Abstract
Les cellules cancéreuses réagissent à la matrice de rigidité mécanique d'une manière complexe en utilisant un hiérarchique système coordonné mécano-chimique composée de récepteurs d'adhésion et les protéines de membrane de transduction de signal associées, l'architecture du cytosquelette et moteurs moléculaires 1, 2. mécanosensibilité de cellules cancéreuses différentes in vitro sont étudiée principalement avec des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires de souris, dérivé avec des cellules non cancéreuses humaines primaires. Par conséquent, on en sait peu sur la mécanosensibilité de cellules de cancer du côlon humains primaires in vitro. Ici, un protocole optimisé est développé qui décrit l'isolement de cellules du colon à partir d'échantillons humains primaires saines et cancéreuses tissus humains chirurgicales. Les cellules du côlon isolés sont ensuite cultivés avec succès sur le doux (2 kPa raideur) et rigide (10 kPa raideur) hydrogels de polyacrylamide et polystyrène rigide (~ 3,6 GPa de rigidité) substrats fonctionnalisés par une matrice extracellulaire (fibronectinedans ce cas). Les microbilles fluorescentes sont incorporées dans des gels mous à proximité de la surface de culture cellulaire, et essai de traction est effectué pour évaluer les contraintes de contraction cellulaire en utilisant le logiciel d'accès ouvert libre. En outre, la microscopie d'immunofluorescence sur des substrats différents de rigidité fournit des informations utiles sur la morphologie de la cellule primaire, l'organisation du cytosquelette et la vinculine contenant adhésions focales en fonction de la rigidité substrat.
Introduction
Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus évident que les micro-environnement mécanique, en plus des facteurs biochimiques, joue un rôle important dans la régulation des fonctions cellulaires. Les cellules peuvent détecter et de répondre à la rigidité du substrat sur lequel elles sont respectées (comme dans la culture 2D) ou entourées par (comme dans la culture 3D) 7.3. En faisant cela, les cellules peuvent moduler leur différenciation 3, 4 morphologie, la migration / mobilité 5, biophysiques propriétés 6, 7 croissance, et d'autres processus.
Les cellules cancéreuses répondent également à la rigidité de la matrice 2D et 3D en utilisant une combinaison coordonnée hiérarchique mécano-chimique de récepteurs d'adhésion et les protéines de membrane de transduction de signal associées, l'architecture du cytosquelette et moteurs moléculaires 1, 2. Par exemple, les cellules epitheliales mammaires (CEM) former parenchyme acineuses normale lorsqu'elles sont cultivées sur des substrats 150 Pa qui est similaire à la rigiditédes tissus mammaires sains. Fait intéressant, ils présentent les caractéristiques d'une tumeur en développement, à la fois structurelles et de transcription, lorsqu'elles sont cultivées sur des substrats rigides (> 5000 Pa) qui imitent la rigidité d'un stroma tumoral 8. En outre, une autre expérience montre que la tumorigenèse mammaire est accompagné par une réticulation du collagène et de raidissement 9 ECM. Des expériences récentes montrent que carcinome du côlon humain HCT-8 () cellules présentent des métastases phénotype (MLP) lorsqu'elles sont cultivées sur des substrats 2D ayant la rigidité physiologiquement pertinente (20-47 kPa), mais pas sur très raide (3,6 GPa) substrats 10- 12 .Ces premières cellules forment des amas de cellules tumorales comme dissocient et puis de l'autre, à partir de la périphérie. Comme cette épithéliale à arrondie morphologique (E à R transition) changement se produit, elles prolifèrent, réduire cellule-cellule et cellule-ECM adhérence, et devenir migratoire. HCT-8 cellules cultivées sur des substrats de polystyrène très durs ne pas exposer ceux-citraits malignes. Ainsi, il a été émis l'hypothèse que HCT-8 cellules deviennent métastatique en raison de leur exposition aux micro-environnement approprié. Il est à noter que ces expériences sont réalisées avec des lignées cellulaires de cancer immortalisées ou des cellules primaires de souris, dérivé avec des cellules non cancéreuses humaines primaires.
