Method Article

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

DOI:

10.3791/52523

⸱

March 25th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vektör Sivrisinek başka bir organizma daha çok insan acı indirebilmek - ve bir milyondan fazla insanı her yıl öldürmek. Sivrisinek genom projeleri birincil Afrika sıtma vektörü Anopheles gambiae ve dang ve sarı humma vektör Aedes aegypti fonksiyonel genetik çalışmalar da dahil olmak üzere sivrisinek biyoloji yeni yönleriyle, araştırma kolaylaştırdı. RNA parazitsiz (RNAi-) aracılık ettiği gen susması, bu hastalık taşıyıcıları sivrisinek türlerinin her ikisi de ilgi genleri hedef olarak kullanılmaktadır. Burada, gıda ile birlikte ve larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri müdahale / çitosan hazırlanması için bir prosedür tarif eder. Uzun çift kollu RNA (dsRNA), ya da küçük müdahale edici RNA (siRNA) molekülleri ile uyumlu olan bu teknik basit, yüksek hacimli, ve nispeten pahalı olmayan bir yöntem, A. farklı geninin başarılı bir şekilde demonte kullanılmaktadır gambiae ve A. aegyptiMah-PCR ile veya in situ hibridizasyon doğrulandı larva. larva beslenmeye ardından, demonte, en azından geç pupa aşamasından devam edebilirsiniz. Bu yöntem, bir sivrisinek ve tarımsal zararlıların da dahil olmak üzere diğer böcek türleri, çok çeşitli, hem de diğer olmayan modeli organizmalar için de geçerli olabilir. Araştırma laboratuarında de yararlı ek olarak, gelecekte, çitosan, ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer içinde, potansiyel alanında kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anopheline türü ve aedine cins Kan besleme vektör sivrisinek insanlığın en kötü bela birkaç sorumlu hastalığa neden olan ajanlar iletir. Tahminen 3,4 milyar insan yılda dünya çapında üzerinden bir buçuk milyon kişinin ölümünden sorumlu olan sıtma, sözleşme için risk altındadır. Plasmodium sp enfeksiyonundan Sıtma sonuçları. Başlıca Afrika vektörü Anopheles gambiae (dahil Anopheles cinsi sivrisineklerin enfekte, ısırıkları ile insanlara iletilir parazitler, http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti dang ateşi, dünyanın en yaygın ve önemli ar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sivrisinek Türlerinin ve Yetiştirme

  1. A. koruyun gambiae G3 ve A. aegypti Liverpool IB12 (aşağıda temsili çalışmalarda kullanılan) suşları veya standart laboratuar uygulamaları ya da daha önce 23,24 açıklandığı gibi uygun diğer ilgi suşları.

2. dsRNA'nın ve siRNA Tasarım ve Üretimi

  1. Tasarım primerler ilgi konusu gen için özel uzun dsRNA şablonlar oluşturmak için yerleştirildi. E-RNAi aracını 25 kullanın. Gibi bir seçim ya da yöntemine göre dsRNA üretmek önce 19 tanımladı.
    1. Negatif bir kontrol olarak, yeşil flüoresan proteini (GFP), β-galakt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. gambiae:

