Protocol
MERK: eksperimenter med mus ble utført i henhold til den institusjonelle dyrevelferd komité (IACUC) retningslinjer.
1. Rekonstitusjon av Rag-en - / - Mus med I n Vitro Cultured Th17 celler (Tre dager før infeksjon)
- For å etablere Th17-celler, CD4 + kultur CD44low CD62Lhigh CD25- naive T-celler (3 x 104) i U-bunn 96 brønners plater alene eller ko-kultur dem sammen med 3 x 104 CD4 + CD25 + foxp3 + Tregs i nærvær av oppløselig α-CD3 (1 pg / ml), α-CD28 (2 ug / ml) antistoffer og antigen-presenterende celler, under betingelser (Th17 polarisert ved hjelp av IL-6 (25 ng / ml), TGF-β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) og α -il-4 (2 ug / ml)) i tre til fire dager.
MERK: Naive celler og T regs ble sortert ved hjelp av fluorescens aktivert celle sortering (FACS) end magnetisk celleisoleringsprosedyrer og dyrket som tidligere beskrevet 19-22. - På dag 4, etter resuspendering i Th17 celler ved hjelp av pipette, samle dem fra kulturer, og sentrifugere dem under sterile betingelser.
- Ta en liten delmengde av disse cellene til å undersøke sin levedyktighet og for fenotyping. Suspender dem i 500 mL av RPMI medium, legge propidiumjodid (200 ng / ml) og vurdere sin levedyktighet umiddelbart ved flowcytometri. Utføre fenotyping av flowcytometri vurdering av IL-17A produksjon etter restimulering (se avsnitt 6.3).
- Sentrifuge og vaskes hovedparten av cellene i steril PBS ved 480 x g i 6 minutter ved 4 ° C i alle trinnene, med mindre annet er angitt.
- Bruke disse cellene for adoptiv overføring til 6-8 uke gamle CD45.2 Rag1 - / - immunodeficient mus.
- Resuspender cellene ved 1 x 10 7 celler / ml celletetthet ved hjelp av kald steril PBS.
- Injisere 100 ul av cellene ved intraperitoneal injeksjon, bruker 25 G nåler på en ml tuberkulin sprøyter, slik at en mus får en x 10 6 celler. Noen mus vil motta PBS eller Th17 celler bare, og andre mus vil motta Th17 celler som var co-kultivert med Treg celler.
MERK: Utfør alle trinnene aseptisk.
2. Økende C. albicans for infeksjon (en dag før infeksjon)
- Før vaksinasjonen, spre fem kolonier av CAF2-1 C. albicans laboratorium belastning i 100 mikroliter sterilt PBS suspensjon, og legge til suspensjon til den sterile kjøttkraft.
- Vaksinere fem kolonier av C. albicans i 50 ml av gjær-nitrogenbase (YNB uten aminosyrer) / pepton / dekstrose-medium medium og inkuberes i en rysteinkubator ved 30 ° C i 15-18 timer ved 130 rpm.
- Overvåke kjøttkraft for skydekke, som det er en indikasjon for vekst av sopp.
3. CandidaHøsting og Counting Prosedyre (På Day of Infection)
- Samle 10 ml Candida buljong i 15 ml rør. For større volumer, samle Candida i 50 ml rør.
- Sentrifuger blastosporer ved 1900 xg i 5 min ved RT i alle trinnene med mindre annet er spesifisert. Pellet blastosporer ved sentrifugering, etterfulgt av fjerning av supernatanten.
- Hvis det er mer enn ett rør, basseng Candida blastosporer fra flere rør, tilsetning av steril PBS til pelletene og resuspendere dem i 10 ml PBS for telling.
- Ta 20 ul av blastosporer i 1,5 ml mikrosentrifugerør, tilsett 20 ul av 2X paraformaldehyd og inkuber ved romtemperatur i 15-20 min. Telle de faste blastosporer bruker hemocytometer under mikroskopet.
MERK: Paraformaldehyde er kreftfremkallende. Åpne ufortynnet løsning bare i avtrekkshette. - I mellomtiden, gjentar vaske blastosporer minst to ganger, ved å sentrifugere them i PBS, og pelletering av blastosporer. Hold pellets i 15 ml rør ved RT, i ABSL1 hette, klar for infeksjon.
