Protocol
注：マウスを用いた実験は、制度的動物福祉委員会（IACUC）のガイドラインに基づいて実施した。
（感染に3日前に）I N体外培養のTh17細胞とマウス- / - 1 RAG-1を再構成する
- 可溶性の存在下で単独でU底96ウェルプレート、または3×104 CD4 + CD25 +のFoxp3 + Tregのと一緒に共培養してにおけるTh17細胞、培養CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25-ナイーブT細胞（×10 3）を確立するためのα-CD3（1μg/ ml）を、α-CD28（2μg/ mlの）Th17分化条件下での抗体と抗原提示細胞（IL-6（25 ng / ml）を、TGF-βを用いて偏光（2 ng / ml）を、α-IFN-γ（2μg/ ml）を、α-IL-4（2μg/ ml）を）三から四日間。
注：ナイーブ細胞とT REGSは、蛍光活性化細胞選別（FACS）ANを使用して分類したD磁気細胞単離手順および培養し、以前に19-22説明したように。 - 4日目に、ピペットを用いて、Th17細胞を再懸濁した後、培養物からそれらを収集し、滅菌条件下で、それらを遠心分離する。
- それらの生存を調べるために、これらの細胞の小アリコートを取り、表現型のために。ヨウ化プロピジウム（200 ngの/ ml）を追加し、フローサイトメトリーにより直ちにそれらの生存率を評価し、RPMI培地500μlに再懸濁します。再刺激後にIL-17Aの生産性の評価フローサイトメトリーによる表現型解析を実行します（6.3節を参照）。
- 特に指定のない限り、すべての手順で、4℃で6分間480×gで滅菌PBS中の細胞の主要な大部分を遠心分離し、および洗浄。
- 6〜8週齢CD45.2 RAG1に養子移入のためにこれらの細胞を使用してください - / - 免疫不全マウス。
- 冷滅菌PBSを用いて1×10 7細胞/ mlの細胞密度で細胞を再懸濁する。
- intrapによって細胞100μlを注入eritoneal注射、1マウスは、1×10 6個の細胞を受けるように、1ミリリットルツベルクリン注射器に25 G針を使用して。いくつかのマウスは、PBSのみまたはのTh17細胞を受け取り、他のマウスは、Treg細胞と共培養したTh17細胞を受け取ります。
注：無菌的にすべての手順を実行します。
2.成長C.感染のアルビカンス （感染前に1日）
- 接種の前に、CAF2-1 Cの 5個のコロニーを分散させる滅菌PBS懸濁液100μlでアルビカンス実験室株、および無菌培養液にサスペンションを追加します。
- Cの 5個のコロニーを接種するアルビカンス酵母窒素ベース（アミノ酸を含まないYNB）を50ml /ペプトン/デキストロースのブロス培地中で130 rpmで15-18時間、30℃で振とう培養器でインキュベートする。
- それが真菌の成長のための指標であるように、曇りのための培養液を監視します。
3. カンジダ収穫と（感染の日に）カウント手順
- 15ミリリットルのチューブにカンジダブロスの10ミリリットルを収集します。大きなボリュームの場合、50ミリリットルのチューブにカンジダを集める。
- 特に指定のない限り、すべての手順で、室温で5分間1900×gで芽胞子を遠心。上清を除去し、遠心分離によって出芽胞子をペレット。
- 複数のチューブが存在する場合、ペレットを滅菌PBSを添加すること、複数のチューブからのカンジダ出芽をプールし、計数のために10mlのPBSで再懸濁します。
- 1.5 mlマイクロチューブに芽胞子20μlのを取る2Xパラホルムアルデヒドの20μlを添加し、15〜20分間、室温でインキュベートする。顕微鏡下で血球計数器を用いて固定芽胞子を数える。
注：パラホルムアルデヒドは発がん性がある。唯一のヒュームフードで原液を開きます。 - 一方で、tは遠心分離することによって、少なくとも二回出芽胞子を洗浄することを繰り返すPBSで裾、および芽胞子をペレット。感染の準備ができて、ABSL1フード中で、室温で15 mlチューブ中のペレットにしてください。
- 感染芽胞子を再懸濁するために、RTでいくつかの滅菌PBSのままにしておきます。
- カウントした後、酵母細胞/ mlの2×10 8、酵母blastospore細胞数を調整するblastosporeペレットを滅菌PBSを加える。これは、マウスを感染させるために使用されるblastosporeの懸濁液である。
注：無菌的にすべての手順を実行します。
4.マウスの感染（セル転送後の3-5日）
注：以前に19,23-25 説明したように、基本的な感染手順が実行される。
- - / - 3日前にPBSまたは細胞を投与されたマウスRAG-1を計量。
- 自分の体重を使用して麻酔薬の投与量を計算します。のintrにより1mlのツベルクリン注射器に25 G針を使用して、ケタミン/キシラジン混合物（16.1 mg / mlの1.6 mg / mlで）を投与することによってマウスを麻酔aperitoneal注入。
