Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Chitosan / Störande RNA nanopartiklar Medierad geners uttryck i sjukdom Vector mygglarver

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52523
Automatic Translation
*1, *2,3, 3,4, 1, 3,4, 5, 2,3,4
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver vi ett förfarande för att inhibera genfunktion i sjukdoms vektor myggor genom användning av kitosan / interfererande RNA nanopartiklar som intas av larver.

Abstract

Vector myggor fogar mer mänskligt lidande än någon annan organism - och döda mer än en miljon människor varje år. De mygga genomprojekt underlättas forskningen i nya aspekter av mygga biologi, inklusive funktionella genetiska studier i den primära afrikanska malaria vektor Anopheles gambiae och denguefeber och gula febern vektor Aedes aegypti. RNA störningsfri (RNAi-) medierad geners uttryck har använts för att rikta gener av intresse i båda dessa sjukdomsvektormyggarter. Här beskriver vi en ordning för beredning av kitosan / störande RNA nanopartiklar som kombineras med mat och intas av larver. Denna tekniskt okomplicerad, hög genomströmning, och relativt billig metod, som är kompatibel med långa dubbelsträngat RNA (dsRNA) eller små störande RNA (siRNA) molekyler, har använts för att framgångsrikt knockdown av ett antal olika gener i A. gambiae och A. aegyptilarver. Efter larv matning, knockdown, vilket verifieras genom QRT-PCR eller in situ hybridisering, kan kvarstå åtminstone genom den sena puppstadium. Denna metod kan tillämpas på en bred variation av mygga och andra insektsarter, inklusive skadedjur inom jordbruket, liksom andra icke-modellorganismer. Förutom dess användbarhet vid forskningslaboratoriet, i framtiden, kitosan, en billig, icke-toxisk och biologiskt nedbrytbar polymer, skulle potentiellt kunna utnyttjas inom området.

Introduction

Blod utfodring vektor myggor av Anopheline och Aedine släkten sänder sjukdomsframkallande ämnen som är ansvariga för flera av de värsta gissel mänskligheten. Uppskattningsvis 3,4 miljarder människor riskerar för upphandlande malaria, som ansvarar för över en halv miljon dödsfall årligen i hela världen. Malaria resultat från infektion av Plasmodium sp. Parasiter, som överförs till människor genom bett av infekterade myggor av släktet Anopheles, inklusive den huvudsakliga afrikanska vektorn Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , Aedes aegypti är den primära mygga vektor för denguevirus, som orsakar denguefeber, en ospecifik febersjukdom som är den mest utbredda och betydande arboviral sjukdomen i världen 2014) 1.. Dengue-viruset är för närvarande ett hot mot> 2,5 miljarder människor i tropikerna, med en årlig incidence på cirka 50 miljoner fall resulterar i ~ 24.000 dödsfall årligen ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Trots den förödande globala konsekvenser myggburna sjukdomar på människors hälsa, är effektiva medel för att förebygga och behandla dessa sjukdomar saknas. Mygga kontroll är för närvarande den bästa metoden för att förebygga sjukdomar.

Potentialen för styrning leddjur burna sjukdomar genom genmanipulation av smittspridande insekter har erkänts i över fyra decennier 3. Transgena stammar av A. aegypti konstruerad för att ha en undertryckbar hona specifik flight fenotyp nyligen har gjort möjligheterna att använda transgena vektorkontrollstrategier verklighet 4-6. Dessa framsteg har utmanat forskare att identifiera nya genetiska mål för vektorkontroll och ytterligare medel för att manipulera geners funktion i vektor myggor. Ändring av genuttryck dnder utveckling, vilket var fallet i kvinnoflightless myggor 4, kan främja klarlägga nya strategier vektorkontroll. Men till stor del på grund av tekniska utmaningar, funktioner mycket få gener har karakteriserats under utvecklingen av A. gambiae, A. aegypti, eller andra myggarter.

Sedan upptäckten C. elegans 7, RNA-interferens (RNAi), som är bevarad hos djur, växter och mikroorganismer, har i stor utsträckning använts för funktionella genetiska studier i en mängd olika organismer, inklusive insekter 8,9. Den RNAi vägen initieras av Dicer, som klyver långa dsRNA till korta 20-25 nukleotid-långa siRNA som fungerar som sekvensspecifika störande RNA. siRNA tystnad gener som kompletterar i sekvens genom att främja avskrift omsättning, klyvning, och störningar i översättning 9. Långa dsRNA molekyler (vanligtvis 300-600 bp) eller anpassade siRNA riktade en particulaR-sekvensen kan användas i forskningslaboratorium för att tysta varje gen av intresse. Genom att hantera när störande RNA levereras, kan forskarna styra den tid vid vilken gen tysta invigda. Denna fördel är användbart eftersom det kan användas för att övervinna utmaningar som utvecklings dödlighet eller sterilitet, vilket kan hindra produktion och underhåll av stammar som bär ärftliga mutationer, en dyr och arbetskrävande process som ännu inte är tillgänglig i alla insektsarter. Även graden av geners uttryck med RNAi kan variera från gen till gen, vävnad till vävnad och djur till djur, är RNAi i stor utsträckning för funktionell analys av gener i mygg och andra insekter 8,9.