Kitosan / dsRNA'nın nanopartiküller bağlı çitosan amino grupları ve dsRNA'nın fosfat grupları arasındaki elektrostatik etkileşim oluşur. çözeltiden dsRNA'nın azalması ile ölçülen nanopartiküller olarak dsRNA dahil verimliliği genellikle% 90 üzerindedir. Atomik kuvvet mikroskopisi görüntüler şunu gösterir ki, 100-200 nm'de (Şekil 1) arasında değişen çap olarak kitosan-dsRNA parçacık boyutu ortalama 140 nm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tarif edilen çitosan / müdahale edici RNA nanopartikül yöntem etkili bir şekilde A. larva gelişimi sırasında hedef genlere kullanılmıştır gambiae (Şekil 2, 3) ve A. aegypti (Şekiller 4, 5, 6, Tablolar 1, 2). Kitosan nanopartiküller olarak burada tarif edilen sonuçları ile kanıtlandığı gibi, sivrisinek olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır, her ikisi de uzun dsRNA veya siRNA, ya da hazırlanabilir. DsRNA'nın Sentezi siRNA satın daha az pahalı, am.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kansas Tarımsal Deney İstasyonu ve K-State Eklembacaklı Genomik Merkezi'nden KYZ'ye sağlanan finansman, A. gambiae19'da kitosan/dsRNA aracılı gen susturmanın orijinal gelişimini destekledi. Burada tarif edilen A. gambiae çalışması, kısmen NIH / NIAID'den KM'ye R01-AI095842 tarafından desteklenmiştir. A. aegypti20,21'de kitosan / siRNA aracılı gen susturmanın geliştirilmesi, MDS'ye NIH / NIAID Ödülü R01-AI081795 ile desteklenmiştir. Bu çalışmanın içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.02 ml pipettemanRaininPR20enterferans yapan RNA'nın resüspansiyonu için
0.2 ml pipettemanRaininPR200interferans yapan RNA'nın resüspansiyonu ve enterferans yapan RNA/nanopartiküllerin hazırlanması için
0.5 ml dereceli tüp Fischer Scientific05-408-120yeniden süspanse edilmiş enterferans yapan RNA'nın alikote edilmesi
1 ml pipettemanenterferans yapan RNA'nın yeniden süspansiyonu ve enterferans yapan RNA/nanopartiküllerin hazırlanması içinRaininPR1000
1.5 ml dereceli tüp Fischer Scientific05-408-046enterferans yapan RNA/nanopartiküllerin hazırlanması için
1M Sodyum Asetat, pH 4.5TEKnovaS0299sodyum asetat tamponu
hazırlamak için, Asetik Asit, AIRSTAR. ACS, USP, FCC SınıfBDHVWR BDH3092-500MLPsodyum asetat tamponu hazırlamak için
Agaroz Genetik Teknoloji SınıfıMP Biyomedikal LLC.Hazırlanan enterferans yapan RNA/nanopartikülleri kaplamak için
800668 SantrifüjEppendorf AG5415Denterferans yapan RNA/nanopartikülleri peletlemek için
Chitosan, karides kabuklarındanSigma-AldrichC3646-25Genterferans yapan RNA/nanopartiküllerin hazırlanması için enterferans yapan RNA ile birleştirmek için
Dry YeastUniversal Food CorpNA, enterferans yapan RNA ile sivrisinek larva yemi hazırlamak için/ nanopartiküller
E-RNAi aracıAlman Kanser Araştırma MerkezidsRNA tasarımı için NA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
Japon balığı yemiWardleyJapon balığı FLAKE FOODenterferans yapan RNA/nanopartiküller içeren sivrisinek larva yemi hazırlamak için
Isıtılmış su banyosuThermo Scientific51221048enterferans yapan RNA/nanopartikülleri 55oC'de ısıtır
Buzuygulanamazenterferans yapan RNA'nın çözülmesi ve enterferans yapan RNA/nanopartiküllerin
[header]
Buz kovasıFisher Scientific02-591-44işlem sırasında kullanılan buzun saklanması için
karaciğer tozuMP Biomedicals LLC.Parazit sonrası sivrisinek larvaları 900396 beslenir RNA/nanopartikül tedavisi sonrası
Mikrodalga fırın2 agaroz çözeltisi hazırlamak içingeçerli olmayançeşitli satıcılar
petrik (100 x 15 mm)Fischer Scientific875713larvalar için enterferans yapan RNA/nanopartikül besleme odası
pH metreTamponların hazırlanması içinMettler ToledoS220
Jiletli bıçakFischer Scientific12-640beslemeler için enterferans yapan RNA/nanopartikül peletini bölmek için
siRNAThermo Scientific/DharmaconsiRNA/nanopartiküllerin hazırlanması içinözel
Sodyum Sülfat, Susuz (Na2SO4)BDH/VWRVWR BDH0302-500Genterferans yapan RNA'nın olacağı 50 mM sodyum sülfat çözeltisi hazırlamak için su
banyosu sıcaklığını ölçmek içinTermometreVWR61066-046
KürdanlarVWR470146-908enterferans yapan RNA/nanopartikül gıda hazırlama ve jel peletlerini kesme sırasında karıştırma için
Ultra düşük dondurucuEnterferans yapan RNA alikotlarının ve enterferans yapan RNA/nanopartiküllerin -80oC'de depolanması içingeçerli olmayançeşitli satıcılar
Vorteks karıştırıcıFischer Scientific02-216-108kitosan/enterferans yapan RNA'nın hazırlanması için
Ağırlık kağıdıFischer ScientificNC9798735beslemeler için enterferans yapan RNA/nanopartikül peletini bölmek için
, için, , , , , , , , , hazırlanması için geçerli değildir % , tarafından dağıtılarak yeniden askıya alınmış, , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
  3. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organizat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chitosan NanoparticlesRNA InterferenceGene SilencingMosquito LarvaeNanoparticle PreparationFood Pellet FormationqRT PCR AnalysisIn Situ HybridizationAedes AegyptiAnopheles Gambiae

Related Articles