placage, assurez-vous qu'il est suffisamment dilué avec> 10x moyenne après le traitement, parce que le réactif de dissociation résiduelle pourrait tuer les cellules transférées si laissé toute la nuit. Peu importe la technique utilisée, la pratique de prélèvement de colonie avant que les expériences réelles est fortement encouragée.

Comme la stratégie décrite utilise une méthode de piégeage de gènes pour conduire l'expression du gène PAC hors du promoteur PPP1R2C endogène, la cueillette de manière significative plus de 30 colonies ne devraient pas se avérer nécessaire. Le SA-2A liée sélection PAC élimine théoriquement cellules d'intégration seulement aléatoires, mais l'intégration aléatoire supplémentaire (s) peut se produire dans CSPi portant intégrations ciblées réussies. Dans la plupart des cas, près de 100% de clones de médicaments sélectionnés ont ciblé intégrations et ~ 10-40% d'entre eux ont Integrati aléatoire supplémentaireons. La majorité des clones ciblés ont tendance à avoir un seul allèle ciblage, bien que des expériences dans laquelle> 50% ciblage double allèle ne se produit. La fréquence variable des intégrations aléatoires supplémentaires, ainsi que le rapport de ciblage unique par rapport à l'allèle double, est difficile à contrôler. Par conséquent, la cueillette ~ 20 colonies est recommandé de veiller à simple ou double allèle ciblage seule clones peuvent être obtenus. À la lumière des expériences de ciblage infructueuses, ré-évaluation des taux transfectabilité, la survie et la croissance des cellules cibles, l'efficacité des nucléases dans la lignée cellulaire spécifique, et la qualité de donateurs et de nucléases préparations est fortement recommandé avant de re-tenter l'expérience dans son intégralité.

Il convient de noter que des stratégies similaires donateurs gène pièges peuvent être utilisés pour cibler d'autres gènes actifs, mais ne est pas adapté pour le ciblage de gènes silencieux qui nécessite un promoteur indépendant pour diriger l'expression du gène de sélection. Aussi, alors que ee AAVS1 sphère de sécurité est considéré comme ayant la structure de la chromatine ouverte, cela ne garantit pas que tout transgène peut être fortement exprimée à ce locus. En effet, notre récent rapport a montré que plusieurs promoteurs faibles étaient incapables de diriger l'expression du gène rapporteur fluorescent détectable après intégration ciblée au locus AAVS1 ^14.

Ce protocole porte sur l'utilisation TALENs bien validés pour cibler un locus de sphère de sécurité bien étudié dans le génome humain. Les techniques sont hautement reproductibles et facilement adaptable à de nombreuses applications impliquant un transgène. Comparé aux méthodes d'ingénierie du génome en utilisant intégrations aléatoires, AAVS1-TALEN gène médiation ciblage est très efficace et spécifique, et dans le cas des CSPi, les résultats dans les cellules de manière stable fluorescentes qui ont le potentiel d'élargir et de se différencier en ne importe quel type de cellule humaine. Bien que ce protocole ne décrit pas la conception et la validation des nucléases de créateurs ou de l'évaluation des colonies iPSC ciblées pour pl'intégration de la cassette Roper et analyse hors-cible, plusieurs excellents protocoles ont décrit ces aspects de la méthodologie en détail ^16-18. Les iPSC la culture et des passages techniques sans alimentation en utilisant un milieu-E8 sont également décrits en détail dans la publication précédente ^19. Le protocole ci-dessus, tout optimisée pour plus de gène dans le AAVS1 Coffre-port de CSPi humaines, peut servir de modèle général pour les expériences impliquant spécifique au site nucléase médiation gène édition / addition à l'aide d'un donneur de recombinaison homologue dans ne importe quel type de cellule.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml	Corning	354230	Store at -20 °C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Store at 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Store at 4 °C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Store at 4 °C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 and 52638

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061