Tre störande RNA leveransstrategier har använts i myggor: mikroinjektion, blötläggning / lokal applicering och förtäring. För en detaljerad historia och jämförelse av användningen av dessa tre tekniker i insekter, se Yu et al 8. We har framgångsrikt använt mikroinjektion 10 som ett medel för att leverera siRNA att rikta utvecklingsgener i A. aegypti embryon, larver och puppor 11-14. Detta kräver dock arbetsintensiva leveransstrategi både en mikroinjektion setup och en skicklig hand. Dessutom är mikroinjektion stressigt för organismen, en confounding faktor, speciellt när beteende fenotyper kommer att bedömas. Slutligen kan mikroinjektion leverans inte utvidgas till området för vektorstyrning. Som ett alternativ, blötläggning av organismen i interfererande RNA-lösning har också blivit ett populärt sätt att inducera gentystande, eftersom det är bekvämt och kräver lite utrustning eller arbetskraft. Blötläggning har främst använts i insekts cellinje studerar 8, men i en ny studie, var knockdown uppnåtts i A. aegypti larver nedsänktes i en lösning av dsRNA 15, som djuren tycktes vara inges. Men för studier med analys av flera Experimental grupper eller fenotyper är blötläggning ganska kostsamt. Lopez-Martinez et al. 16 beskrivs rehydrering driven RNAi, en ny metod för störande RNA leverans som innebär uttorkning i saltlösning och rehydrering med en enda droppe vatten innehåller störande RNA. Detta tillvägagångssätt gör skära kostnader i samband med hela djuret nedsänkning, men är dyrare än mikroinjektion och får begränsas i sin ansökan till arter som tål höga osmotiska tryck. Dessutom är det svårt att föreställa sig hur nedsänkning eller uttorkning / rehydrering nedsänkning metodik skulle kunna anpassas för smittospridare i området. Av dessa skäl, för post-embryonala studier, är leverans av störande RNA med intagen föda ett lönsamt alternativ strategi.

Även intag baserade strategier inte fungerar i alla insektsarter, kanske främst Drosophila melanogaster, har oral tillförsel av störande RNA blandat med mat främjas gen silencing i en mängd olika insekter 8,17, inklusive A. aegypti vuxna 18. Vi beskrev kitosan nanopartikel-medierad RNAi i A. gambiae larver 19 och har framgångsrikt tillämpat detta tillvägagångssätt för reduktion av genuttryck i A. aegypti larver 20,21. Här, metodik för detta RNAi förfarande, vilket innebär inneslutning av störande RNA genom polymer kitosan, är detaljerad. Chitosan / störande RNA nanopartiklar bildas genom självorganisering av polykatjoner med störande RNA genom elektrostatiska krafter mellan positiva laddningar av aminogrupper i kitosan och negativa laddningar som bärs av fosfatgrupper på ryggraden i störande RNA 19. Det förfarande som beskrivs är kompatibel med både långa dsRNA molekyler (nedan kallat dsRNA) eller dubbelsträngade siRNA (nedan kallat siRNA). Efter syntes kitosan / störande RNA nanopartiklar blandas med larver mat och levereras tilllarver vid förtäring. Denna metod är relativt billigt, kräver lite utrustning och arbetskraft 19, och underlättar hög genomströmning analys av flera fenotyper, inklusive analys av beteenden 20,21. Denna metod, som kan anpassas för gentystande studier i andra insekter, bland andra vektorer sjukdoms och insekts skadedjur inom jordbruket, skulle potentiellt kunna användas för geners uttryck i en mängd andra djurarter. Dessutom kunde kitosan, en billig, giftfri och biologiskt nedbrytbar polymer 22, potentiellt utnyttjas inom området för artspecifika myggkontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. myggarter och Uppfödning

  1. Bibehåll A. gambiae G3 och A. aegypti Liverpool IB12 stammar (som används i de representativa studier nedan) eller andra stammar av intresse enligt standard lab praxis eller som beskrivits tidigare 23,24.