Une étude récente propose que le stress augmentée de traction cellulaire peut être utilisé comme une signature biophysique potentiel pour les cellules métastatiques 13 .Le étude consiste à mesurer la force de traction de différentes lignées de cellules cancéreuses humaines sur des gels de Polyacrylamide. On constate que les cellules cancéreuses métastatiques peuvent exercer une contrainte sensiblement plus élevé de traction par rapport aux cellules non métastatiques 13 dans tous les cas. Cependant, ces résultats contredisent directement les résultats publiés précédemment sur murins lignées cellulaires dérivées du cancer du sein 14. En outre, une étude récente met en évidence des différences notables entre les cellules humaines immortalisées et primaires dans leur remodelage du cytosquelette proprofilage protéine et la survie cellulaire expression de la protéine 15. Par conséquent, il est important de revenir sur la plupart des tests biophysiques traction, y compris pour les cellules cancéreuses humaines primaires. Cela permettra de répondre à la question de savoir si les cellules primaires récapitulent immortalisée lignées cellulaires de cancer tendance de traction.
Le protocole décrit ici est optimisée pour l'isolement de cellules primaires humaines du côlon (à la fois saines et cancéreuses), et pour les cultiver sur des substrats mous (hydrogels de Polyacrylamide), ainsi que sur des boîtes de Pétri. Le protocole est basé sur la digestion enzymatique et dissociation consécutive de l'échantillon de tissu chirurgical en suspension de cellules individuelles 16. A notre connaissance, ceci est la première démonstration de la culture isolée tumeur primaire du colon et de cellules normales directement sur des substrats souples d'hydrogel avec microbilles fluorescentes embarqués pour la traction cytométrie. Substrats de gel transparent permettent également immunocoloration. Cette analyse a révélé des différences dans l'organisation F-actine etadhésions focales dans les cellules du côlon humaines primaires que les changements de rigidité du substrat. Cette plate-forme de culture cellulaire ouvre la possibilité d'explorer diverses propriétés biophysiques des cellules humaines primaires telles que la rigidité des cellules et de traction en tant que paramètres de pronostic du cancer.
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Protocol
Le protocole décrit ci-dessous suit les lignes directrices de l'UIUC comité d'éthique de la recherche humaine.
1. Collecte et digestion de l'échantillon de tissu chirurgical
- Recueillir l'échantillon de tissu tumoral juste après la résection du côlon (figure 1A et 1B). Prélever des tissus sur un site sain adjacent ainsi.
- Transférer le tissu immédiatement dans un flacon de 15 ml contenant 12 ml de solution HBSS. Conserver le flacon sur la glace à l'intérieur d'une boîte de mousse isolante.
- Transporter le tissu contenant flacon à une culture capot de tissu pour un traitement ultérieur dans les 45 min. Conserver le flacon sur un bloc de glace à l'intérieur du capot.
- Verser le tissu fourni dans une plaque à 6 puits contenant 6-7 ml de solution HBSS aide d'une pipette.
Remarque: Montant de tissu par puits est pas critique dans cette étape de rinçage. - Conservez la plaque à 6 puits sur un bloc de glace. Rincer deux fois le tissu dans une solution HBSS.
- Coupez le tissu proprement en sections séparées avec scis stérilessor. Mince tissu en sections plus petites ne dépassant pas 1 à 2 mm de taille 3 avec une lame de scalpel stérile.
- Peser 0,1% de trypsine un flacon étiqueté (contenant 1 ml de solution de trypsine 0,1%) avant de transférer le tissu. Transférer ~ 20 mg de tissu dans chacune des fioles de trypsine 0,1% de avec une pipette.
