Protocol
BEMÆRK: forsøg med mus blev udført i overensstemmelse med den institutionelle dyrevelfærd udvalg (IACUC) retningslinjer.
1. Tilberedning af Rag-1 - / - Mus med I N Vitro Cultured Th17 celler (Tre dage før infektion)
- For etablering Th17 celler, kultur CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- naive T-celler (3 x 104) i U-bund plader med 96 brønde alene eller co-kultur dem sammen med 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + tregs i nærværelse af opløseligt α-CD3 (1 pg / ml), α-CD28 (2 ug / ml) antistoffer og antigenpræsenterende celler under Th17 betingelser (polariseret ved hjælp af IL-6 (25 ng / ml), TGF-β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) og α -IL-4 (2 ug / ml)) i tre til fire dage.
BEMÆRK: Naive celler og T regs blev sorteret ved anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) end magnetisk celle isoleringsprocedurer og dyrket som tidligere beskrevet 19-22. - På dag 4 efter resuspendering af Th17 celler ved anvendelse af pipette, samle dem fra kulturer, og centrifugere dem under sterile betingelser.
- Tag en lille portion af disse celler til at undersøge deres levedygtighed og fænotypebestemmelse. Resuspender dem i 500 pi RPMI-medium tilsættes propidiumiodid (200 ng / ml) og vurdere deres levedygtighed umiddelbart ved flowcytometri. Udfør fænotypebestemmelse ved flowcytometri vurdering af IL-17A produktion efter restimulering (se afsnit 6.3).
- Centrifuger og vask Størstedelen af cellerne i sterilt PBS ved 480 xg i 6 min ved 4 ° C i alle de trin, medmindre andet er angivet.
- Brug disse celler til adoptiv overførsel til 6-8 uger gamle CD45,2 RAG1 - / - immundefekte mus.
- Resuspender cellerne ved 1 x 10 7 celler / ml celletæthed med kold steril PBS.
- Indsprøjtes 100 pi af cellerne ved intraperitoneal injektion, ved hjælp af 25 g nåle på 1 ml tuberkulin sprøjter, således at en mus modtager 1 x 10 6 celler. Nogle mus får PBS eller Th17-celler kun vejledende, og andre mus får Th17 celler, som blev co-dyrket med Treg celler.
BEMÆRK: Udfør alle trin aseptisk.
2. Voksende C. albicans for infektion (en dag før infektion)
- Før inokulering dispergere fem kolonier af CAF2-1 C. albicans laboratoriestamme i 100 pi sterilt PBS suspension og tilføje suspensionen til steril bouillon.
- Podes 5 kolonier af C. albicans i 50 ml af gærnitrogenbase (YNB uden aminosyrer) / Peptone / dextrose næringsmedium og inkuberes i en rysteinkubator ved 30 ° C i 15-18 timer ved 130 rpm.
- Overvåg bouillon til uklarhed, som er en indikation for vækst af svampen.
3. CandidaHøst og Counting Procedure (på dagen for infektion)
- Saml 10 ml Candida bouillon i 15 ml rør. For større mængder, indsamle Candida i 50 ml rør.
- Centrifuger blastosporer ved 1900 xg i 5 min ved stuetemperatur i alle de trin, medmindre andet er angivet. Pelletere blastosporer ved centrifugering, efterfulgt af fjernelse af supernatanten.
- Hvis der er mere end et rør, pool Candida blastosporer fra flere rør, tilføjer sterilt PBS til pellets og resuspender dem i 10 ml PBS til tælling.
- Tag 20 pi blastosporer i 1,5 ml mikrocentrifugerør, tilsættes 20 pi af 2X paraformaldehyd og inkuberes ved stuetemperatur i 15-20 min. Tæl faste blastosporer hjælp af hæmocytometer under mikroskopet.
BEMÆRK: Paraformaldehyd er kræftfremkaldende. Åbn ufortyndet opløsning kun i stinkskab. - I mellemtiden gentage vask blastosporer mindst to gange ved centrifugering tkant i PBS, og pelletering af blastosporer. Hold pillerne i 15 ml rør ved stuetemperatur, i ABSL1 hætte, klar til infektion.