2. dsRNA och siRNA design och produktion

  1. Design primrar för att konstruera långa dsRNA mallar specifika för genen av intresse. Använd E-RNAi verktyget 25. Producera dsRNA enligt metoden av val eller som tidigare beskrivits 19.
    1. För en negativ kontroll, syntetisera dsRNA 19 motsvarande sekvensen av grönt fluorescerande protein (GFP), β-galaktosidas (β-gal), eller någon annan gen uttrycks inte i myggor. Om så önskas, kan dsRNA 19 utnyttjas för att generera de representativa resultat som sammanfattas nedan användas som en positiv kontroll. Store dsRNA löstes i RNas-fritt vatten vid -80 °; C tills det behövs.
  2. Alternativt, design genspecifik siRNA enligt standard lab praxis eller som beskrivits tidigare 10. Förvränga sekvensen av en knockdown siRNA att designa negativ kontroll siRNA som inte motsvarar någon mygga gen. Köpa anpassade siRNA, som är tillgängliga via ett antal välrenommerade leverantörer.
    1. Om så önskas kan siRNA 20,21 utnyttjas för att erhålla de representativa resultat som sammanfattas nedan användas som positiva kontroller. Store siRNA löstes i RNas-fritt vatten vid -80 ° C tills de behövdes.

3. Förberedelse Kitosan / störande RNA Nanopartiklar

  1. Samla pre-made RT 100 mM natriumsulfat (100 mM Na 2 SO 4 i avjoniserat H2O) och 0,1 M natriumacetat (0,1 M NAC 2 H 3 O 2 -0,1 M ättiksyra, pH 4,5 i avjoniserat H2O) buffertar.
  2. Lös kitosan (≥75%deacetylerad) i 0,1 M natriumacetatbuffert för att göra 0,02% (vikt / volym) arbetslösning och hålla lösningen vid RT före användning.
  3. Lös dsRNA eller siRNA i 50 l avjoniserat H2O och lägga till den i 100 mM natriumsulfat buffert för att göra en 100 pl lösning av 32 pg av dsRNA / siRNA per 100 pl 50 mM natriumsulfat.
  4. Lägg 100 pl av kitosanlösning till dsRNA / siRNA-lösning och sedan värma blandningen i ett vattenbad vid 55 ° C under 1 min. Sätt upp en kontroll genom att tillsätta 100 pl av 50 mM natriumsulfat till 100 ul av kitosanlösning och följa samma förfarande.
  5. Omedelbart blanda lösningarna i 30 sek med hög hastighet vortex vid RT för att underlätta bildandet av nanopartiklar.
  6. Centrifugera blandningen vid 13000 xg under 10 min vid RT, efter vilken tid en pellet ska vara synliga. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör. Lufttorka pelleten för ≈10 min vid RT innan du använder den för att förbereda mygga mat.
  7. Measure koncentrationen av dsRNA / siRNA i supernatanten med hjälp av supernatanten från kontroll (se 3.5) som en tomt för att beräkna den totala mängden dsRNA / siRNA som återstod i supernatanten. Använd skillnaden mellan utgångsbelopp dsRNA / siRNA och belopp som återstår i supernatanterna för att beräkna andelen dsRNA / siRNA infångad i nanopartiklarna. Denna laddningseffektivitet är normalt över 90%.
  8. Upprepa samma procedur om fler nanopartiklar behövs. Använd de torkade nanopartiklar omedelbart. Effekterna av kylförvaring av partiklar före användning har inte utvärderats.

4. Förberedelse Mosquito mat innehåller Chitosan / störande RNA Nanopartiklar

  1. Bered 1 ml av en 2% -ig lösning (vikt / volym) i avjoniserat vatten, smälta agarosen, och hålla smält agaroslösningen i en 55 ˚C vattenbad före användning.
  2. Blanda fisklivsmedels flingor (47% råprotein, min. Råfett 10%, max. Råa fibern 3%) och torrjäst vid enförhållande av 2: 1 (vikt / vikt). Mal blandningen till små partiklar med en mortel och mortelstöt (tveksam genom nr 50 USA standardtestsikt). Använd marken livsmedel, som bör vara brunaktig till färgen, antingen omedelbart eller förvara den i en sluten behållare vid 4 C i flera veckor.
  3. I ett 1,5 ml rör, blanda 6 mg mark mat med de torkade nanopartiklar från avsnitt 3.7 med en tandpetare.
  4. Lägg 30 pl 2% pre-smält agarosgel lösning på livsmedelsnanopartikelblandning; rör omedelbart och grundligt med hjälp av en tandpetare eller pipettspets.
  5. Använd gelen innehåller mat och nanopartiklar för att mata mygglarver omedelbart. Alternativt, när gelen är helt stelnat vid RT, lagra gelén vid 4 ° C och använd nästa dag, eller vid -80 ° C för senare användning.