- Essayer de minimiser le transfert de HBSS dans le flacon de la trypsine afin d'éviter une dilution supplémentaire de la trypsine.
- Peser les flacons de la trypsine après transfert de tissu; documenter la différence que la masse tissulaire.
- Verser ~ 20 mg de tissu et de 1 ml de trypsine dans chaque puits d'une plaque à 24 puits.
- Mettez la plaque à 24 puits sur un agitateur dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant 16-20 h. Pendant cette période d'attente ou à une date antérieure, préparer polyacrylamide substrats de gel et de les fonctionnaliser avec des protéines d'ECM comme décrit dans la section 3.
2. Dissociation enzymatique de l'échantillon de tissu dans une cellule unique Suspension et culture de cellules isolées sur ECM fonctionnalisés élastique Substrates et des boîtes en polystyrène rigide
- Après 16-20 h d'incubation dans de la trypsine et à 4 ° C sur agitateur, transférer à partir de tissu 4 ° C trypsine à 4 ° C complet flacon de milieu de croissance (contenant 3.2 ml de milieu de croissance complet) à l'aide d'une pipette. Assurer le transfert minimale de trypsine dans des milieux de croissance.
Remarque: formulation complète de milieu de croissance est la suivante: milieu RPMI 1640 additionné de base avec du sérum de cheval à une concentration finale de 10% et de la pénicilline-streptomycine à 1% de la solution totale. - Placez le tissu contenant flacon de médias dans un bain d'eau chaude à 37 ° C pendant 12-15 min.
- Transférer le tissu à un flacon de 15 ml contenant une solution HBSS aide d'une pipette, secouez doucement.
- Répétez 2.3.
- Retirer le tissu de la solution HBSS et transfert à 0,1% solution de collagénase (dans HBSS) flacon contenant 1 ml de solution. Incuber pendant 45 min à 37 ° C et 5% de CO2 dans un environnement humidifié incubateur de culture cellulaire. Pendant la période d'attente, growt chaudeh médias dans un flacon de 15 ml à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Tirez sur tous les fragments de tissus en pipette minimisation collagénase report. Ejecter seulement les fragments de tissus dans des flacons de milieux de culture préchauffées.
- Placer un filtre de 40 um bien insert dans chaque puits d'une plaque à 6 puits. Humidifier le filtre avec 1 ml de milieu de culture cellulaire.
- Tissus triturer dans les médias avec une pipette de 10 ml en verre plusieurs fois jusqu'à ce que le tissu est complètement dissocié.
- Maintenir l'embout de pipette le plus près possible de la base du flacon.
- Déposer la solution sur le filtre pour éliminer les débris et les parties non dissociées.
- Centrifugeuse filtré suspension de cellules dans un milieu à 150 g pendant 5 min à température ambiante.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension après culot de cellules avec 2 ml de milieu de culture frais.
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre (si nécessaire). Graine isolé des cellules primaires sur la matrice extracellulaire (ECM) fonctionnalisés et des gels de polystyrène plats à la concentration souhaitée.
3. Préparation et fonctionnalisation des différentes raideurs de polyacrylamide (PA) Gels et polystyrène substrats
Remarque: Pour la démonstration visuelle de l'article 3, les téléspectateurs / lecteurs sont appelés à une récente Journal of Visualized Experiments (JoVE) l'article 17.
- L'adoption de protocoles publiés 18, 19, 12 mm 2 activent couvercle en verre glisse chimiquement pour assurer la liaison covalente de l'hydrogel.
- Tout d'abord, couvercle en verre glisse avec plaisir 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) pour 7 min à température ambiante.
- Retirer l'ATS complètement avec DI rinçage à l'eau et traiter couvercle glisse avec 0,5% de glutaraldéhyde (dilué dans de la solution PBS Glutaraldehyde boursier de 70%) pour 30 min.