- Efterlad nogle steril PBS ved stuetemperatur i opblandes Blastosporerne for infektion.
- Efter optælling tilsættes sterilt PBS til blastospore pellet at justere gær blastospore celletal til 2 x10 8 af gærceller / ml. Dette er blastospore suspension, der vil blive anvendt til at inficere musene.
BEMÆRK: Udfør alle trin aseptisk.
4. Mus infektion (3-5 dage efter Cell Transfer)
BEMÆRK: Den grundlæggende infektion procedure udføres som beskrevet tidligere 19,23-25.
- / - - Mus, der fik PBS eller cellerne tre dage tidligere i Rag-1 afvejes.
- Beregne dosis af anæstesimidler ved hjælp af deres kropsvægt. Bedøve musene ved indgivelse ketamin / xylazin-blanding (16,1 mg / ml og 1,6 mg / ml) ved anvendelse af 25 g nåle på 1 ml tuberkulin sprøjter ved intraperitoneal injektion.
- Injicer 50 pi per 10 gram legemsvægt. (Dvs. 0,8 mg ketamin og 0,08 mg xylazin / 10 g legemsvægt eller 80 mg ketamin og 8 mg xylazin pr kg legemsvægt henholdsvis). Der observeres for tå knivspids respons hver 15 min efter anæstesi.
BEMÆRK: Denne dosis vil fremkalde 60-90 min på anæstesi, hvilket er nok til infektionen procedure. - Påfør ophthalmisk smøremiddel salve i øjnene af mus for at forhindre hornhinder tørrer ud. Øjet smøremiddel kan tørre ud, gentag oftalmisk smøring hver 45 min.
- Injicer 50 pi per 10 gram legemsvægt. (Dvs. 0,8 mg ketamin og 0,08 mg xylazin / 10 g legemsvægt eller 80 mg ketamin og 8 mg xylazin pr kg legemsvægt henholdsvis). Der observeres for tå knivspids respons hver 15 min efter anæstesi.
- Injicer 1 ml saltvand (0,9% NaCl) subkutant på ryggen støder op til forben at hjælpe rehydrering af musene under bedøvelse.
- Anskaf en ny, ren bur. Følg infektion procedure en mus ad gangen, placerer hver mus ind i det nye bur Når smittet. Udfør PBS / fingeret infektion først, og derefter gå videre til de Candida infektion groups.
- Saml den bedøvede mus og åbne munden bred til at afsløre bunden af tungen.
- Placer en 3 mm diameter vat mættet med 50 pi PBS eller blastospore suspension, sublingualt i mundhulen i 90 min. Flip musene hver 15 min og bagside for at forhindre lunge overbelastning og sikrer, at vatkugler ikke bevæge sig.
- Oprette en timer til hver mus for at sikre 90 min af Sham eller Candida podning i mundhulen.
- Opbevar dem i et bur under varmelampe (4 meter væk), og hver mus på varme gel pads.
- Sørg for, at tungen trækkes tilbage inde og væk fra tænderne, for at undgå tænder sønderriver tungen.
- Ved afslutningen af 90 min, fjerne vat fra mundingen af musen. Hold øje med enhver mus, der måtte komme fra anæstesi hurtigere end 75 minutter. I et sådant tilfælde, bedøver dem igen med ketamin (40 mg / kg) alene.
5. Indlæg procedure Overvågning (i løbet af 90 min Anæstesi)
- Brug varme gel pads i 90 min anæstesi.
- For at opretholde kropstemperaturen og for at forhindre kvælning, tillader ikke mus til at inddrive på den almindelige majs-kolber mus sengetøj.
- Efter genvinding fra anæstesi, administrere yderligere 1 ml sterilt 0,9% NaCl subkutant to steder på bagsiden.
- Hold dig fem PBS (fingeret) podet mus pr bur. House kun 1-2 inficerede mus pr bur.