5. Utfodring mygglarver med mat innehållande Chitosan / störande RNA Nanopartiklar

  1. Matning A. gambiae mygglarver:
    1. Ta en siOPIC gel pellets från 1,5 ml rör med hjälp av en tandpetare och skär den i 6 lika stora skivor med en ren rakblad eller tandpetare.
    2. Överför 20 tredje instar larver till en 500 ml petriskål innehållande 100 ml avjoniserat vatten.
    3. Mata mygglarver genom tillsats en skiva av gelén pelleten (finhackad i mindre bitar) per petriskål gång dagligen i fyra dagar. Var noga med att följa larver livnär sig på pellets, som bör minskas betydligt i storlek eller helt frånvarande från nästa dag. Efter tiden, kommer myggorna utvecklas till sent fjärde stadiet larver.
    4. Spela några synliga fenotypiska förändringar under försöket. Undersök transkriptnivåer och andra fenotypiska förändringar som diskuteras i avsnitt 6 i slutet av de fyra dagars period.
  2. Matning A. aegypti mygglarver:
    1. Skär gelen pelleten i 6 lika stora skivor med en ren rakblad eller tandpetare.
    2. Placera 50 ålders synkroniserade 24 timmar efter ägg kläckning fiförsta stadiet larver i en petriskål i ≈40 ml avjoniserat vatten.
    3. Feed larver en skiva per petriskål i 4 timmar / dag, sedan överföra larver tillbaka till den vanliga larver kosten 2: 1 mark fisk mat flingor och torrjäst för resten av dagen. Upprepa proceduren dagligen under de fyra larv instars.
    4. Undersök transkriptnivåer och andra fenotypiska förändringar som diskuteras i avsnitt 6 vid de önskade utvecklings tidpunkter.

6. Bekräftelse av Gene Knockdown

  1. Relativ avskrift kvantifiering av QRT-PCR i A. aegypti och A. gambiae larver.
    1. Utför och analysera QRT-PCR-analyser med tre biologiska replikat på minst 10 poolade styrning kontra experimentell larver som beskrivs 11,19,20, eller enligt standard lab förfarande. Representativa resultat finns beskrivna.
    2. För analys av en viss vävnadstyp / kroppsdel ​​(dvs., Hjärna eller antenn), perform QRT-PCR enligt beskrivningen i 6.1.1 efter dissekering för att återvinna vävnaden av intresse (se exempelvis Mysore et al. 21).
  2. Bekräftelse av knockdown genom hybridisering in situ
    1. Syntetisera digoxygenin-märkt antisense och känner styr riboprober enligt standard lab praxis eller som beskrivs 26.
    2. Kör in situ hybridisering per den Haugen et al. 27 protokoll för bekräftelse av knockdown som beskrivits tidigare 11,20 och diskuteras i representativa resultat avsnittet nedan.
  3. Bekräftelse av knockdown genom immunhistokemi
    1. Om antikroppar mot proteinprodukten av genen riktade finns, utföra immunohistokemi som tidigare beskrivits 28, vilket underlättar identifiering av personer med de största nivåerna av knockdown för fenotypanalys 20 som exemplifieras i representative resultat nedan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A. gambiae:

Kitosan / dsRNA nanopartiklarna bildas på grund av den elektrostatiska växelverkan mellan aminogrupperna hos kitosan och fosfatgrupperna i dsRNA. Effektiviteten av dsRNA inkorporering i nanopartiklar är vanligen över 90% mätt med utarmning av dsRNA från lösningen. Atomkraftsmikroskopi bilder visar att kitosan-dsRNA partikelstorleksmedelvärden 140 nm i diameter, som sträcker sig från 100 till 200 nm (fig 1).

Figur 1
Figur 1. Nanopartikel bildning av kitosan och störande RNA. Atomkraftsmikroskopi avbildar av kitosan / dsRNA nanopartiklar (A) eller kitosan-lösning utan tillsats av dsRNA (B). Storleken på bilderna var 1,0 um × 1,0 um. Skalstreck = 250 nm.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Utfodring av dessa partiklar som kombineras med standard larver mat och införlivas i agaros stödjer normal larvutveckling. Viktigt är specifik knockdown av ektoderm-derived AgCHS1 avskrifter samt midgut specifika AgCHS2 (Figur 2) möjliga 19, vilket visar att dsRNA tas upp genom intag av nanopartiklar initierar RNAi bortom midgut. Knockdown effektivitet ≈40-60% observerades (t.ex.., Figur 2) och varierar mellan avskrifter.

Figur 2
Figur 2. Transkription nivåer kitinsyntas 2 (AgCHS2) efter dsRNA intag i <em> A. gambiae larver. Relativa mRNA nivåer av AgCHS2 i larver utfodras med nanopartiklar med ds AgCHS2 eller kontroll ds GFP. Data presenteras som medelvärde ± SD från tre oberoende biologiska replikat. Olika bokstäver på staplarna indikerar signifikanta skillnader utifrån parade t-tester (P = 0,003).

Knockdown av AgCHS1 signifikant minskade totala kitin halten i fjärde stadiet larver och ökade känslighet för kitin synteshämmare insekts den, diflubenzuron 19, Knockdown av AgCHS2 ökade signifikant effekt kalkofluor vitt och ditiotreitol som störde peritrophic matrisen (PM) i fjärde stadiet larver (Figur 3) som resulterar i ökad dödlighet 17.