- 体重10グラムあたり50μlを管理します。 （ すなわち、ケタミン0.8mgの体重のキシラジン/ 10gを0.08 mgまたはケタミン80mgの体重kg当たりキシラジン8mgのそれぞれ）。 15分毎に麻酔後つま先のピンチの応答を観察します。
注：この投与量は、感染の手続きのために十分である麻酔の60〜90分を誘導します。 - 乾燥から角膜を防ぐために、マウスの眼に眼科潤滑軟膏を適用します。目の潤滑剤が完全に乾くこととして、眼科潤滑ごとに45分を繰り返します。
- 体重10グラムあたり50μlを管理します。 （ すなわち、ケタミン0.8mgの体重のキシラジン/ 10gを0.08 mgまたはケタミン80mgの体重kg当たりキシラジン8mgのそれぞれ）。 15分毎に麻酔後つま先のピンチの応答を観察します。
- 麻酔中のマウスの水分補給を助けるために、前肢に隣接した背中に皮下に生理食塩水の1ミリリットル（0.9％のNaCl）を注入します。
- 新しい、きれいなケージを取得します。一度感染した新しいケージに各マウスを置く、一度感染手順1マウスに従ってください。最初のPBS /偽感染を実行してから、 カンジダ感染GROに進むups。
- 麻酔をかけたマウスをピックアップし、舌根を明らかにするために広い口を開きます。
- 舌下で90分間口腔内に、PBSまたはblastospore懸濁液50μlで飽和3ミリメートルの直径のコットンボールを置きます。コットンボールが移動しないようにすること、肺の混雑を防ぐために、マウスを15分毎にフロントとバックフリップ。
- 口腔内のシャムまたはカンジダ接種の90分を確保するために、すべてのマウスのためのタイマーを設定します。
- 加熱ランプ（4フィート離れて）下のケージ、および熱ゲルパッド上各マウスに保管してください。
- 舌が舌をlacerating歯を避けるために、歯から内側と離れて引き出されていることを確認してください。
- 90分の終わりに、マウスの口からコットンボールを削除します。 75分よりも早く麻酔から回復することができる任意のマウスを監視します。このような場合には、唯一のケタミン（40mg / kg）で再度麻酔。
5.ポストProcedurE（90分麻酔中）の監視
- 90分麻酔時の熱ゲルパッドを使用してください。
- 体温を維持し、窒息を防ぐために、マウスは、通常のトウモロコシの穂軸、マウスの寝具に回復することはできません。
- 麻酔から回復した後、背面の2箇所に滅菌0.9％のNaCl皮下の追加の1ミリリットルを管理する。
- 5 PBS（偽）ケージ当たり接種したマウスに追いつく。ハウスケージあたりわずか1〜2感染したマウス。
- 習慣と全体的な健康をグルーミング、体重の変化を下に注意することは手順の後に毎日のイニシャルと手順カードを記入します。
6.炎症を評価
6.1）減量
- 感染手順の前の日に開始し、感染時に毎日、マウスを計量。
注：一般的に、Th17細胞となしのT REGSを注射された免疫不全マウスを20に屈するによる-30％の重量損失は、真菌負荷19が増加し、炎症を悪化させた。
舌の6.2）組織学スコアリング
- 頸椎脱臼に続いてCO 2窒息によりマウスを生け贄に捧げる。
- 顎を開いて、ハサミやピンセットで舌を解剖する。舌を保持するために鈍い鉗子を使用し、ハサミを使用すると、舌のバックエンドを切開する口の奥に手を差し伸べる。
- 免疫細胞化学的ヘマトキシリンと舌組織のエオシン（H＆E）染色のために、氷冷PBSで舌組織をすすぐ。 2-3舌のための10％ホルマリンの5ミリリットルを加え、O / N 15ミリリットルチューブ内でそれらを修正。
- 翌日、ホルマリンを除去し、超固着を防止するために、70％エタノール5mlの組織を浸す。パラフィン包埋、切片とパラフィン切片の染色を続行するには商用サービスにそれらを送信します。
注：商業組織学サービスは、これらのステップを実行するために使用される。 - スライドをバック商業組織学サービスからたら、グレード、光学顕微鏡下で組織切片を観察することにより炎症。
- 0は炎症いるないと、0〜5のスコア、および5は最も重度の炎症である。表1を使用して炎症をスコア。
6.3）Th17細胞によるサイトカイン産生を
注：過剰なTNF-α産生が過剰な免疫病理のための読み出しの一つです。マウスに養子Th17細胞で転写される場合にのみ、それは、Th17細胞の過剰なTNF-αの産生と関連している免疫病理を引き起こす。
- 以前に記載された方法19,26を用いて、脾臓からの単一細胞懸濁液を、頸部リンパ節、腋窩リンパ節、および舌を集める。
- ブレフェルジンA（10μg/ ml）で4時間、ホルボールミリステートアセテート（PMA）（50ng / ml）およびイオノマイシン（500 ng / ml）を有する細胞を再刺激がlで添加AST 2時間。 PBSで細胞を洗浄し、製造業者の説明書に従って商業固定/透過処理キットを使用してそれらを修正する。
- 以前に19説明したように、蛍光色素結合抗TNF-α、抗IL-17AおよびROR-γtと抗体を用いて、イントラセルラーサイトカイン染色を行います。
- 3 / mlの最終濃度 - 簡単に言えば、2の抗IL-17AおよびROR-γT抗体、各抗体、抗TNF-αのカクテルで1Xの透過化バッファーで細胞を懸濁します。
- 室温で1時間、細胞をインキュベートする。
- インキュベーション後、1Xの透過化緩衝液で細胞を洗浄。
- フローサイトメトリー分析のために0.5％ウシ血清アルブミンを含む500μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁する。
- 翌日、ホルマリンを除去し、超固着を防止するために、70％エタノール5mlの組織を浸す。パラフィン包埋、切片とパラフィン切片の染色を続行するには商用サービスにそれらを送信します。
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Representative Results
このモデルでは、RAG-1におけるカンジダ感染したマウスと非感染マウスの両方- / -免疫不全背景が養子感染に3-5日前に、Th17細胞を移した。 10-12匹のマウスの合計は2それぞれ偽感染させた群のマウス、およびカンジダ感染群の各々 4-5で、実験に使用した。注入されたTh17細胞は、それぞれ、Thy1.1陽性またはCD45.1染色（ 図1A）を用いてインビボで追跡したように、ナイーブ細胞は、コンジェニックThy1.1陽性またはCD45.1マウスに由来した。共移入されたT regsは CD45.1 は Th17細胞と区別するCD45.2マウスに由来した。いくつかの実験のために、CB-17 Thy1.2 のscidレシピエントマウスに、Thy1.1陽性のBalb / Cマウスから得られたTh17ドナー細胞およびThy1.2コンジェニックマウスから得られたT regsは使用した。唯一のカンジダは、マウスを感染したが、非感染マウスが再構成されたCD45.1 +の採用と拡張性を示していない図1A）で開始されることを示している。結果は各群の一匹のマウスからのデータを表す。
唯一のT regsはと同時転写されたマウスにおいて、Foxp3の+ CD45.1陰性CD4 +細胞は、CLNにおいて検出された。これは注入されたTのREGSも感染部位（ 図1B）に動員されたことを示している。結果は各群の一匹のマウスからのデータを表す。感染したRAG-1は、一方で- / -重量を失う、感染の4日後に回収前に27示すように、コルチゾン免疫抑制マウスは、回復するが、さらに、失われた重量はなかった。 T regsはの存在下または非存在下でTh17細胞を投与したマウスの両方のグループは、最初に体重が減少した。しかし、T regsはを受けたマウスは、体重減少から回復し、感染を解決した。 2メートル氷は、各カンジダ感染群で偽感染群、及び4で使用した。コルチゾングループ内の3匹のマウスがいた。 Th17細胞を受けたマウスは、（ 図2）19徐々に体重が減少した。その群のマウスの一部を安楽死させなければならなかった。これらの結果は、そのグループ内のすべてのマウスの体重の平均値を示す。好中球が感染の初期クリアランスに必要とされていますが、組織での継続的な存在と動員は、未解決の炎症のサインです。したがって、好中球浸潤は、7日目、感染後のような後の時点で、Grは-1、好中球マーカーの発現を測定することにより、感染した舌で調べた。唯一のTh17細胞を受けたマウスは、T regsは （ 図3B）を注射したマウスと比較して、感染後一日も-4のGr-1 +好中球を含む高等炎症性浸潤（ 図3A）を有していた。これらの結果は、presencでTのREGSのeは、マウスは、より効率的に炎症を解決し、感染から回復した。
感染後7日目に、脾臓（SPLN）CLN及び舌の組織を単離し、そして単一細胞懸濁液を、フローサイトメトリー分析のために作られた。 CLNは、Th17細胞のみを受けたマウスでCD45.1 Th17細胞（ 図1）との高まりTNF-α産生を（ 図4A、4B）増加を明らかにした。一方、T regの受信者は 、Th17細胞の頻度を減少させ、Th17細胞（ 図1＆4A、4B）によるTNF-α産生の低下を示した。これらの実験において、2匹のマウスから採取し、プールされた単一のマウスのCLN、および舌組織からのデータが示されている。早期の時点でIL-17A産生がT regの受信者19に高かったが、両群の後の時点で、Th17細胞によるIL-17A産生が（データは示さない）最小であった。素酸シッフ染色舌のと同様のT REGSを受けたマウスは、5日目に菌をクリアし、7日目、感染後（ 図5）のに対し、唯一のTh17細胞を受けたマウスで増加した真菌の菌糸を示した。また、舌の炎症の組織病 理学スコアはまた、唯一のTh17細胞（ 図6）を受けたマウスと比較して、TのREGSを受けたマウスで減少炎症スコアを示した。スコアは、炎症は、乳頭の存在、などの舌の組織病理学的パラメータ、表面的な上皮層、目に見える酵母や菌糸、非解消感染を示す菌糸の侵入、基底層（継続的な組織修復の指標）の肥厚の完全性に基づいていた、そして免疫細胞（好中球およびTh17細胞）の浸潤の存在。これらの結果は、Th17細胞の注射は直接感染を減少させなかったことが示されたが、主C.によって引き起こされる真菌負担と免疫病理の増加アルビカンス infec免疫病理を改善のT REGSの共同移転のに対しション、。
図1. Th17細胞を注射し、T reg細胞を動員し、Cの流入領域リンパ節（CLN）に拡大するアルビカンス感染させたマウス（A）RAG-1 - 。。/ - CD45.2マウスはTh17細胞やTh17の+で再構成した5日間のTh17条件で分極したT reg細胞 。 Th17細胞は、CD45.1ジェニックマウスから得られ、T reg細胞は、CD45.2マウスから得た。いくつかのマウスは、すべての細胞（偽またはカンジダ+ PBS）を受信しませんでした。各グループのレシピエントマウスは、偽対照またはC.に感染していたアルビカンス 。感染後5日目に、CLNであったisolatedは、単一の細胞懸濁液を作り、（FSC、SSC散乱内のすべての白血球上でゲーティング）フローサイトメトリーによるTh17細胞を発現する注入されたCD45.1を追跡する（B）ラグ-1 - / -マウスは、Th17細胞で再構成したCD45.2又はTh17の+ T reg細胞は、「A」およびCに感染している。 アルビカンス。CLN単一細胞懸濁液を作製し、（すべてのCD4細胞にゲート設定）フローサイトメトリーによってCD45.1および細胞内Foxp3の発現を測定するために単離した。プロットのT regのゲートが負のCD45.1、のFoxp3 + CD4 +細胞を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.注入Th17細胞は、Cにおける体重減少を引き起こす 。T regsは アルビカンスに感染したマウスとの同時投与は、体重減少からの回復を改善する。SCID CB-17マウスは、 図1Aのように、Th17細胞もしくはTh17の+ T reg細胞で再構成した。 3日後、レシピエントマウスはC.に感染していたアルビカンス。各群のいくつかのマウスは、偽対照で感染させた。免疫抑制マウスは、酢酸コルチゾン（コート）の注射を受けた。のd 1（感染前に1日）に対して指示された細胞およびC.アルビカンスに感染して再構成マウスにおけるパーセント体重変化が示されている。データは、感染していない（シャム+ PBS）のマウスからの重量データに正規化基準にしています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図3.注入Th17細胞は、Cで舌免疫病理を引き起こす。 アルビカンスマウスおよびT regsは共投与 C.の舌の免疫病理組織学的評価を低減感染 アルビカンスは、マウスを感染させた。マウスは指示された細胞を用いて再構成し、 図1Aのように感染させた。感染後5日目に、舌はマウスから単離した。舌の（A）矢状切片を、免疫細胞の炎症および浸潤（IF）を評価するためにH＆Eで染色した。 （Pa）とし、（Epの）乳頭それぞれ舌の上皮層を表す。 at50X倍率表示スライドの顕微鏡像。（B）抗GR-1抗体を用いたGR-1、好中球のマーカーのための組織学的免疫染色 （CLONE：IFで示さ感染後5日目の舌切片における1A8-Ly6g）（ブラウン）。 100Xの倍率で観察スライドの顕微鏡画像が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
TのREGSの図4.同時投与は、注入されたTh17細胞にTNF-αを低減します。 （A）RAG-1 - / - CD45.2マウスTh17細胞やTh17の+ T reg細胞を用いて再構成し、Cで感染させ、 アルビカンスは、 図1Aのように、感染後5日目に、CLNおよび舌組織を単一細胞懸濁液を作製するために単離した。これらの細胞は、細胞内staini前にPMAおよびイオノマイシンで再刺激したNGおよびフローサイトメトリー分析する。 Th17細胞の細胞内ROR-γtとし、TNF-α発現のフローサイトメトリー等高線プロットが示されている。（B）、「A」のように実施した実験からTNFαpositive細胞のパーセンテージの統計的表現（CD4 +細胞上でゲーティング）。データは、非感染群では4匹のマウス、および各感染群で6匹のマウスを表し、2つの独立した実験からプールされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.