- Udfyld procedure kort med initialer hver dag efter den procedure, at notere ændringerne i kropsvægt, grooming vaner og generelle sundhed.
6. Vurdering af Inflammation
6.1) Vægttab
- Musene afvejes hver dag i løbet af infektion, der begynder på dagen forud for infektion procedure.
BEMÆRK: Typisk immunsvækkede mus injiceret med Th17 celler og uden T regs bukke under for 20-30% Vægttab som følge af øget svampe byrde 19 og forværret inflammation.
6.2) Histologi scoring af tungen
- Sacrifice musene ved CO 2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation.
- Åbn kæberne og dissekere ud tungen med en saks og pincet. Brug stump pincet til at holde tungen, og ved hjælp af saksen nå ud til bagsiden af munden incise bagenden af tungen.
- For immunocytokemisk hematoxylin og eosin (H & E) farvning af tungen væv, skylles tungen væv med iskold PBS. Der tilsættes 5 ml 10% formalin til 2-3 tunger og løse dem O / N i 15 ml rør.
- Den næste dag fjernes formalin og fordybe væv i 5 ml 70% ethanol for at forhindre hyper-fiksering. Send dem ud til kommerciel drift at fortsætte med paraffin indlejring, sektionering og farvning af paraffinsnit.
BEMÆRK: Kommerciel histologi service bruges til at udføre disse trin. - Når dias er tilbage fra den kommercielle histologi service, kvalitet betændelse ved at observere vævssnit under et lysmikroskop.
- Score fra 0 til 5, hvor 0 er ingen betændelse, og 5 er det mest alvorlig betændelse. Score betændelse ved hjælp af tabel 1.
6.3) Cytokinproduktion af Th17 celler
BEMÆRK: Overdreven TNF-α produktion er en af de udlæsninger for overdreven immunpatologi. Når mus adoptivt overført med Th17 celler kun bevirker immunpatologi, der er forbundet med overdreven TNF-α produktion i Th17 celler.
- Saml en enkelt cellesuspension fra milt, lymfeknuder, axillære lymfeknuder og tunge, ved anvendelse af tidligere beskrevne fremgangsmåder 19,26.
- Restimulere cellerne med phorbolmyristatacetat (PMA) (50 ng / ml) og ionomycin (500 ng / ml) i 4 timer med Brefeldin A (10 ug / ml) tilsat i last 2 timer. Vask cellerne med PBS og løse dem ved hjælp af en kommerciel Fiksering / permeabilisering kit ifølge producentens anvisninger.
- Udfør intracellulær cytokin-farvning ved anvendelse af fluorokrom-konjugeret anti-TNF-α, anti-IL-17A og ROR-yt-antistoffer som beskrevet tidligere 19.
- Kort fortalt resuspenderes celler i 1X permeabilisering buffer med cocktail af anti-TNF-α, anti-IL-17A og ROR-yt antistoffer hvert antistof på 2-3 ug / ml slutkoncentration.
- Inkubér cellerne i 1 time ved stuetemperatur.
- Efter inkubation vaskes cellerne med 1X permeabilisering buffer.
- Resuspender cellepelleten i 500 pi PBS med 0,5% bovint serumalbumin for flowcytometri analyse.
- Den næste dag fjernes formalin og fordybe væv i 5 ml 70% ethanol for at forhindre hyper-fiksering. Send dem ud til kommerciel drift at fortsætte med paraffin indlejring, sektionering og farvning af paraffinsnit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne model, både Candida -inficerede mus og uinficerede mus i Rag-1 - / - immundeficient baggrund blev adoptivt overført med Th17 celler 3-5 dage før infektionen. I alt 10-12 mus blev anvendt til forsøgene, med 2 mus i hver Sham inficeret grupper og 4-5 i hver af Candida inficerede grupper. Naive celler blev afledt fra kongene Thy 1.1 eller CD45,1-mus, således at injiceret Th17 celler blev sporet i vivo under anvendelse af Thy 1.1 eller CD45,1 farvning (figur 1A). Co-overførte T regs blev afledt fra CD45,2 mus at skelne dem fra CD45,1 Th17 celler. For nogle forsøg, CB-17 SCID Thy1.2 recipientmus, Th17 donorceller opnået fra Thy 1.1 Balb / C-mus og T regs opnået fra kongene Thy1.2 mus blev anvendt. Kun Candida inficerede mus, men ikke den ikke-inficerede mus udviste rekruttering og udvidelse af rekonstitueret CD45,1 + (figur 1A). Resultaterne repræsenterer data fra en mus i hver gruppe.