Figur 3
AgCHS2 intas nanopartiklar på A. gambiae peritrophic matris (PM) permeabilitet. Calcofluor vit eller DTT behandling stör PM A. gambiae larver som ytterligare exuberated av AgCHS2 knockdown genom intag av kitosan / dsRNA nanopartiklar 19. (A) Mosquito med intakt PM. (B) Mosquito med störd PM, dextran blå läcker in i magsäcken ceacae.

A. aegypti:

Kitosan / siRNA nanopartiklar användes för att rikta axonet vägledning genen semaforin-1a (sema1a) under A. aegypti larvutveckling 20. Knockdown av sema1a bekräftades genom in situ-hybridisering, vilket detekterade reducerade nivåer av sema1a i ≈60% av larv hjärnor assEssed och misslyckades med att upptäcka sema1a uttryck i ≈40% av knockdown djur hjärnor (Figur 4C vs B, gula pilspets indikerar Antenn lob). QRT-PCR-analyser utförs på poolade hela djur avslöjade att denna teknik resulterade i 32 ± 10% minskning av sema1a transkript jämfört med kontroll-nanopartiklar matade djur (figur 4A; P <0,01 baserat på parade t-test, n = 5, där N är antalet biologiska replikat). Knockdown i hjärnan kvarstod genom åtminstone 24 h av PUPP utveckling, vilket framgår av förlusten av anti Sema1a antikroppsexpression (figur 4E1 vs D1), som användes för att identifiera djur med betydande knockdown under larv och PUPP olfaktoriska fenotyp analyser. Larv och PUPP Antenn lob defekter (kvantifierade i tabell 1) detekterades i sema1a knockdown larver och puppor (figur 4E2, E3 vs. (figur 4E2 vs D2, visualiserades med mAbnc82; överlag av båda signalerna visas i figur 4D3, E3). Jämförbara fenotyper genererades med två separata sema1a knockdown siRNA, vilket bidragit till att säkerställa att de konstaterade bristerna inte var resultatet av off-site inriktning antingen siRNA. De högsta nivåerna av knockdown genererades när siRNA kombinerades, en strategi som kan användas för att öka knockdown effektivitet (se Mysore et al. 20 för mer information).

Figur 4
Figur 4. Chitosan / siRNA inducerad knockdown av sema1a i utvecklingsluktsystemet A. aegypti. QRT-PCR (A) och in situ hybridisering (B, C) ​​bekräftade knockdown av sema1a i larver analyser matas en blandning av sema1a inriktning siRNA 890 och siRNA 1198 kitosan / störande RNA nanopartiklar vs. kontrollnanopartiklar. Förlust av Sema1a uttryck resulterade i glomeruli som deformeras (E1-3 vs D1-3). Se text för detaljer. Dorsal är upp i alla paneler. Skalstreck = 25 | im. Denna siffra ursprungligen i Mysore m.fl. 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Larver Puppor
siRNA n <strong> Vildtyps AL defekter n Vildtyps AL defekter
Kontroll 69 69 (100%) 0 (0%) 68 68 (100%) 0 (0%)
sema1a KD 77 42 (54,5%) 35 (44%) * 75 51 (68%) 24 (32%) *

Tabell 1. Kvantifiering av Antenn lob defekter efter sema1a knockdown. En samman sammanställning av resultaten för kontroll siRNA vs. sema1a knockdown (KD) siRNA 890 + siRNA 1198 kitosan nanopartiklar matad djur från totalt åtta upprepade experiment utförda i både larver ( vänster) och puppor (höger) visas. Den totalaantal individer som bedöms (n) och nummer / procentandelen djur för vild typ morfologi vs. Antenn lob (AL) defekter (luktreceptor neuron inriktningsdefekter, defekt neuropil och glomeruli bildnings) indikeras. Knockdown verifierades immunohistokemiskt med anti-Sema1a antikropp färgning i en delmängd av djur (15 larver och puppor 10) som visade de mest allvarliga defekter (betecknas med *). Alla knockdown djur utvärderade på detta sätt befanns ha minskat halterna av Sema1a, medan Sema1a nivåer i kontrollmatade djuren inte var märkbart förändrats. Denna tabell ursprungligen i Mysore m.fl. 20.