- La noen steril PBS ved RT for resuspending de blastosporer for infeksjon.
- Etter telling, tilsett sterilt PBS til blastospore pellet for å justere blastospore gjærcellenumrene til 2 x10 8 av gjær celler / ml. Dette er blastospore suspensjon som vil bli brukt til å infisere musene.
MERK: Utfør alle trinnene aseptisk.
4. Mus Infeksjon (3-5 dager etter Cell Transfer)
MERK: Den grunnleggende infeksjon prosedyren er utført som beskrevet tidligere 19,23-25.
- Vei Rag-en - / - mus som fikk PBS eller cellene tre dager tidligere.
- Beregne dosen av anestesimidler ved hjelp av sin kroppsvekt. Bedøve mus ved administrering av ketamin / xylazin blanding (16,1 mg / ml og 1,6 mg / ml), ved bruk av 25 g nåler av 1 ml tuberkulin sprøyter, ved intraperitoneal injeksjon.
- Administrere 50 ul pr 10 gram kroppsvekt. (Dvs. 0,8 mg ketamin og 0,08 mg xylazin / 10 g kroppsvekt, eller 80 mg av ketamin og xylazin 8 mg per kg kroppsvekt henholdsvis). Observere for toe klype respons hver 15 min etter anestesi.
MERK: Denne dosen vil indusere 60-90 min av anestesi, noe som er nok for infeksjon prosedyre. - Påfør oftalmisk smøremiddel salve i øynene av mus for å hindre at hornhinner tørker ut. Øyet smøremiddel kan tørke ut, gjenta oftalmisk smøring hvert 45 min.
- Administrere 50 ul pr 10 gram kroppsvekt. (Dvs. 0,8 mg ketamin og 0,08 mg xylazin / 10 g kroppsvekt, eller 80 mg av ketamin og xylazin 8 mg per kg kroppsvekt henholdsvis). Observere for toe klype respons hver 15 min etter anestesi.
- Injisere 1 ml saltvann (0,9% NaCl) subkutant på baksiden tilstøtende til forbena, slik at rehydrering av musene i løpet av anestesien.
- Innhente en ny, ren bur. Følg prosedyren infeksjon en mus i en tid, å plassere hver mus i den nye buret gang infisert. Utfør PBS / humbug infeksjon først, og deretter gå videre til Candida infeksjon groups.
- Plukke opp bedøvet mus og åpne munn for å avdekke undersiden av tungen.
- Plassere en 3 mm diameter bomullsdott mettet med 50 ul PBS eller blastospore suspensjon, sublingualt i munnhulen i 90 min. Vend mus hvert 15 min foran og bak for å hindre lunge lunger, slik at bomull baller ikke beveger seg.
- Sett opp en timer for hver mus for å sikre 90 min av Sham eller Candida vaksinasjon i munnhulen.
- Oppbevar dem i et bur under varmelampe (4 meter), og hver mus på varme gel pads.
- Sørg for at tungen er trukket inne og bort fra tennene, for å unngå tenner Skjærende smerter tungen.
- Ved slutten av 90 minutter, fjern bomullsdott fra munningen av musen. Se etter eventuelle mus som kan gjenopprette fra anestesi raskere enn 75 minutter. I et slikt tilfelle, bedøve dem igjen med ketamin (40 mg / kg) bare.
5. Post procedure Monitoring (under 90 min Anesthesia)
- Bruk varme gel pads under 90 min anestesi.
- For å opprettholde kroppstemperaturen og for å hindre kvelning, ikke la mus å komme på den vanlige maiskolbe mus sengetøy.
- Etter oppvåkning fra anestesi, gi en ytterligere 1 ml steril 0,9% NaCl subkutant på to steder på ryggen.
- Hold deg til fem PBS (sham) inokulert mus per bur. Huset bare 1-2 infiserte mus per bur.
- Fyll ut prosedyren kort med initialer hver dag etter inngrepet for å notere endringene i kroppsvekt, grooming vaner og generelle helse.
6. Vurdere Betennelse
6.1) Vekttap
- Vei mus hver dag i løpet av infeksjon, som starter på dagen før infeksjon prosedyre.