Kun i de mus, der co-overført med T regs blev Foxp3 + CD45,1 negativ CD4 + celler påvist i CLN. Dette viser, at de injicerede T regs også blev rekrutteret til stedet for infektion (figur 1B). Resultaterne repræsenterer data fra en mus i hver gruppe. Betragtninger smittet Rag-1 - / - tabe sig og rettede sig efter 4 dages infektion, gjorde kortison immunsupprimerede mus ikke gendanne men længere tabte vægt, som vist tidligere 27. Begge grupper af mus, der modtog Th17 celler i nærvær eller fravær af T regs tabte vægt i første omgang. Men de mus, der modtog T regs genvundet fra vægttab og løst, infektionen. 2 mis blev brugt i Sham inficeret gruppe og 4 i hver Candida inficerede gruppe. Der var 3 mus i kortison gruppe. De mus, der modtog Th17 celler kun tabte vægt progressivt (figur 2) 19. Nogle af musene i denne gruppe måtte aflives. Disse resultater viser den gennemsnitlige vægt af alle musene i denne gruppe. Selvom der kræves neutrofiler til den indledende clearance af infektionen, deres fortsatte tilstedeværelse og rekruttering i vævet er et tegn på uløste inflammation. Derfor neutrofil infiltration blev undersøgt i det inficerede tungen, ved at bestemme udtryk for en neutrofil markør, Gr-1, på senere tidspunkter, såsom dag-7 efter infektion. Mus, som modtog Th17 celler kun havde højere inflammatoriske infiltrater (figur 3A), herunder Gr-1 + neutrofiler selv dag-4 efter infektion sammenlignet med mus injiceret med T Fo (figur 3B). Disse resultater viste, at i presence af T regs, mus løst inflammation mere effektivt og tilbagebetalt af infektionen.
På dag 7 efter infektion blev milten (SPLN) CLN og tunge væv isoleret, og enkeltcelle-suspensioner blev fremstillet for flowcytometri analyser. CLN afslørede forøget CD45,1 Th17 celler (figur 1) og øget TNF-α-produktion (figur 4A, 4B) i mus, der modtog kun Th17 celler. På den anden side, reg T modtagere viste reduceret hyppighed af Th17 celler og reducerede TNF-α produktion af Th17 celler (figur 1 og 4A, 4B). I disse forsøg er data fra CLN af en enkelt mus og tunge væv høstet og blandet fra 2 mus vist. Selv på tidlige tidspunkter IL-17A produktion var højere i T reg modtagere 19, på senere tidspunkter i begge grupper, IL-17A produktion af Th17 celler minimal (data ikke vist). Periodisk Acid Schiffs farvningaf tungen viste øget svampehyfer i mus, der modtog kun Th17 celler, hvorimod mus, der modtog T regs samt ryddet svamp på dag 5 og dag 7 efter infektion (figur 5). Desuden histopatologi scoring af tungen inflammation viste også reduceret inflammation score i mus, der modtog T regs sammenlignet med mus, der modtog kun Th17 celler (figur 6). Scoring inflammation var baseret på tungen histopatologiske parametre såsom tilstedeværelsen af papiller, den intakte det overfladiske epitellaget, synlig gær eller hyfer, invaderende hyfer indikerende ikke-løse infektion, fortykkelse af basal lag (betegnende for igangværende vævsreparation) og tilstedeværelsen af infiltrerende immunceller (neutrofiler og Th17 celler). Disse resultater viste, at injektion af Th17 celler ikke direkte reducerer infektion, men øget svampe byrde og immunpatologi forårsaget af primær C. albicans Infection, mens co-overførsel af T regs lindres immunpatologi.