I en andra undersökning 21, kitosan / siRNA nanopartiklar användes för att rikta transkriptionsfaktorn Single sinnade (Sim) under utvecklingen av luktsystemet. QRT-PCR-analyser med poolade hjärnor dissekerade från hela djur visade att sim knockdown hjärnor hade i genomsnitt en 47% Reductividare i sim avskrifter i jämförelse med styra nanopartiklar matade djur (P = 0,005 utifrån parat t-test). Jämförbara assayer med antenner avslöjade i genomsnitt en reduktion i sim nivåerna 77% i förhållande till kontroll-matade djur (P = 0,002 baserat på parade t-test). Trots viss variabilitet i nivåerna av knockdown mellan vävnader och djur, var sim transkript detekterades inte genom in situ hybridisering i ≈50% av knockdown djurhjärnor / antenner efter behandling med endera av två olika knockdown siRNA (figur 5B2, B3, C2, C3 kontra B1, C1, tabell 2). I jäst beteendeanalyser under vilka individer som lockades till jäst tilldelades en poäng på 1, medan djur som inte lockades gavs poängen 0, genomsnittliga poängen för sim 430 eller SIM var si 718 knockdown djurgnificantly lägre än den hos kontrollmatade djur i två replikat experiment (figur 5A; P <0,001 baserat på parade t-test). Defekt lukt spårning beteende (figur 5A) korrelerade med minskade nivåer av sim i antennerna (figur 5B2, B3 vs. B1) och hjärnor (Figur 5C2, C3 vs C1, gula prickar markerar omkrets Antenn lob; se tabell 2 för kvantifiering av resultat). Flera brister identifierades i antenner och antennal lober sim knockdown djur (se Mysore m.fl. 21. För detaljer). Exempelvis sim knockdown larver och puppor saknade uttryck av Orco, den obligat samreceptor för samtliga luktreceptorer i luktreceptor neuroner (Figur 6). Minskade Orco transkriptnivåer upptäcktes hos individer som utfodrats med sim 430 ( Figur 6A3, B3) eller sim 718 (figur 6A4, B4) knockdown (KD) kitosan / siRNA nanopartiklar (jämför med vildtyp djur i figur 6A1, B1 och kontrollera kitosan / siRNA nanopartiklar matad djur i figur 6A2, B2). Förlusten av Orco uttrycks fenotyp observerats i L4 (figur 6A1-A4) kvarstod genom minst 24h efter PUPP bildning (figur 6B1-B4).

Figur 5
Figur 5. sim knockdown larver show defekt lukt attraherande beteende. In situ hybridisering visade reducerade nivåer av sim-RNA i antenner (B2, B3) och hjärnor (C2, C3) av sim 430 och sim 718 knockdown djur (jämför styra matad i B1, C1), som misslyckades med att svara på jäst luktämnen lock (A). Se text för detaljer. De proximala ändarna av antenner är orienterade uppåt i B1-B3. Dorsal är orienterad uppåt i C1-C3. Skalstreck = 25 | im. Denna siffra ursprungligen i Mysore m.fl. 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Förlust av Orco uttryck i utvecklings A. aegypti antenn efter knockdown av sim. sänkta nivåer av Orco transkript upptäcktes hos individer fed med sim 430 (A3, B3) eller sim 718 (A4, B4) knockdown (KD) kitosan / siRNA nanopartiklar (jämför med vildtyp djur i A1, B1 och kontrollera kitosan / siRNA nanopartiklar matad djur i A2, B2). Se text för detaljer. Skalstreck = 25 | im. Denna siffra har sammanställts från bilder publicerade i Mysore m.fl. 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Lockade Inte Lockade
siRNA n # Djur Normal Måttlig Null # Djur Normal Måttlig Null
Kontroll 195 196 (100%) 196 (100%) 0 0 0 0 0 0
sim 430 KD 176 63 (35%) 48 (76%) 15 (24%) 0 113 (64%) 20 (18%) 12 (11%) 81 (71%)
sim 718 KD 177 66 (37%) 44 (66%) 22 (34%) 0 111 (63%) 20 (18%) 9 (8%) 82 (74%)

Tabell 2. Nivås av sim korrelerar med larv prestanda i en jäst beteendeanalys. En samman sammanställning av resultat som erhållits i fyra jästluktämnen lock replikera experiment visas. Det totala antalet djur (n) indikerar antalet individuella larver som testades i dessa beteendemässiga analyser. Antalet individuella larver (# Djur) som lockade (vänster, djur som rörde jästen pellets och tilldelades en poäng på 1) eller inte lockat (höger, djur som inte berör jästen pelleten och fick en poäng på 0) under varje tillstånd (kontroll, sim 430 KD, eller sim 718 KD kitosan / siRNA nanopartikel-matade) visas, och andelen totala djur ingår efter rå numren. Knockdown av sim bedömdes genom in situ hybridisering i hjärnan och antenner av djur lockade (vänster) eller inte lockat (höger) till jästen. Denrå antal / andel individer med normal (jämförbar med vildtyp sim transkriptnivåer), Null (ingen observerbar sim avskrift), eller måttlig (minskas men inte vildtyp) sim nivåer indikeras. Förlust av sim korrelerade väl med en brist på attraktion till jästen. Denna tabell ursprungligen i Mysore m.fl. 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den kitosan / störande RNA nanoparticle metodik som beskrivs här har använts för att effektivt nå gener under larvutveckling i A. gambiae (figurerna 2, 3) och A. aegypti (figurerna 4, 5, 6, tabellerna 1, 2). Kitosan nanopartiklar kan framställas med antingen långa dsRNA eller siRNA, som båda har använts med framgång i myggor vilket framgår av de representativa resultat som beskrivs häri. Syntes av dsRNA är billigare än att köpa siRNA, men är mer arbetsintensiv. Om kitosan / siRNA används, kan fenotyper bekräftas med flera siRNA, vilket möjliggör bättre garantier för att fenotypen avtäckt inte beror på off-site inriktning. Dessutom kan den kommersiella produktionen av siRNA en masse bättre lätta utbyggnaden av kitosan / störande RNA tyst för artspecifika myggkontroll till fältet. Detta kommer naturligtvis att kräva vinna obstalarna som kostnad och leverans.