- Obtenir deux solutions de gel kPa en mélangeant 5% en poids / solution d'acrylamide v et 0,05% de N, -methylenebisacrylamide (bis) solution N '10 mM dans une solution saline tamponnée au HEPES 20. Utilisation 8% p / v d'acrylamide et 0,13% N, -methylenebisacrylamide (bis) solution N 'dans 10 mM de solution saline tamponnée HEPES 10 kPa 20 gel.
- Dans les deux cas, utiliser 1: 200 persulfate d'ammonium (10% p / v) et 1: 2000 N, N, N ', N' -tetramethylethylenediamine (TEMED) comme initiateur et de catalyseur pour le procédé de polymérisation, respectivement.
- En outre, ajouter 100 ul perles fluorescentes à 2 solution de gel kPa comme marqueurs fiduciaires 21, 22.
- Déposez une goutte de 20 pi de solution de gel PA pré-polymère sur le 12 mm 2 activé couvercle en verre de glissement. Placez un autre 12 mm 2 régulière lamelle de verre sur la chute. Assurez-vous que la baisse se propage entre les lamelles par capillarité. Inverser le sandwich à deux gels kPa afin d'assurer que la plupart des billes viennent à proximité de la surface de culture cellulaire.
- Guérir le gel PA pendant 45 min à température ambiante.
- Décoller la lamelle supérieure en utilisant un seul rasoir de bord.
Remarque: Lors de l'épluchage, le détachement procède d'un borddu sandwich. Le gel reste adhérente à la lame de verre activée. - Stocker les gels dans une solution de PBS avant utilisation.
- Fonctionnaliser gels PA et le verre avec des molécules d'ECM, la fibronectine humaine à une concentration de 50 pg / ml 23 méthodes suivantes publiées.
- En bref, des substrats incuber avec 2 ml d'hydrazine hydrate pur O / N.
- Retirer l'hydrate d'hydrazine et bien rincer les substrats avec de l'eau DI.
- Laver les substrats avec de l'acide acétique à 5% pendant 30 min.
- Éliminer l'acide acétique et bien rincer les substrats avec de l'eau DI.
- Gardez les substrats immergés dans l'eau DI pendant 30 min.
- Incuber les substrats avec la fibronectine oxydé pendant 35 min à une concentration de 50 ug / ml.
- Rincer les substrats avec PBS sur agitateur à bas régime pendant 10 min.
- Incuber tous les substrats à 37 ° C dans 2-3 ml de milieu de culture pendant 30 min avant l'étalement des cellules.
Remarque: cellules de la plaque dans un peu peuplerd manière (1.000-3.000 cellules / cm 2). Chaque bordereau de verre gel-couvert doit être contenue dans une boîte de Pétri de 35 mm. Permettre aux cellules d'adhérer complètement avant toute microscopie (au moins O / N).
4. Traction microscopie à force et immunofluorescence Microscopie dosages
- Traction Force Microscopy Assay
- Trypsine-EDTA / solution chaude de 0,25% à 10% de SDS à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 10 minutes avant le début des essais de traction.
- Retirer un gel de l'incubateur de culture cellulaire à un moment et placer sur la platine du microscope fluorescent inversé (grossissement 32X).
- Trouver une seule cellule dans le champ de vision. Retirez le couvercle plat Petri.
- Prenez une image de contraste de phase de cellule (par exemple, la figure 3).
- Changez le mode d'imagerie à fluorescence et de sélectionner un filtre approprié. Ne déplacez pas la platine du microscope ou de l'échantillon pendant ce temps.
- Prenez une image de l'perles fluorescentes displaced par traction cellulaire (figure 4C).
- Ajouter la solution / SDS 1 ml de trypsine à boîte de Pétri pour détacher la cellule de gel. Ne déplacez pas la platine du microscope ou de l'échantillon pendant ce temps. Aussi, prenez une image de contrôle de la cellule pour assurer l'élimination complète du gel.
- Prenez une image de référence (force nulle) des billes après la cellule est supprimée.
- Répétez les étapes 4.1.2-4.1.8 pour tous les autres gels.
- Faire une pile d'images utilisant ImageJ des deux images acquises à l'étape 4.1.6 et 4.1.8 pour chaque cas. Pour générer la pile d'images, utilisez la séquence suivante de commandes dans ImageJ après l'ouverture des images: Image → → Stacks Images à empiler.
- Pour obtenir le champ de déplacement et de traction, utiliser des plugins ImageJ suivante méthodes publiées 21, 22 Obtenir des codes et des tutoriels détaillés pour ces plugins en utilisant le lien suivant:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
- Alignez les images de la pile en utilisant le plugin 'Matching Template'. Utilisez la séquence suivante de commandes dans ImageJ après l'ouverture de la pile de l'image générée à l'étape 4.1.10: Plugins → Template Matching → Aligner les tranches dans Stack → OK. Enregistrer la pile de l'image en conséquence. Utilisez cette nouvelle pile d'images dans les étapes suivantes.
- Obtenir le champ de déplacement en utilisant la PIV (vélocimétrie par images de particules) plugin (Figure 4D). Utilisez la séquence suivante de commandes après l'ouverture de la pile de l'image sauvegardée à l'étape 4.1.11.1: Plugins → → itératif PIV PIV (de base) → OK → Accepter cette PIV et la sortie → OK. Enregistrer la sortie de PIV dans le même répertoire que dans la pile de l'image originale. Utilisez-le comme entrée à l'étape suivante.
- Enfin utiliser (transformée de Fourier traction cytométrie) le FTTC plug-in pour obtenir la carte de traction (figure 4E). Utilisez la séquence suivante de commandes: Plugins → → FTTC Insert les propriétés des matériaux, à savoir, le module de Young et le coefficient de Poisson de PA gel → OK → Sélectionnez le fichier de sortie de PIV enregistré à l'étape 4.1.11.2 → OK. Sauvegarder FTTC résulte dans le même répertoire que dans la pile d'image et sortie PIV.
- Immunofluorescence Microscopie dosages
- Prenez les substrats à immunocolorées à la hotte laminaire et retirez le support de culture.
- Rincer les substrats avec du PBS et on fixe les cellules avec du paraformaldehyde à 4% dans du PBS pendant 20 min à température ambiante.
- Laver les substrats avec du PBS pendant 3 fois (5 min à chaque fois). Par conséquent, incuber les substrats avec 500 ul Amplificateur de signal pendant 30 minutes et rincer avec du PBS.
- Incuber les cellules avec un anticorps monoclonal anti-vinculine à une dilution de 1: 250 dans du PBS pendant 45 min à température ambiante. Laver les substrats avec du PBS pendant 3 fois (5 min à chaque fois).
- Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire Alexa Fluor 488 IgG de chèvre anti-souris à une dilution de 1: 200dans du PBS à température ambiante pendant 30 min. Laver les substrats avec du PBS pendant 3 fois (5 min à chaque fois).
- Pour visualiser la structure F-actine, incuber les cellules avec la phalloïdine TRITC conjugués à une concentration de 50 ug / ml pendant 45 min à température ambiante. Laver les substrats avec du PBS pendant 3 fois (5 min à chaque fois).
- Image les échantillons en utilisant microscope confocal à balayage laser (figure 5A - 5D).
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Representative Results
Le protocole décrit ci-dessus est utilisé avec succès pour plusieurs échantillons de tissus (n = 12) de quatre patients différents selon les lignes directrices de la commission d'examen institutionnel. Figure 1A illustre une tumeur colorectale représentant tout de suite après la chirurgie à partir de laquelle on obtient des coupes de tissus pour les cultures de cellules. Une section typique de tissu dans une solution HBSS après le transfert de la hotte laminaire pour un traitement supplémentaire est représenté sur la figure 1B. Un schéma de digestion enzymatique et dissociation de l'échantillon de tissu chirurgical en suspension cellulaire unique est représenté sur la Figure 2.