Figur 1. Sprøjtes Th17 celler og T reg celler rekruttere og ekspandere i de drænende lymfeknuder (CLN) af C albicans inficerede mus (A) Rag-1 -.. / - CD45,2 mus blev rekonstitueret med Th17 celler eller Th17 + T reg celler, der var polariseret under Th17 betingelser i 5 dage. Th17 celler blev opnået fra CD45,1 kongene mus og T reg celler blev opnået fra CD45,2-mus. Nogle mus har ikke modtaget celler (Sham eller Candida + PBS). Recipient mus i hver gruppe blev inficeret med skinkontroller eller C. albicans. På dag 5 efter infektion, CLN var isolated at gøre en enkelt cellesuspension og spore den injicerede CD45,1 udtrykker Th17 celler ved flowcytometri (gated på alle leukocytter i FSC, SSC scatter) (B) Rag-1 -. / - CD45,2-mus blev rekonstitueret med Th17 celler eller Th17 + T reg celler som i "a" og inficeret med C. albicans. CLN blev isoleret for at gøre en enkelt cellesuspension og måle CD45,1 og intracellulære Foxp3 ekspression ved flowcytometri (gated alle CD4-celler). T reg porte i plottene viser CD45,1 negative, Foxp3 + CD4 + celler. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Sprøjtes Th17 celler forårsage vægttab i C . Albicans inficerede mus og samtidig administration af T-regs forbedrer genrejsning vægttab. SCID CB-17 mus blev rekonstitueret med Th17 celler eller Th17 + T reg celler som i figur 1A. 3 dage senere blev de modtagende mus inficeret med C. albicans. Nogle mus i hver gruppe blev inficeret med skinkontroller. Immunsupprimerede mus modtog cortisonacetat (Cort) injektion. Den procentvise vægtændring i mus rekonstitueret med angivne celler og inficeret med C. albicans, med hensyn til d-1 (en dag før infektion) er vist. Data er normaliseret i forhold til vægten af data fra ikke-inficerede (Sham + PBS) mus. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
"Src =" / files / ftp_upload / 52538 / 52538fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Sprøjtes Th17 celler forårsager tungen immunpatologi i C. Albicans inficerede mus og samtidig administration af T regs reducerer immunpatologi. Histologisk evaluering af tunger af C. albicans inficerede mus. Mus blev rekonstitueret med angivne celler og inficeret som i figur 1A. På dag 5 efter infektion blev tunger isoleret fra mus. (A) Sagittale sektioner af tungerne blev farvet med H & E for at vurdere inflammation og infiltration (IF) af immunceller. (Pa) og (Ep) betegne papiller og epiteliale lag af tungen henholdsvis. Mikroskopiske billeder af dias set at50X forstørrelse. (B) Histologisk immunfarvning for Gr-1 neutrofil markør ved anvendelse af anti Gr-1-antistof (Clone: 1A8-Ly6g) i tungen afsnittene på dag 5 efter infektion (brun, angivet ved IF). Mikroskopiske billeder af dias set på 100X forstørrelse vises. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Samtidig administration af T regs reducerer TNF α i injicerede Th17 celler. (A) Rag-1 - / - CD45,2-mus blev rekonstitueret med Th17 celler eller Th17 + T REG celler og inficeret med C. albicans som i figur 1A. På dag 5 efter infektion, CLN og tunge væv blev isoleret for at gøre en enkelt cellesuspension. Disse celler blev restimuleret med PMA og ionomycin før intracellulær staining og flowcytometri-analyse. Flowcytometrisk kontur plots af intracellulær ROR-yt og TNF α ekspression af Th17 celler er vist (gated på CD4 + -celler). (B) Statistisk repræsentation af procentdelen af TNFαpositive celler fra eksperimenter udført som i "A". Dataene repræsenterer 4 mus hos ikke-inficerede gruppe, og 6 mus i hver inficeret gruppe, og samles fra to uafhængige forsøg. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Øget immunpatologi er også forbundet med øget fungal byrde C. Albicans inficerede mus. CB-17 scid mice blev rekonstitueret med Balb / C Th17 celler eller Th17 + T reg celler som i Figure1A, og blev inficeret med C. albicans. Histologisk evaluering af tungen fra inficerede mus er vist. På dag 7 efter infektion blev tunger høstet og farvet med periodsyre Schiffs (PAS) for at vurdere fungale læsioner, inflammation og infiltration (IF) af celler, og at detektere svamp (Ca). Glassene blev set at100X forstørrelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. T Fo forbedring immunpatologi i C. Albicans inficerede mus. SCID-mus blev rekonstitueret med Balb / C Th17 celler eller Th17 + T reg celler som i figur 1A, og blev inficeret med C. albicans. Statistisk repræsentation af de gennemsnitlige histologiske scoringer af tungerne fra inficerede mus vurderet som i figur 5. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Score | Egenskaber |
| 0 | 0 - ingen synlig gær eller hyfer, intakt overfladisk epitel på dorsale overflade af tungen, papiller klart til stede og ubeskadiget (måske eller måske ikke være infiltrerende mononukleære celler i væv), ingen fortykkelse af basale lag, ikke infiltrerende immunceller. |
| 1 | 1 - ingen synlig gær eller hyphae, laset eller let beskadigede overfladisk epitel, papiller tydeligt til stede med minimal skade og sjældne infiltrerende immunceller. |
| 2 | 2 - papiller reduceret, men til stede med skader, fortykkelse af basale lag og hyppige infiltrerende immunceller. |
| 3 | 3 - lejlighedsvis klynger af synlig gær og invaderende hyfer, synlige skader papiller, lejlighedsvise læsioner af beskadigede epitel, fortykkelse af basale lag og og små klynger af infiltrerende immunceller. |
| 4 | 4 - hyppige klynger af synlig gær og invaderende hyfer, synlige skader papiller, hyppige læsioner af beskadigede epitel, minimal infiltration af immunceller, fortykkelse af basale lag og hyppige klynger af infiltrerende immunceller. |
| 5 | 5 - udbredt tegn på invaderende hyfer, ekstensivt beskadiget epitel hele dorsale overflade, stor infiltration afimmunceller, få eller ingen påviselig papiller, fortykkelse af basal lag og meget hyppige og store klynger af infiltrerende immunceller. |
Tabel 1: Histologiske Scoring Værdier
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne model er baseret på at inducere oral C. albicans infektion afhængig Th17 inflammation. På grund af fraværet af T regs den Th17 celle inflammation er uhæmmet og fører til dårligt løst immunpatologi. In vitro afledt naive CD4-celler polariseret som Th17 celler blev anvendt til adoptiv overførsel. 40-50% af den dyrkede CD4 + celler viser påviselig IL-17A ekspression omkring dag 3 (Th17 celler), og derfor blev anvendt til injektion i mus. Den største fordel ved modellen er, at Th17 celler forårsage infektion specifik immunpatologi der effektivt kan lindres med T reg injektion. Således kan modellen anvendes til at teste immunmodulation strategier T reg injektion som en positiv kontrol. Inflammation er let vurderes baseret på vægttab, histopatologiske scoring og pro-inflammatoriske cytokin produktion af Th17 cellerne i de inficerede mus.