Även om vi har haft god framgång med detta protokoll, måste metoder optimeras för varje gen. Därför rekommenderar vi att du testar flera siRNA, eller kanske en siRNA och en lång dsRNA, i början av ett nytt projekt. När fenotyper identifieras och bekräftas med minst två distinkta siRNA motsvarande en gen av intresse, kan det vara lämpligt att kombinera dessa siRNA att öka fenotyp penetrans (Figur 4). Tidpunkten och även varaktigheten av kitosan / störande RNA matdags kan optimeras för varje studie. A. gambiae trivs när utfodras endast med kitosan / störande RNA mat som beskrivs här. Emellertid, i de experiment som vi har utfört hittills, A. aegypti har inte klarat sig bra utan extra näring, ett problem som vi har övervunnit genom att överföra dem till en diet av vanlig mat efter 4 h av kitosan / störande RNA utfodring. Experimentera med kitosan / störandeRNA leverans i en annan livsmedelssubstrat, som vi ännu inte har försökt, kan kringgå detta problem. Vi har funnit att 4 h dagliga utfodringar under loppet av flera dagar resulterar i en bra balans mellan knockdown och tillräcklig näring, men modifiering av varaktighet utfodring kunde drivas vidare enligt önskemål. Dessutom kan larv stadiet där kitosan / störande RNA nanopartiklar utfodring initieras / fortsatt skräddarsys för varje experiment beroende på den kritiska utvecklingsperiod under vilken gen funktionen undersöks, en stor fördel med detta protokoll.

Kontroll av knockdown är naturligtvis kritisk, men kan också kräva felsökning. Av denna anledning kan det vara bra att samtidigt kontrollera om fenotyper intresse genereras som knockdown effektivitet utvärderas. För QRT-PCR valideringsexperiment, är det kritiskt att primrar och PCR-förhållanden är optimerade. Dessutom är det viktigt att djur är utvecklingsmässigtsynkroniserad i början av experimentet, som uttryck för vissa avskrifter kan vara mycket dynamisk under utveckling och på grund av dygnsrytm 29. Dessutom medan denna teknik genererar klart knockdown utanför tarmen, vi är bara i början för att bedöma de vävnader som denna teknik är effektiv, och kan variera mellan olika arter. Det kommer därför att vara användbart för att mäta knockdown i synnerhet vävnader, vilket kan uppnås genom att dissekera vävnader av intresse från hela djur för QRT-PCR-analyser eller genom in situ hybridisering (Siffror 4-6) 20,21 och immunohistokemi (Figur 4) 20 analyser (se Haugen et al. 27 och et al. Clemons 28, respektive för felsökning dessa protokoll). Eftersom knockdown varierar från individ till individ, är det bra att utföra dubbelmärkningsanalyser för att bedöma fenotyper i kombination med knockdown nivåer (Figure 4) 20, vilket avsevärt underlättar fenotyp karakterisering. För beteendestudier, kan knockdown nivåer i enskilda djur korreleras med sina beteende föreställningar (Tabell 2) 20,21.

Efter kitosan-medierad störande RNA leverans till A. aegypti larver, minskas genuttryck detekterades vid 24 h av PUPP utveckling (figur 4, 6) 20,21. Även nivåerna av genuttryck ännu inte har utvärderats på ett detaljerat sätt bortom denna punkt i utvecklingen, har minskade nivåer av genuttryck upptäckts i både 48 och 72 h A. aegypti puppor (KM, opublicerad). Det skulle vara bra att bedriva mer detaljerade analyser av knockdown nivåer flera stadier av A. aegypti PUPP utveckling och också bedöma A. gambiae puppor. Det skulle också vara intressant att avgöra om knockdown kvarstår hos vuxna och att utforska nanopartikel-medierad iterfering RNA leveransstrategier för vuxna myggor.