Après dissociation des tissus succès, les cellules humaines primaires isolées sont ensemencées sur des gels d'AP et des boîtes en polystyrène. Des micrographies en contraste de phase (figure 3A et 3B illustrent la morphologie) représentatif d'un cancer du côlon humain primaire et les cellules normales en fonction de la rigidité substrat. Il est évident queles cellules du côlon primaire (à la fois saines et cancéreuses) se propagent plus sur des boîtes de polystyrène par rapport aux gels PA (Figure 3a et 3b).
essais de traction sont effectués sur ECM (fibronectine) Soft Coated 2 gels kPa après la confirmation de l'adénocarcinome invasif du pathologique coloration H & E (figure 4A). Des gels d'AP sont uniformément revêtues de fibronectine comme représenté sur la figure 4B. Pour faciliter la comparaison, toutes les expériences de traction pour la tumeur et les cellules du côlon en bonne santé doivent être effectués dans le même temps. Figure 4C montre un instantané des billes fluorescentes nanométriques intégrées à l'intérieur du gel. A partir des images déplacées et perles de référence, les champs de déplacement sont obtenus en utilisant le plugin ImageJ PIV 21, 22. Un champ de déplacement de perles représentant généré par les cellules tumorales du côlon envahissantes sur 2 gel kPa est affiché dans la figure 4D. Figure 4E montre traction stress obtenue en utilisant le plugin ImageJ FTTC correspondant au déplacement champ dans la figure 4D 21, 22.
La figure 5 montre la F-actine et la vinculine contenant adhésions focales de cellules primaires du colon humaines sur les deux gels mous kPa et des substrats rigides de polystyrène. Aucune fibre d'actine était présent dans les cellules de propagation moins sur gels doux (Figure 5A1 - 5A2). vinculine ponctuée contenant adhésions focales sont présents sur des gels mous (figure 5B1 - 5B2). Inversement, les cellules primaires montrent la morphologie ainsi propagation, fibres de stress d'actine bien définies et des adhérences discrètes allongées focaux sur des substrats rigides de polystyrène (figures 5C - 5D).
Figure 1. (A) la tumeur après résection du côlon. sections (B) de tissus de la tumeur pour l'isolement cellulaire. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Schéma de la digestion et de la dissociation enzymatique de l'échantillon de tissu chirurgical dans suspension cellulaire unique. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. culture de cellules du côlon humain primaire réussie (à la fois le cancer et la normale) sur différents gels de rigidité et de polystyrène plat. Images à contraste de phase montrent tyPical morphologie de (A) Les cellules tumorales et (B) Les cellules normales sur différents substrats de rigidité. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. (A) coloration H & E confirmant adénocarcinome invasif. (B) de la fibronectine montre que la coloration des gels sont uniformément revêtues de molécules de la MEC. Perles (C) Nanoscale intégrés à l'intérieur du gel comme marqueurs fiduciaires. (D) de champ de déplacement représentant généré par cellule tumorale sur gel PA douce utilisant PIV plugin dans ImageJ comme décrit dans 4.1.11.2. (E) le stress de traction exercée par la cellule tumorale sur gel mou correspondant au déplacement domaine (D) obtenu via la fiche FTTC dans ImageJ comme décrit dans 4.1.11.3. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. La coloration par immunofluorescence de la F-actine et la vinculine sur gel mou et sur des substrats durs de polystyrène. Aucune fibres d'actine était présent dans la propagation (A1) cellule tumorale ou moins (A2) cellule normale sur deux gels mous kPa. vinculine ponctuée contenant adhésions focales sont présents sur des gels mous (B1 - B2). Inversement, les cellules primaires montrent la morphologie ainsi propagation, fibres de stress d'actine bien définies (C1 - C2) et les adhésions focales allongées discrètes (D1 - D2) sur des substrats rigides de polystyrène.2 / 52532fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Effort de traction cellulaire a récemment émergé comme un indicateur potentiel biophysique de l'état métastatique 