Efter than adoptiv overførsel af Th17 celler, de migrerede til sekundære lymfoide organer og væv, herunder tunge, det primære sted for infektion. Efter infektion blev andre inflammatoriske celler også rekrutteret til tungen at fjerne infektionen. Men uden T reg medieret immunomodulation, Th17 celler selv ikke løste infektion, men forårsagede øget immunpatologi. Co-overførsel af T regs helt løst inflammation. Interessant mus med forværret inflammation i fravær af T regs, viste også øget fungal byrde. Vores tidligere rapport viste, at dette var på grund af reduceret IL-17A produktion i mus, sammenlignet med dem med T-regs. Vores nuværende eksperimenter understøtter idéen om, at det også kan være på grund af øget TNF-α som forværrede inflammation, eventuelt ved at øge epitelcelle apoptose og øget fungal byrde 28. I betragtning af de immunbeskyttende virkninger af IL-17A på slimhindenMener vi, at inflammatorisk patologi, som vi observerer med stigende svampe byrde ikke skyldes IL-17A produceret af Th17 celler eller mangel på host modstand. Det er forvoldt på grund TNF-α og eventuelt andre pro-inflammatoriske cytokiner produceret af injicerede Th17 celler. Dette kan godkendes af den observation, at Rag - / - mus uden Th17 celler viser kun minimal inflammation og efterfølgende opløsning af infektion og kun dem, der har modtaget Th17 celler bukket under for alvorlige vægttab (figur 1). Konsekvent til disse data, er det blevet også tidligere vist, at Rag - / - mus rydde primære OPC infektion uden megen immunpatologi 27. Under disse betingelser har kompenserende mekanismer er afhængige af IL-17A producerende medfødte immunceller blevet vist at fjerne infektionen i Rag - / - mus 17,29,30. Tilsammen skønt IL-17A produceret af Th17 celler og neutrofil rekruttering spiller en beskyttende rolle ved indledende faser af infektion, excessive produktion af TNF-α og andre cytokiner ved Th17 celler, og den fortsatte tilstedeværelse af neutrofiler årsager forværret immunpatologi. Roller pro-inflammatoriske cytokiner foruden TNF-α produceres af Th17 celler mangler at blive undersøgt i forbindelse med immunpatologi.
Den største begrænsning i modellen er det spørgsmålet, om det er fysiologisk relevant for menneskers OPC. Selvom Th17 celler er vist at være patologiske mæglere i flere orale sygdomme, uanset om kronisk aktivering af Th17 celler er patogen i OPC endnu ikke undersøgt. Med de seneste resultater indebærer rolle C. albicans i inflammation og cancer, Th17 immunpatologi i mundhulen er en aktiv inden for efterforskning 31. Således den model, der er beskrevet her, kan bruges til mere omhyggeligt at undersøge specifikke roller Th17 celler, og hvordan de interagerer med medfødte immunceller og giver en detaljeret indsigt i orale immunologiske sygdomme og kræft i mundhulen.
Den kritiske trin i teknikken er det rette rekruttering og udvidelse af adoptivt overførte Th17 celler. Det er meget afhængig af levedygtighed og IL-17A produktionen af de in vitro-polariserede Th17 celler inden flytningen. Det er bedst at teste deres levedygtighed og cytokinproduktion ved flowcytometri analyser 19. Korrekt udførelse af Th17 celleinjektion og mus infektion vil føre til infektion afhængig Th17 immunpatologi. Denne model kan anvendes til at teste strategier til forpurre Th17 immunpatologi og oral inflammation i forbindelse med andre infektioner samt. Også ved hjælp af denne model kan man udføre sekundære reinfektioner og studere rolle Th17 celler forværre immunpatologi i forbindelse med kroniske infektioner. Da denne model indebærer immunsvækkede mus, kan det være meget relevant for oral dysbiosis set i AIDS og PID-patienter, der lider af tilbagevendende kroniske Candida-infektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CAF-2 | University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) | - | Candida culture |
| U-bottom 96 well plates | Fisher | 055588 | Used for cell culture |
| a-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| m-IL-6 | Bio Basic | RC232 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| h-TGF-b | R&D | 240-B | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IFN-g | eBiosciences | 16-7311-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IL-4 | eBiosciences | 16-7041-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| α-IL17A ef660 | eBiosciences | 50-7177-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| α-TNFa-PE-Cy7 | eBiosciences | 25-7423-41 | Used for cell culture - 1:100 |
| α-RORgt PE | eBiosciences | 12-6981-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium | Bio Basic | S507.SIZE | Mediium for candida growth |
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4300 | Incubation growth for candida |
| 15 ml tubes | Bio Basic | BT888-SY | Used for cell culture and candida growth |
| 50 ml tubes | Bio Basic | CT 788-YS | Used for cell culture and candida growth |
| Table top Centrifuge | VWR International LLC | 82017-654 | For pelleting candida -900 g |
| Allegra Centrifuge | Beckman Coulter | 392302 | Cell culture - 480 g |
| 1.5 ml eppendorf tubes | Bio Basic | BT620-NS | Preparing final concentration of candida |
| 2x paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixing candida for count |