Platsspecifik nukleasgen inriktning på metoder har nyligen infört till A. aegypti och A. gambiae och tillåter generering av riktade, ärftliga mutationer i myggor och andra icke-genetiska modellorganismer 30,31. Även användningen av dessa metoder möjliggör jämnare förlust av funktion fenotyp analyser, är en fördel jämfört RNAi strategier, screening för mutationer av intresse fortfarande ganska tidsödande och arbetsintensivt. Även om RNAi förlust av funktionsstudier kräver underhåll av endast vilda stammar typ, muterade mygga stammar måste vara individuellt uppfödda. Underhållet av recessiva letala eller vuxna sterila mutationer närvarande utmanande med tanke på den nuvarande bristen på markerade balancers i myggor. Således, medan platsspecifik nukleasgen inriktning på metoder snabbt ökar i popularitet, kitosan / störande RNA inriktning kan vara den optimalaval för laboratorier som inte är utrustade för att hålla stammarna mygga och i fall där förlust av geners funktion under utveckling är oförenlig med överlevnad av stammen.

Utifrån våra resultat, räknar vi med att kitosan / störande RNA kan användas i stort sett för knockdown av många olika gener under utvecklingen av A. gambiae, A. aegypti, liksom andra insekter, och potentiellt andra icke-genetiska modellorganismer. Framgångsrik geners uttryck med kitosan / störande RNA har rapporterats i andra leddjursarter, inklusive Penaeus monodon (räkor) 32. En nyligen genomförd studie visade att nanopartiklar underlättar upptaget av dsRNA och därmed förbättra knockdown effektivitet jämfört med direkt matning av dsRNA i den asiatiska majsmotten 33, vilket understryker potentialen för att använda denna teknik för att rikta jordbruks- plågor. Den möjliga användningen av siRNA-nanopartiklar som läkemedel hos människor lockar en hel del of intresse i det medicinska samfundet. Et al. Giljohann 34 beskrev syntesen och karakterisering av flervärda RNA-guld nanopartiklar konjugat, som har en sex gånger längre halveringstid jämfört med fria dsRNA och lätt in i celler. Et al. Davis 35 beskrev den första mänskliga klinisk prövning med systemisk administrering av siRNA som använder ett nanopartikelleveranssystem för patienter med solida tumörer, och möjligheten att använda kitosan / siRNA läkemedel nyligen recenserade 36. Således / störande RNA genmålinriktning teknik är chitosan ett värdefullt laboratorieteknik med potential för bredare användningsområden. Framtida forskning kommer att undersöka ytterligare program för denna teknik. Dessutom kemisk modifiering av kitosan och andra polymerer, ett aktivt forskningsområde, kan öka effektiviteten i störande RNA leverans eller tillåta målinriktad leverans till specifika vävnader 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.02 ml pipetteman Rainin PR20 for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman Rainin PR200 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-120 for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman Rainin PR1000 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-046 for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5 TEKnova S0299 to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade BDH VWR BDH3092-500MLP to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade MP Biomedicals LLC. 800668 to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge Eppendorf AG 5415D to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells Sigma-Aldrich C3646-25G to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast Universal Food Corp NA to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool German Cancer Research Center NA for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food Wardley Goldfish FLAKE FOOD to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath Thermo Scientific 51221048 to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice not applicable not applicable for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Name Company Catalog Number Comments
Ice bucket Fisher Scientific 02-591-44 for storage of ice used during the procedure
liver powder MP Biomedicals LLC. 900396 to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven A variety of vendors not applicable to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm) Fischer Scientific 875713 interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter Mettler Toledo S220 for preparation of buffers
Razor blade Fischer Scientific 12-640 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA Thermo Scientific/Dharmacon custom for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) BDH/distributed by VWR VWR BDH0302-500G to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer VWR 61066-046 to measure the water bath temperature
Tooth picks VWR 470146-908 for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer A variety of vendors not applicable for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer Fischer Scientific 02-216-108 for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper Fischer Scientific NC9798735 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
  3. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
  4. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
  5. Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
  6. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
  10. Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  11. Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
  12. Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
  13. Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
  14. Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
  15. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
  16. Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
  17. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
  18. Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  20. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
  21. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
  22. Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
  23. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  24. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  25. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
  26. Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
  27. Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  28. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
  29. Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
  30. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  31. Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
  32. Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
  33. He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
  34. Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
  35. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
  36. Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
  37. Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).

Tags

Molecular Biology vektorbiologi RNA-interferens, DsRNA siRNA knockdown förtäring mygga larver utveckling sjukdomar
Chitosan / Störande RNA nanopartiklar Medierad geners uttryck i sjukdom Vector mygglarver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., … More

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., Michel, K., Severson, D. W., Zhu, K. Y., Duman-Scheel, M. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523, doi:10.3791/52523 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter