Protocol
REMARQUE: Les expériences utilisant des souris ont été effectués conformément au comité de protection des animaux institutionnelle (IACUC) des lignes directrices.
1. La reconstitution de l'Rag-1 - / - souris avec des cellules I n vitro de culture Th17 (Trois jours avant l'infection)
- Pour l'établissement des cellules Th17, culture CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25 des lymphocytes T naïfs (3 x 104) en U à fond plaques à 96 puits seuls ou co-culture eux avec 3 x 104 cellules CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg en présence d'soluble α-CD3 (1 pg / ml), α-CD28 (2 pg / ml) d'anticorps et de cellules présentatrices d'antigène, dans des conditions Th17 (polarisées à l'aide d'IL-6 (25 ng / ml), TGF β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) et α -IL-4 (2 ng / ml)) pendant trois à quatre jours.
REMARQUE: les cellules T naïves et regs ont été triés à l'aide cellulaire activé par fluorescence (FACS) und procédures d'isolement cellulaire magnétique et cultivées comme décrit précédemment 19-22. - Le jour 4, après remise en suspension des cellules Th17 utilisant la pipette, les recueillir à partir de cultures, et les centrifuger dans des conditions stériles.
- Prenez une petite aliquote de ces cellules à examiner leur viabilité et pour le phénotypage. Remettre en suspension dans les 500 pi de milieu RPMI, ajouter l'iodure de propidium (200 ng / ml) et d'évaluer leur viabilité immédiatement par cytométrie en flux. Effectuer phénotypage en cytométrie de flux évaluation de la production d'IL-17A après restimulation (voir rubrique 6.3).
- Centrifugeuse de lavage et l'essentiel des cellules dans du PBS stérile à 480 g pendant 6 min à 4 ° C dans toutes les étapes sauf indication contraire.
- Utilisez ces cellules pour le transfert adoptif dans la vieille 6-8 semaines CD45.2 Rag1 - / - souris immunodéficientes.
- Remettre en suspension les cellules à une densité cellulaire 1 x 10 7 cellules / ml en utilisant froide PBS stérile.
- Injecter 100 ul de cellules par intraperitoneal injection, en utilisant 25 g d'aiguilles de seringues de 1 ml de tuberculine, de telle sorte que une souris reçoit 1 x 10 6 cellules. Certaines souris recevront PBS, les cellules Th17 ou uniquement, et d'autres souris recevront Th17 cellules qui étaient co-cultivées avec des cellules Treg.
REMARQUE: Effectuez toutes les étapes de manière aseptique.
2. Croissance C. albicans l'infection (un jour avant l'infection)
- Avant l'inoculation, disperser cinq colonies de la CAF2-1 C. albicans souche de laboratoire dans 100 pi de suspension PBS stérile, et ajouter la suspension au bouillon stérile.
- Inoculer cinq colonies de la C. albicans dans 50 ml de la base azotée de levure (YNB sans acides aminés) / peptone / bouillon dextrose et incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C pendant 15 à 18 heures à 130 rpm.
- Surveiller le bouillon de trouble, car ce est une indication de la croissance du champignon.
3. CandidaRécolte et de la procédure de comptage (Le Jour des maladies infectieuses)
- Recueillir 10 ml de bouillon Candida dans 15 ml tubes. Pour des volumes plus importants, de recueillir Candida dans 50 ml tubes.
- Centrifuger les blastospores à 1900 xg pendant 5 min à température ambiante dans toutes les étapes sauf indication contraire. Pellet les blastospores par centrifugation, suivie par l'élimination du surnageant.
- Se il ya plus d'un tube, mutualiser les blastospores de Candida à partir de tubes multiples, ajoutant PBS stérile pour les boulettes et les remettre en suspension dans 10 ml de PBS pour le comptage.
- Prenez 20 pi de blastospores dans 1,5 ml microtubes, ajouter 20 pi de la paraformaldéhyde 2X et incuber à température ambiante pendant 15 à 20 min. Comptez les blastospores fixes utilisant l'hémocytomètre sous le microscope.
REMARQUE: Paraformaldéhyde est cancérogène. Ouvrez la solution non diluée seulement dans la hotte. - En attendant, répéter le lavage des blastospores au moins deux fois par centrifugation tourlet dans du PBS, et la granulation blastospores. Gardez les pastilles dans 15 ml tubes à température ambiante, dans la hotte ABSL1, prêt pour l'infection.
- Laissez un peu de PBS stérile à température ambiante pendant remise en suspension des blastospores de l'infection.
- Après comptage, ajouter du PBS stérile à la pastille de blastospores à ajuster les nombres de cellules de levure à deux blastospores de levure x10 8 cellules / ml. Ce est la suspension de blastospores qui sera utilisé pour infecter les souris.
REMARQUE: Effectuez toutes les étapes de manière aseptique.
4. Souris Infection (3-5 jours après transfert de cellules)
NOTE: La procédure de l'infection de base est effectuée comme décrit précédemment 19,23-25.
- Peser le Rag-1 - / - souris qui ont reçu PBS ou les cellules trois jours plus tôt.
- Calculer la dose à l'aide d'agents anesthésiques leur poids corporel. Anesthésier les souris par administration de kétamine / xylazine mélange (16,1 mg / ml et 1,6 mg / ml), en utilisant 25 g d'aiguilles sur les seringues de tuberculine de 1 ml, par intraperitoneal injection.
- Administrer 50 pl par 10 g de poids corporel. (Ce est-0,8 mg de kétamine et 0,08 mg de xylazine / 10 g de poids corporel ou 80 mg de kétamine et de xylazine 8 mg par kg de poids corporel respectivement). Observer la réponse orteil pincée toutes les 15 min après l'anesthésie.
NOTE: Ce dosage va induire 60-90 min de l'anesthésie, ce qui est suffisant pour la procédure d'infection. - Appliquer le lubrifiant pommade ophtalmique dans les yeux des souris pour éviter les cornées de se dessécher. Comme le lubrifiant oculaire peut se dessécher, répétez la lubrification ophtalmique toutes les 45 min.
- Administrer 50 pl par 10 g de poids corporel. (Ce est-0,8 mg de kétamine et 0,08 mg de xylazine / 10 g de poids corporel ou 80 mg de kétamine et de xylazine 8 mg par kg de poids corporel respectivement). Observer la réponse orteil pincée toutes les 15 min après l'anesthésie.
- Injecter 1 ml de solution saline (NaCl 0,9%) sous-cutanée sur le dos à côté de la patte avant, pour aider à la réhydratation de la souris pendant l'anesthésie.
- Obtenir un nouveau, cage propre. Suivre la procédure infection une souris à la fois, en plaçant chaque souris dans la nouvelle cage une fois infecté. Effectuez la / infection simulacre PBS abord, et ensuite procéder aux gro d'infection à Candidaups.
- Ramassez la souris anesthésiée et ouvrez la bouche pour révéler la base de la langue.
- Placer une balle de coton diamètre de 3 mm saturé avec 50 pl de PBS ou blastospore suspension, sublinguale dans la cavité buccale pendant 90 min. Retournez la souris tous les fronts 15 min et à l'arrière pour éviter une congestion pulmonaire, veiller à ce que les boules de coton ne se déplacent pas.
- Mettre en place une minuterie pour chaque souris 90 min pour se assurer de Sham ou Candida inoculation dans la cavité buccale.
- Gardez-les dans une cage sous la lampe de chaleur (4 mètres), et chaque souris sur coussinets de gel de chaleur.
- Assurez-vous que la langue est retirée à l'intérieur et à l'écart des dents, pour éviter dents lacérants la langue.
- A la fin de 90 min, retirer la boule de coton à partir de l'embouchure de la souris. Surveillez toute souris qui peut remettre de l'anesthésie plus tôt que 75 minutes. Dans un tel cas, anesthésier à nouveau avec de la kétamine (40 mg / kg) seul.
5. Poster PROCEDURe surveillance (pendant les 90 min anesthésie)
- Utilisez coussinets de gel de chaleur au cours de la 90 min anesthésie.
- Pour maintenir la température du corps et pour prévenir la suffocation, ne permettent pas de récupérer souris sur la literie de la souris épi de maïs régulier.
- Après la récupération de l'anesthésie, administrer un 1 ml supplémentaires de NaCl 0,9% stérile voie sous-cutanée à deux endroits sur le dos.
- Gardez jusqu'à cinq PBS (sham) de souris inoculées par cage. Maison seulement 1-2 souris infectées par cage.
- Remplissez la carte de procédure avec les initiales tous les jours après la procédure de noter les changements dans le poids du corps, les habitudes et la santé globale de toilettage.
6. Évaluation de l'inflammation
6.1) La perte de poids
- Peser la souris tous les jours pendant l'infection, à partir du jour avant l'intervention de l'infection.
NOTE: En règle générale, les souris immunodéficientes injectées avec des cellules Th17 et sans regs T succombent à 20-30% De perte de poids due à l'accroissement de la charge fongique 19 et exacerbé l'inflammation.
6.2) histologie notation de la langue
- Sacrifier les souris par asphyxie au CO2, suivie par dislocation cervicale.
- Ouvrir les mâchoires et disséquer la langue avec des ciseaux et des pinces. Utilisez le forceps émoussé pour tenir la langue, et l'aide des ciseaux tendre la main à l'arrière de la bouche à inciser la fin arrière de la langue.
- Pour hématoxyline immunocytochimique et de l'éosine (H & E) coloration des tissus de la langue, rincer les tissus de la langue avec PBS glacé. Ajouter 5 ml de formol à 10% pendant 2-3 langues et les fixer O / N en tubes de 15 ml.
- Le lendemain, éliminer le formol et plongez les tissus dans 5 ml d'éthanol à 70% pour éviter l'hyper-fixation. Envoyez-les en service commercial de poursuivre inclusion dans la paraffine, la coupe et la coloration des coupes en paraffine.
NOTE: le service d'histologie commerciale est utilisée pour effectuer ces étapes. - Une fois les diapositives sont de retour à partir du service d'histologie commerciale, la qualité de l'inflammation en observant les sections de tissu sous un microscope optique.
- Score de 0 à 5, 0 étant pas d'inflammation, inflammation et 5 étant le plus sévère. Note l'inflammation en utilisant le tableau 1.
6.3) La production de cytokine par les cellules Th17
REMARQUE: Une production excessive de TNF-α est l'une des lectures pour immunopathologie excessive. Lorsque les souris sont transférées de manière adoptive avec des cellules Th17 seulement, il provoque l'immunopathologie qui est associée à une production excessive de TNF-α dans les cellules Th17.
- Recueillir une suspension cellulaire unique à partir de la rate, les ganglions cervicaux, axillaires ganglions lymphatiques, et de la langue, en utilisant des méthodes décrites précédemment 19,26.
- Restimuler les cellules avec du phorbol myristate acétate (PMA) (50 ng / ml) et de l'ionomycine (500 ng / ml) pendant 4 heures avec Brefeldine A (10 ug / ml) a été ajouté dans la last 2 h. Laver les cellules avec du PBS et fixer à l'aide d'un kit de fixation / de perméabilisation commerciale selon les instructions du fabricant.
- Effectuer intra coloration de cytokine cellulaire en utilisant l'anticorps anti-TNF-α conjugués à un fluorochrome, anti-IL-17A et d'anticorps ROR-yt 19 comme décrit précédemment.
- En bref, remettre en suspension les cellules dans le tampon de perméabilisation 1X avec le cocktail d'anticorps anti-TNF-α, l'anti-IL-17A et ROR-yt anticorps, chaque anticorps à 2-3 ug / ml de concentration finale.
- Incuber les cellules pendant 1 heure à température ambiante.
- Après l'incubation, laver les cellules avec le tampon de perméabilisation 1X.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de PBS avec 0,5% de sérum albumine bovine pour l'analyse de cytométrie en flux.
- Le lendemain, éliminer le formol et plongez les tissus dans 5 ml d'éthanol à 70% pour éviter l'hyper-fixation. Envoyez-les en service commercial de poursuivre inclusion dans la paraffine, la coupe et la coloration des coupes en paraffine.
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Representative Results
Dans ce modèle, les deux souris infectées par Candida et les souris non infectées dans Rag-1 - / - fond immunodéficientes ont été adoptive transféré avec des cellules Th17 3-5 jours avant l'infection. Un total de 10 à 12 souris ont été utilisés pour les expériences, avec deux souris dans chaque groupe Sham infecté et 4-5 dans chacun des groupes infectés Candida. Cellules naïves ont été obtenues à partir de souris congéniques CD45.1 ou Thy1.1, de sorte que les cellules Th17 injectés ont été suivis in vivo en utilisant respectivement Thy1.1 ou CD45.1 coloration (figure 1A). T regs de Co-transférées ont été obtenues à partir de souris CD45.2 pour les distinguer des cellules Th17 CD45.1. Pour certaines expériences, CB-17 Thy1.2 souris receveuses scid, Th17 cellules obtenues à partir de donneurs Thy1.1 souris Balb / C et T regs obtenus à partir de souris congéniques de Thy1.2 ont été utilisés. Seulement des souris infectés par Candida, mais pas des souris non infecté présentait le recrutement et l'expansion de CD45.1 + reconstitué (Figure 1A). Les résultats représentent les données d'une souris dans chaque groupe.
Seulement chez les souris qui sont co-transféré avec T regs, Foxp3 + CD45.1 CD4 + négative cellules ont été détectés dans le CLN. Cela montre que les regs T injectées ont également été recrutés au site de l'infection (figure 1B). Les résultats représentent les données d'une souris dans chaque groupe. Considérant que infecté Rag-1 - / - poids perdre du poids et récupéré après quatre jours de l'infection, des souris immunodéprimées cortisone n'a pas récupéré, mais encore perdu, comme indiqué précédemment 27. Les deux groupes de souris qui ont reçu des cellules Th17 en présence ou en l'absence de T regs initialement perdu du poids. Cependant, les souris qui ont reçu T regs récupérés de perte de poids et l'infection résolus. 2 mla glace ont été utilisés dans le groupe Sham infectés, et 4 dans chaque groupe infecté Candida. Il y avait trois souris du groupe cortisone. Les souris ayant reçu les cellules Th17 seulement, perdu du poids progressivement (figure 2) 19. Certaines des souris de ce groupe ont dû être euthanasiés. Ces résultats montrent la moyenne des poids de toutes les souris de ce groupe. Bien que les neutrophiles sont nécessaires pour le jeu initial de l'infection, leur présence continue et le recrutement dans le tissu est un signe d'inflammation non résolue. Par conséquent l'infiltration de neutrophiles a été examiné dans la langue infectée, par détermination de l'expression d'un marqueur de neutrophiles, Gr-1, à des moments plus tardifs comme jour-7 après l'infection. Les souris ayant reçu des cellules Th17 seulement, avait des infiltrats inflammatoires supérieures (Figure 3A), y compris Gr-1 + neutrophiles même jour-4 après l'infection, par rapport aux souris injectées avec regs T (figure 3B). Ces résultats ont montré que dans le presence de T regs, les souris résolu l'inflammation plus efficacement et récupéré de l'infection.
Au jour 7 après l'infection, de la rate (SPLN), et la languette CLN tissus ont été isolés, et des suspensions de cellules uniques ont été faites pour les analyses de cytométrie en flux. CLN a révélé une augmentation des cellules CD45.1 Th17 (figure 1) et production accrue de TNF-α (figure 4A, 4B) dans des souris qui ont reçu des cellules Th17 seulement. D'autre part, T reg bénéficiaires ont montré une diminution de la fréquence des cellules Th17 et de réduire la production de TNF-α par les cellules Th17 (de la figure 1 et 4A, 4B). Dans ces expériences, des données provenant d'un seul CLN souris et les tissus de la langue récoltées et rassemblées à partir de deux souris sont présentées. Bien qu'au début des points de temps la production d'IL-17A était plus élevée chez T reg destinataires 19, à des moments plus tard dans les deux groupes, la production d'IL-17A par les cellules Th17 était minime (données non présentées). Coloration de Schiff à l'Acide Périodiquede la langue ont montré une augmentation des hyphes fongiques chez les souris qui ont reçu les cellules Th17 seulement, alors que les souris qui ont reçu T regs ainsi effacés le champignon le jour-5 et 7 jours après l'infection, (Figure 5). En outre, l'histopathologie le ballon de l'inflammation de la langue a également montré scores d'inflammation réduites chez les souris qui ont reçu T regs, comparativement à des souris qui ont reçu seulement des cellules Th17 (figure 6). Marquant l'inflammation a été basée sur la langue paramètres histopathologiques tels que, la présence de papilles, l'intégrité de la couche superficielle de l'épithélium, la levure visible ou hyphes, envahissant hyphes indiquant une infection non-résolution, l'épaississement de la couche basale (indicatif de la réparation des tissus en cours), et la présence de l'infiltration des cellules immunitaires (neutrophiles et les cellules Th17). Ces résultats ont démontré que l'injection de cellules Th17 n'a pas directement à réduire l'infection, mais ont augmenté la charge fongique et l'immunopathologie primaire causée par C. albicans infectiontion, alors co-transfert de T regs amélioré immunopathologie.
Figure 1. Injection cellules Th17 et des cellules T reg recruter et développer dans les ganglions lymphatiques drainant (CLN) de la C albicans infecté des souris (A) Rag-1 -.. / - Souris CD45.2 ont été reconstituées avec des cellules Th17 ou Th17 + T reg cellules qui ont été polarisés dans des conditions Th17 pendant 5 jours. cellules Th17 ont été obtenus à partir de souris congéniques CD45.1 et des cellules T reg ont été obtenus à partir de souris CD45.2. Certaines souris ne ont pas reçu toutes les cellules (Sham ou Candida + PBS). Les souris receveuses dans chaque groupe ont été infectées avec des commandes simulées avec ou C. albicans. 5 jours après l'infection, CLN étaient isolated pour faire une suspension cellulaire unique et de suivre l'CD45.1 injecté des cellules exprimant Th17 par cytométrie de flux (fermée sur tous les leucocytes dans FSC, diffusion SSC) (B) Rag-1 -. / - souris CD45.2 ont été reconstituées avec des cellules Th17 ou des cellules Th17 reg + T comme dans "A" et infectés par C. albicans. CLN ont été isolés pour faire une suspension cellulaire unique et mesurer CD45.1 et d'expression Foxp3 intracellulaire par cytométrie de flux (gated sur toutes les cellules CD4). Les portes T reg dans les parcelles montrent l'CD45.1 négative, Foxp3 + cellules CD4 +. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. injecté des cellules Th17 causent la perte de poids en C . Albicans souris infectées et la co-administration de T regs améliore la récupération de la perte de poids. SCID CB-17 souris ont été reconstituées avec des cellules Th17 ou cellules Th17 reg + T comme dans la figure 1A. 3 jours plus tard, les souris receveuses ont été infectées avec C. albicans. Certaines souris de chaque groupe ont été infectés avec des commandes fictives. Souris immunodéprimées reçu l'acétate de cortisone (Cort) injection. Le changement pour cent en poids chez les souris reconstituées avec des cellules infectées indiquées et avec C. albicans, par rapport à d-1 (un jour avant l'infection) est disponible. Les données sont normalisées par rapport aux données de poids des souris non infectées (Sham + PBS). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. injecté des cellules Th17 causent langue immunopathologie en C. Albicans infecté des souris et co-administration de T regs réduit l'évaluation immunopathologie. Histologique des languettes de la C. albicans infecté les souris. Les souris ont été reconstituées avec des cellules infectées et indiqués comme sur la figure 1A. 5 jours après l'infection, les langues ont été isolés à partir de souris. (A) sections sagittales des languettes ont été colorées avec H & E pour évaluer l'inflammation et l'infiltration (SI) des cellules immunitaires. (Pa) et (Ep) désigner papilles et la couche épithéliale de la languette respectivement. Images microscopiques des diapositives consultées at50X agrandissement. (B) de immunocoloration histologique pour GR-1 neutrophiles marqueur utilisant des anticorps anti-Gr 1 anticorps (CloNE: 1A8-Ly6g) dans les sections de langue sur 5 jours après l'infection (brun, désigné par SI). Images microscopiques des diapositives consultées au grossissement 100X sont présentés. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Co-administration de T regs réduit TNF α dans les cellules Th17 injectés. (A) Rag-1 - / - souris CD45.2 ont été reconstituées avec des cellules Th17 ou cellules Th17 reg + T et infectés par le C. albicans comme dans la figure 1A. Le jour 5 après l'infection, les tissus des RAC et de la langue ont été isolés pour faire une suspension cellulaire unique. Ces cellules ont été restimulées avec PMA et ionomycine avant staini intracellulaireng et analyses de flux cytométrie. Terrain cytométrie de flux intracellulaire de contour de ROR-yt et TNF α expression des cellules Th17 sont présentés (gated sur les cellules CD4 +). (B) Représentation statistique du pourcentage de cellules provenant d'expériences TNFαpositive effectuée comme dans «A». Les données représentent 4 souris dans le groupe non infecté, et six souris dans chaque groupe infecté, et sont regroupées à partir de deux expériences indépendantes. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Immunopathologie Figure 5. accrue est également associée à une augmentation de la charge fongique C. Albicans infecté des souris. CB-17 micro scide ont été reconstitués avec des cellules Balb / C Th17, ou des cellules Th17 reg + T comme dans Figure1A, et ont été infectés par le C. albicans. L'examen histologique de la langue à partir de souris infectées se affiche. Au jour 7 après l'infection, les langues ont été récoltées et colorées avec (le PAS) de l'acide périodique Schiff pour évaluer les lésions fongiques, l'inflammation et l'infiltration (SI) des cellules, et de détecter champignon (Ca). Les lames ont été consultés at100X grossissement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. T regs améliorent immunopathologie en C. Albicans souris infectées. scid ont été reconstituées avec des cellules Balb / C Th17, ou des cellules T reg Th17 + comme dans la Figure 1A, et ont été infectées avec C. albicans. Représentation statistique des scores histologiques moyennes des langues de souris infectées évalués comme dans la figure 5. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| But | Caractéristiques |
| 0 | 0 - pas de levure visible ou hyphes, épithélium superficiel intact sur la surface dorsale de la langue, des papilles clairement présent et en bon état (peut ou non être l'infiltration de cellules mononucléaires dans le tissu), aucun épaississement de la couche basale, aucune des cellules immunitaires infiltrant. |
| 1 | 1 - pas de levure visible ou hyphese, en lambeaux ou de l'épithélium superficiel légèrement endommagé, papilles clairement présente avec des dommages minimaux et les cellules immunitaires infiltrant rares. |
| 2 | 2 - papilles réduite, mais présente des dommages, un épaississement de la couche basale et les cellules immunitaires infiltrant fréquents. |
| 3 | 3 - groupes occasionnels de levure visible et hyphes envahir, la preuve de papilles endommagé, lésions de l'épithélium endommagé occasionnels, un épaississement de la couche basale et et de petites grappes de cellules immunitaires infiltrant. |
| 4 | 4 - grappes fréquents de levure visible et hyphes envahir, la preuve de papilles endommagé, lésions fréquentes de l'épithélium endommagé, une infiltration minimale des cellules immunitaires, l'épaississement de la couche basale et grappes fréquents de cellules immunitaires infiltrant. |
| 5 | 5 - preuves généralisée d'envahir hyphes, l'épithélium fortement endommagées sur la surface dorsale, grande infiltration decellules immunitaires, peu ou pas détectable papilles, un épaississement de la couche basale et des clusters haute fréquentes et grands de se infiltrer dans les cellules immunitaires. |
Tableau 1: notation histologiques valeurs
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Discussion
Ce modèle est basé sur l'induction par voie orale C. albicans infection inflammation Th17 dépendante. En raison de l'absence de T regs, l'inflammation cellulaire Th17 induite est effrénée et conduit à l'immunopathologie mal résolu. In vitro dérivés des cellules CD4 naïfs polarisés que les cellules Th17 ont été utilisés pour le transfert adoptif. 40-50% de la culture CD4 + cellules montrent détectable expression de l'IL-17A autour de 3 jours (cellules Th17), et donc ont été utilisés pour l'injection chez la souris. Le principal avantage de ce modèle est que les cellules Th17 causent immunopathologie spécifique de l'infection qui peut être efficacement améliorée avec l'injection T reg. Ainsi, le modèle peut être utilisé pour tester des stratégies d'immunomodulation avec injection T reg comme un contrôle positif. L'inflammation est facilement évaluée en fonction de la perte de poids, la notation histopathologique et la production de cytokines pro-inflammatoires par les cellules Th17 des souris infectées.
Après til transfert adoptif de cellules Th17, ils migré vers les organes lymphoïdes secondaires et divers tissus, y compris la langue, le site primaire de l'infection. Après l'infection, d'autres cellules inflammatoires ont également été recrutés à la languette pour éliminer l'infection. Toutefois, sans l'immunomodulation T reg médiation, les cellules Th17-mêmes ne résolvent pas l'infection, mais causé immunopathologie accrue. Co-transfert de T regs complètement résolu l'inflammation. Fait intéressant, les souris présentant une inflammation exacerbée en l'absence de T regs, également montré une augmentation de la charge fongique. Notre précédent rapport a montré que cela était dû à une réduction de la production d'IL-17A chez la souris, par rapport à ceux avec T regs. Nos expériences actuelles soutiennent l'idée qu'il peut aussi être due à une augmentation de TNF-α qui se est aggravée l'inflammation, éventuellement en augmentant l'apoptose des cellules épithéliales et augmenté la charge fongique 28. Compte tenu des effets immunoprotecteurs de IL-17A à la muqueuse, Nous croyons que la pathologie inflammatoire que l'on observe de plus en plus la charge fongique ne est pas due à l'IL-17A produite par les cellules Th17 ou le manque de résistance de l'hôte. Elle est due au TNF-α et éventuellement d'autres cytokines pro-inflammatoires produites par les cellules Th17 injectés. Cela peut être validée par l'observation que Rag - / - souris dépourvues de cellules Th17 ne montrent que l'inflammation minimale et résolution ultérieure de l'infection et que ceux qui ont reçu les cellules Th17 ont succombé à la perte de poids sévère (Figure 1). Conformément à ces données, il a également été montré précédemment que Rag - / - souris éliminer l'infection OPC primaire sans beaucoup immunopathologie 27. Dans ces conditions, il a été démontré mécanismes compensatoires dépend sur IL-17A produire des cellules immunitaires innées pour éliminer l'infection dans Rag - / - souris 17,29,30. Pris ensemble, bien que l'IL-17A produite par les cellules Th17 et le recrutement de neutrophiles jouent un rôle protecteur à des phases initiales de l'infection, excessif production de TNF-α et d'autres cytokines par les cellules Th17, et la présence continue des neutrophiles des causes exacerbée immunopathologie. Le rôle des cytokines pro-inflammatoires TNF-α outre produite par les cellules Th17 restent à étudier dans le contexte de l'immunopathologie.
La principale limitation du modèle est la question de savoir si il est physiologiquement pertinente pour OPC humaine. Bien que les cellules Th17 sont présentés comme des médiateurs pathologiques dans plusieurs maladies bucco-dentaires, si l'activation chronique de cellules Th17 est pathogène dans OPC restent à étudier. Avec des résultats récents impliquant le rôle de C. albicans dans l'inflammation et le cancer, Th17 immunopathologie dans la cavité buccale est un champ actif de l'enquête 31. Ainsi, le modèle qui est décrit ici peut être utilisé pour étudier plus attentivement les rôles spécifiques de cellules Th17 et comment ils interagissent avec les cellules immunitaires innées, donnant un aperçu détaillé dans les maladies immunologiques orale et cancer de la bouche.