| Hemocytometer | VWR International LLC | 15170-172 | Counting cells |
| PBS - Phosphate Buffered Saline | Bio Basic | PD8117 | Preparation of buffers |
| Ketamine/xylazine | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | Obtained from ARC approved protocol for anesthesia |
| Ophthalmic lubricant ointment | Allergan | - | Eye ointment for animals to prevent dryness |
| Saline (0.9% NaCl) | G Biosciences | 786-561 | Administerd to animals to prevent dehydration |
| 3-mm-diameter cotton wool ball | VWR International LLC | BP7603 | 3 mm balls for candida infection |
| Heat gel pads | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | for maintaining the body temperaturre and fast recovery |
| Hematoxylin and Eosin staining | Histoserv - MD | - | Tissue histology |
| 10% formalin | Electron Microscopy Sciences | JC1111/MC | Tissue histology |
| 70% ethanol | VWR International LLC | 97064-490 | Sterilization purpose |
| PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | Restimulation of cells |
| Ionomycin | Life Technologies | 124222 1mg | Restimulation of cells |
| Fixation permeabilization kit | eBiosciences | E16913-106 | Fixing cells for Flow cytometry |
| Tuberculin syringes | BD Biosciences | 309659 | Mice injection |
| 25 G x 3/8 needles | BD Biosciences | 309626 | Mice injection |
| Rag1 -/- mice | Jackson laboratories | Stock no: 002216 | Recipient mice |
| CD45.1 congenic mice | Jackson laboratories | Stock no:002014 | Donor Th17 cells |
| CB17-SCID mice | Jackson laboratories | Stock no: 001303 | Recipient mice |
| Balb/c mice | Jackson laboratories | Stock no: 000651 | Donor Th17 cells |
References
- Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
- Loesche, W. J. Periodontal disease: link to cardiovascular disease. Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).
- Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. Association between periodontal disease and stroke. Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).
- Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy. Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217 (2012).
- Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In. Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).
- Canabarro, A., et al. Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis. Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).
- Urzua, B., et al. Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets. Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).
- Ergun, S., et al. Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome. Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).
- Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment. Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).
- Gall, F., et al. Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions. The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).
- Grady, J. F., Reade, P. C. Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia. Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).
- Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia. Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).
- Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense. Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).
- Marodi, L., Johnston, R. B. Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms. Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).
- Kumamoto, C. A. Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In. Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).
- Kraneveld, E. A., et al. The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults. PloS One. 7 (8), e42770 (2012).
- Hernandez-Santos, N., et al. Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).
- Hasina, R., et al. ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis. Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).
- Pandiyan, P., et al. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model. Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).
- Pandiyan, P., et al. The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes. J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).
- Pandiyan, P., Lenardo, M. J. The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival. Biology Direct. 3 (6), (2008).
- Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells. Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al. Animal models for candidiasis. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. 105, 11-19 (2014).
- Conti, H. R., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Kamai, Y., et al. New model of oropharyngeal candidiasis in mice. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).
- Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. Isolation of T cells from mouse oral tissues. Biological Procedures Online. 16 (1), 4 (2014).
- Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation. International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).
- Bishu, S., et al. The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).
- Quintin, J., et al. Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice. Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).
- Ramirez-Garcia, A., et al. Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression. Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).