免疫病理もCで増加真菌負担と関連しているの増加。 アルビカンス感染させたマウス。CB-17 SCIDマイク電子のBalb / C Th17細胞で再構成し、またはFigure1AのようなTh17細胞+ T reg細胞 、およびC.で感染させた。 アルビカンス 。感染マウスからの舌の組織学的評価を示している。感染後7日目に、舌を採取し、真菌病変、炎症および浸潤細胞の（IF）を評価するために、及び（CA）を真菌を検出するための素酸シッフ（PAS）で染色した。スライドはat100X倍率を観察した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6. TのREGSは、Cで免疫病理を改善する。 アルビカンス感染させたマウスを。 scidマウスは、 図1AとのBalb / C Th17細胞、またはTh17細胞+ T reg細胞で再構成し、そしてC.感染させたアルビカンス 。 図5のように評価し、感染したマウスからの舌の平均組織学的スコアの統計的表現。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| スコア | 特徴 |
| 0 | 0 - 目に見える酵母ないか、または菌糸、舌の背側表面上にそのまま表面的な上皮、乳頭明らかに存在し、損傷していない（または組織内の単核細胞浸潤してもしなくてもよい）、基底層の無い肥厚、ない浸潤免疫細胞。 |
| 1 | 1 - 目に見える酵母または菌糸E、不規則なまたはわずかに損傷を受けた表面的な上皮、最小限のダメージと頻度の低い浸潤免疫細胞で明らかに存在乳頭。 |
| 2 | 2 - 乳頭減少したが、ダメージ、基底層の肥厚と頻繁な浸潤免疫細胞に存在する。 |
| 3 | 3 - 時折見える酵母のクラスタや菌糸、損傷した乳頭の証拠、損傷した上皮の臨時の病変、基底層とし、免疫細胞浸潤の小さなクラスタの肥厚を侵略。 |
| 4 | 4 - 頻繁に目に見える酵母のクラスタや菌糸、損傷した乳頭の証拠、損傷した上皮の頻繁な病変、免疫細胞の最小限の浸潤、基底層および免疫細胞浸潤の頻繁なクラスターの肥厚を侵略。 |
| 5 | 5 - 背側表面全体に菌糸を侵略、広範囲に損傷を受けた上皮、大量の浸潤の普及証拠いくつかの免疫細胞、または検出不可能な乳頭、基底層の肥厚と免疫細胞浸潤の高頻度と大きなクラスタ。 |
表1：組織学的スコアリング値
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Discussion
このモデルは、経口での誘導に基づいているアルビカンス感染依存性Th17炎症。なぜならT regsはが存在しない、のTh17細胞の誘導された炎症は無拘束であり、不十分な解決免疫病理をもたらす。Th17細胞として偏光のインビトロ由来のナイーブCD4細胞を養子移入のために使用した。 40 - 培養CD4 +細胞の50％が3日目の周りに検出可能なIL-17Aの発現（Th17細胞）を示し、したがって、マウスにおける注射のために使用した。モデルの主な利点は、Th17細胞を効率的にT regの注射で改善することができる感染症の特定の免疫病理を引き起こすことです。したがって、モデルは、陽性対照としての Treg注射で免疫調節戦略をテストするために使用することができる。炎症は、容易に感染したマウスのTh17細胞による体重減少、組織病理学的スコアおよび炎症誘発性サイトカイン産生に基づいて評価される。
Tの後彼は、それらが二次リンパ器官及び舌、感染の原発部位を含む様々な組織に移行し、Th17細胞の移動を養子。感染後、他の炎症細胞はまた、感染をクリアするために舌を募集した。しかし、T regの仲介免疫調節することなく、Th17細胞自体が感染を解決しますが高まり免疫病理の原因となっていませんでした。 TのREGSの共同転送は完全に炎症を解決しました。興味深いことに、T regsはの非存在下で悪化した炎症を有するマウスは、また増加真菌負荷を示した。我々の以前の報告は、これがT regsは有するものと比較して、マウスにおいて減少IL-17A産生に起因することを示した。我々の現在の実験は、それはまた、おそらく上皮細胞のアポトーシスの増加真菌負担28を大きくすることにより、炎症による悪化の増加TNF-αであってよいという考えを支持している。粘膜におけるIL-17Aの免疫防御効果を考慮すると、、私たちは、真菌負担の増加に伴って観察する炎症性病理がTh17細胞または宿主抵抗性の欠如によって産生されたIL-17Aによるものではないと信じています。それによりTNF-α注入Th17細胞によって産生さおそらく他の炎症誘発性サイトカインに起因する。 Th17細胞を欠くマウスは、最小限の炎症および感染のその後の解像度を示し、唯一のTh17細胞を受けたものは、重度の体重減少（ 図1）に屈し- / -これはラグ観察によって確認することができる。 - / -マウスは、非常に免疫病理27なし主要OPC感染をクリアし、このデータに一致して、それはまた、以前にラグが示されている。これらの条件下では、先天性免疫細胞を産生するIL-17Aに依存代償機構はラグでの感染をクリアすることが示されている- / -マウス17,29,30。 Th17細胞と好中球動員により産生されるIL-17Aは、感染の初期段階での保護の役割を果たしているが、EXCは、一緒になって、Th17細胞によるTNF-αおよび他のサイトカインの様格生産、および好中球の原因の継続的な存在は、免疫病理を悪化させた。 Th17細胞によって産生さTNF-α以外の炎症性サイトカインの役割は、免疫病理との関連において検討されていない。
モデルの主な制限は、それが人間のOPCに生理学的に関連しているかどうかという問題である。 Th17細胞は、Th17細胞の慢性的活性化は、OPCにおいて病原性であるかどうか、いくつかの口腔疾患における病理学的メディエーターであることが示されているが調査されるままである。 C.の役割を示唆する最近の知見と炎症および癌におけるアルビカンスは 、口腔内でのTh17免疫病理は、調査31のアクティブフィールドです。したがって、ここで説明されているモデルは、より慎重にTh17細胞の特定の役割を研究するために使用することができ、どのように彼らは経口免疫疾患や口腔癌の中で詳細な洞察を与えて、生来の免疫細胞と相互作用する。
技術における重要なステップは、適切な採用と養子移入されたTh17細胞の拡大である。これは、転送前の生存能力およびin vitroでの偏Th17細胞のIL-17A産生に非常に依存する。これは、フローサイトメトリーによるそれらの生存およびサイトカイン産生19を分析をテストするのが最善です。のTh17細胞の注射とマウス感染の適切な実行は、感染依存性Th17免疫病理につながる。このモデルは、他の感染症との関連でのTh17免疫病理および口腔の炎症を阻止するための戦略をテストするために適用することができる。また、このモデルを使用して、1つの二次再感染を行い、慢性感染症との関連で免疫病理を悪化におけるTh17細胞の役割を研究することができる。このモデルは免疫不全マウスを含むように、慢性カンジダ感染の再発に苦しむAIDS及びPID患者に見られる経口腸内毒素症に非常に関連し得る。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CAF-2 | University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) | - | Candida culture |
| U-bottom 96 well plates | Fisher | 055588 | Used for cell culture |
| a-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| m-IL-6 | Bio Basic | RC232 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| h-TGF-b | R&D | 240-B | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IFN-g | eBiosciences | 16-7311-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IL-4 | eBiosciences | 16-7041-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| α-IL17A ef660 | eBiosciences | 50-7177-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| α-TNFa-PE-Cy7 | eBiosciences | 25-7423-41 | Used for cell culture - 1:100 |
| α-RORgt PE | eBiosciences | 12-6981-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium | Bio Basic | S507.SIZE | Mediium for candida growth |
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4300 | Incubation growth for candida |
| 15 ml tubes | Bio Basic | BT888-SY | Used for cell culture and candida growth |
| 50 ml tubes | Bio Basic | CT 788-YS | Used for cell culture and candida growth |
| Table top Centrifuge | VWR International LLC | 82017-654 | For pelleting candida -900 g |
| Allegra Centrifuge | Beckman Coulter | 392302 | Cell culture - 480 g |
| 1.5 ml eppendorf tubes | Bio Basic | BT620-NS | Preparing final concentration of candida |
| 2x paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixing candida for count |
| Hemocytometer | VWR International LLC | 15170-172 | Counting cells |
| PBS - Phosphate Buffered Saline | Bio Basic | PD8117 | Preparation of buffers |
| Ketamine/xylazine | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | Obtained from ARC approved protocol for anesthesia |
| Ophthalmic lubricant ointment | Allergan | - | Eye ointment for animals to prevent dryness |
| Saline (0.9% NaCl) | G Biosciences | 786-561 | Administerd to animals to prevent dehydration |
| 3-mm-diameter cotton wool ball | VWR International LLC | BP7603 | 3 mm balls for candida infection |
| Heat gel pads | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | for maintaining the body temperaturre and fast recovery |
| Hematoxylin and Eosin staining | Histoserv - MD | - | Tissue histology |
| 10% formalin | Electron Microscopy Sciences | JC1111/MC | Tissue histology |
| 70% ethanol | VWR International LLC | 97064-490 | Sterilization purpose |
| PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | Restimulation of cells |
| Ionomycin | Life Technologies | 124222 1mg | Restimulation of cells |
| Fixation permeabilization kit | eBiosciences | E16913-106 | Fixing cells for Flow cytometry |
| Tuberculin syringes | BD Biosciences | 309659 | Mice injection |
| 25 G x 3/8 needles | BD Biosciences | 309626 | Mice injection |
| Rag1 -/- mice | Jackson laboratories | Stock no: 002216 | Recipient mice |
| CD45.1 congenic mice | Jackson laboratories | Stock no:002014 | Donor Th17 cells |
| CB17-SCID mice | Jackson laboratories | Stock no: 001303 | Recipient mice |
| Balb/c mice | Jackson laboratories | Stock no: 000651 | Donor Th17 cells |
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