13. Cependant, aucune donnée expérimentale de traction avec des cellules tumorales primaires existe dans la littérature à ce jour. En outre, la culture directement isolées les cellules du côlon primaire sur différents gels rigidité de polyacrylamide est pas encore signalé. Par conséquent, nous établissons un système optimisé côlon primaire conditions de culture cellulaire sur des gels et polystyrène (Figure 2). Les microbilles fluorescentes encapsulation près de la surface de culture cellulaire pendant la préparation du gel mou permet la mesure de champ de déplacement et la traction générée par les cellules humaines primaires (Figure 4C, 4D et 4E). En outre, des tests d'immunofluorescence peuvent fournir des informations importantes concernant l'organisation du cytosquelette et adhésions focales que les changements de rigidité du substrat (figure 5A - 5D). Notez que différente cancer et cellulaire normale immortaliséelignes montrent également augmentés propagation, actine sous contrainte de faisceau et mûrissent adhésions focales allongées avec une rigidité accrue du substrat 4, 24-25.
Le protocole peut être facilement adoptée / modifiée pour l'isolement de cellules primaires à partir de tissus chirurgicaux des différents organes humains ou d'autres animaux. Le temps d'incubation du tissu dans les agents de dissociation - la trypsine et la collagénase - doit être optimisé empiriquement pour chaque application. En outre, la taille de filtre pour éliminer les débris et les parties de tissu non dissociées est également un paramètre important de choisir en fonction de la taille attendue maximale de la cellule à l'état suspendu (40 um de ce protocole).
Une limitation de la méthode est que quelques gels mous peuvent manquer de localisation cohérente des billes fluorescentes près de la surface de culture cellulaire (section 3.3) qui peuvent nuire à la traction suivante mesures de cytométrie (section 4.1). Ceci peut être facilement contourné en examinantla surface du gel et de la distribution de densité en utilisant la microscopie à fluorescence bourrelet avant la culture cellulaire. Par conséquent, les gels avec une distribution de talon relativement non homogène peuvent être jetés. Une autre approche consiste à utiliser une méthode récemment proposée qui permet une localisation précise des bourrelets proches de la surface de culture cellulaire 17.
Il faut être prudent de commencer à traiter les échantillons chirurgicaux dès qu'ils sont reçus, de préférence dans les 45 minutes. L'étape la plus critique dans le protocole est le temps d'exposition optimum du tissu dans la solution de trypsine et de la collagénase pour obtenir un rendement d'isolement, tout en conservant la viabilité cellulaire suffisante. Avant de cultiver les cellules d'hydrogels mous, la densité et la distribution cordon doit être confirmée en utilisant la microscopie à fluorescence. En outre, une image de force nulle doit être acquise après avoir confirmé que la cellule soit complètement détaché de la surface du gel.
En résumé, le protocole est décrit qui resultats dissocié des cellules individuelles suspension de l'échantillon chirurgicale cancéreuse / tissu normal. Cet isolement des cellules tumorales primaires simples à partir de prélèvements chirurgicaux suivis par leur culture sur des substrats durs et mous permet différentes mesures biophysiques en aval, par exemple, une raideur de cellule en utilisant l'AFM, rhéologie intracellulaire en utilisant des particules microinjectés, la migration cellulaire / motilité et l'analyse de la dynamique des vésicules. Ces mesures peuvent être utilisées pour le pronostic du cancer. Le protocole a été utilisé avec succès pour l'extraction et la culture des cardiomyocytes murins et 26. La méthode présentée ici peut être utilisé pour isoler les cellules humaines primaires à partir de tissus chirurgicaux de divers organes et à la culture directement sur le substrat de rigidité différente pour les études de mécanobiologie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N-methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 | |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