L'étape critique dans la technique est le recrutement et l'expansion des cellules Th17 adoptive transférés appropriée. Ce est très dépendante de la viabilité et de l'IL-17A production des cellules in vitro Th17 polarisées avant le transfert. Il est préférable de tester leur viabilité et la production de cytokines par cytométrie de flux analyses 19. La bonne exécution de l'injection de cellules Th17 et des souris une infection conduira à l'infection dépend immunopathologie Th17. Ce modèle peut être utilisé pour tester des stratégies pour contrecarrer Th17 immunopathologie et l'inflammation orale dans le contexte d'autres infections ainsi. En outre, l'utilisation de ce modèle, on peut effectuer les réinfections et secondaires étudier le rôle des cellules Th17 dans l'exacerbation immunopathologie dans le contexte des infections chroniques. Comme ce modèle implique des souris immunodéficientes, il peut être très pertinent pour dysbiose orale vu dans sida et PID patients, qui souffrent d'infections chroniques Candida récurrents.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CAF-2 | University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) | - | Candida culture |
| U-bottom 96 well plates | Fisher | 055588 | Used for cell culture |
| a-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| m-IL-6 | Bio Basic | RC232 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| h-TGF-b | R&D | 240-B | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IFN-g | eBiosciences | 16-7311-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IL-4 | eBiosciences | 16-7041-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| α-IL17A ef660 | eBiosciences | 50-7177-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| α-TNFa-PE-Cy7 | eBiosciences | 25-7423-41 | Used for cell culture - 1:100 |
| α-RORgt PE | eBiosciences | 12-6981-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium | Bio Basic | S507.SIZE | Mediium for candida growth |
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4300 | Incubation growth for candida |
| 15 ml tubes | Bio Basic | BT888-SY | Used for cell culture and candida growth |
| 50 ml tubes | Bio Basic | CT 788-YS | Used for cell culture and candida growth |
| Table top Centrifuge | VWR International LLC | 82017-654 | For pelleting candida -900 g |
| Allegra Centrifuge | Beckman Coulter | 392302 | Cell culture - 480 g |
| 1.5 ml eppendorf tubes | Bio Basic | BT620-NS | Preparing final concentration of candida |
| 2x paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixing candida for count |
| Hemocytometer | VWR International LLC | 15170-172 | Counting cells |
| PBS - Phosphate Buffered Saline | Bio Basic | PD8117 | Preparation of buffers |
| Ketamine/xylazine | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | Obtained from ARC approved protocol for anesthesia |
| Ophthalmic lubricant ointment | Allergan | - | Eye ointment for animals to prevent dryness |
| Saline (0.9% NaCl) | G Biosciences | 786-561 | Administerd to animals to prevent dehydration |
| 3-mm-diameter cotton wool ball | VWR International LLC | BP7603 | 3 mm balls for candida infection |
| Heat gel pads | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | for maintaining the body temperaturre and fast recovery |
| Hematoxylin and Eosin staining | Histoserv - MD | - | Tissue histology |
| 10% formalin | Electron Microscopy Sciences | JC1111/MC | Tissue histology |
| 70% ethanol | VWR International LLC | 97064-490 | Sterilization purpose |
| PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | Restimulation of cells |
| Ionomycin | Life Technologies | 124222 1mg | Restimulation of cells |
| Fixation permeabilization kit | eBiosciences | E16913-106 | Fixing cells for Flow cytometry |
| Tuberculin syringes | BD Biosciences | 309659 | Mice injection |
| 25 G x 3/8 needles | BD Biosciences | 309626 | Mice injection |
| Rag1 -/- mice | Jackson laboratories | Stock no: 002216 | Recipient mice |
| CD45.1 congenic mice | Jackson laboratories | Stock no:002014 | Donor Th17 cells |
| CB17-SCID mice | Jackson laboratories | Stock no: 001303 | Recipient mice |
| Balb/c mice | Jackson laboratories | Stock no: 000651 | Donor Th17 cells |
References
- Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
- Loesche, W. J. Periodontal disease: link to cardiovascular disease. Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).
- Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. Association between periodontal disease and stroke. Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).
- Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy. Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217 (2012).
- Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In. Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).
- Canabarro, A., et al. Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis. Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).
- Urzua, B., et al. Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets. Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).
- Ergun, S., et al. Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome. Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).
- Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment. Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).
- Gall, F., et al. Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions. The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).
- Grady, J. F., Reade, P. C. Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia. Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).
- Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia. Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).
- Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense. Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).
- Marodi, L., Johnston, R. B. Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms. Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).
- Kumamoto, C. A. Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In. Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).
- Kraneveld, E. A., et al. The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults. PloS One. 7 (8), e42770 (2012).
- Hernandez-Santos, N., et al. Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).
- Hasina, R., et al. ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis. Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).
- Pandiyan, P., et al. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model. Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).
- Pandiyan, P., et al. The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes. J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).
- Pandiyan, P., Lenardo, M. J. The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival. Biology Direct. 3 (6), (2008).
- Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells. Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al. Animal models for candidiasis. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. 105, 11-19 (2014).
- Conti, H. R., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Kamai, Y., et al. New model of oropharyngeal candidiasis in mice. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).
- Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. Isolation of T cells from mouse oral tissues. Biological Procedures Online. 16 (1), 4 (2014).
- Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation. International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).
- Bishu, S., et al. The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).
- Quintin, J., et al. Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice. Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).
- Ramirez-Garcia, A., et al. Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression. Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).