MERK: Vanligvis immunsvikt mus injisert med Th17 celler og uten T regs bukke til 20-30% Vekttap på grunn av øket belastning sopp 19 og forsterket inflammasjon.
6.2) Histologi scoring av tungen
- Ofre mus ved CO 2 kvelning fulgt av halsdislokasjon.
- Åpne kjevene og dissekere ut tungen med saks og pinsett. Bruk butt pinsett til å holde tungen, og ved hjelp av saks nå ut til baksiden av munnen til langsgående snitt i bakenden av tungen.
- For immunocytokjemisk hematoxylin og eosin (H & E) farging av tungen vev, skyll tungen vev med iskald PBS. Tilsett 5 ml av 10% formalin for 2-3 tunger og fikse dem O / N i 15 ml rør.
- Neste dag, fjern formalin og fordype vev i 5 ml 70% etanol for å hindre hyper-fiksering. Send dem ut til kommersiell tjeneste for å fortsette med parafin embedding, seksjonering og farging av parafinsnitt.
MERK: Commercial histologi tjenesten brukes til å utføre disse trinnene. - Når lysbildene er tilbake fra det kommersielle histologi service, grade betennelsen ved å observere vevsdelene under et lysmikroskop.
- Resultat fra 0 til 5, der 0 er ingen inflammasjon, og 5 er den mest alvorlig betennelse. Resultat betennelsen ved hjelp tabell 1.
6.3) cytokinproduksjon med Th17 cellene
MERK: Overdreven TNF-α produksjon er en av de lettleselig for overdreven immunpatologi. Når mus adoptivt overført med Th17-celler bare, fører det immunpatologi som er forbundet med for mye TNF-produksjon i α Th17-celler.
- Samle en enkelt celle suspensjon fra milt, cervical lymfeknuter, axillaris lymphnodes, og tunge, ved hjelp av tidligere beskrevne metoder 19,26.
- Restimulere cellene med forbolmyristatacetat (PMA) (50 ng / ml) og Ionomycin (500 ng / ml) i 4 timer med Brefeldin A (10 ug / ml) tilsatt i last 2 timer. Vask cellene med PBS og fikse dem ved hjelp av en kommersiell Fiksering / permeabilization kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Utføre intracellulært cytokin farging ved hjelp av fluorkrom konjugert anti-TNF-α, anti-IL-17A og ROR-γt antistoffer som tidligere beskrevet 19.
- I korthet, resuspender cellene i 1X permeabilization buffer med cocktail av anti-TNF-α, anti-IL-17A og ROR-γt antistoffer, hvert antistoff på 2 - 3 pg / ml sluttkonsentrasjon.
- Cellene inkuberes i 1 time ved RT.
- Etter inkubering vaskes cellene med 1X permeabilization buffer.
- Resuspender cellepelleten i 500 ul PBS med 0,5% bovint serumalbumin for strømningscytometri-analyse.
- Neste dag, fjern formalin og fordype vev i 5 ml 70% etanol for å hindre hyper-fiksering. Send dem ut til kommersiell tjeneste for å fortsette med parafin embedding, seksjonering og farging av parafinsnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne modellen, både Candida -infected mus og ikke-infiserte mus i Rag-en - / - immunodeficient bakgrunn ble adoptivt overført med Th17 celler 3-5 dager før infeksjonen. I alt 10 til 12 mus ble anvendt for eksperimentene, med to mus i hver Sham infisert grupper og 4-5 i hver av Candida-infiserte grupper. Naive celler ble avledet fra congenic Thy1.1 eller CD45.1 mus, slik at injiserte Th17-celler ble sporet in vivo ved hjelp av Thy1.1 eller CD45.1 farging henholdsvis (figur 1A). Co-overført T regs ble avledet fra CD45.2 mus for å skille dem fra CD45.1 Th17 celler. For noen eksperimenter, CB-17 SCID-Thy1.2 resipientmus, Th17 donorceller oppnådd fra Thy1.1 Balb / C mus og T kjørte oppnådd fra congenic Thy1.2 mus ble benyttet. Bare Candida -infected mus, men ikke infisert mus utstilt rekruttering og utvidelse av rekonstituert CD45.1 + (figur 1A). Resultatene representerer data fra en mus i hver gruppe.
Bare i mus som er co-overført med T regs, ble foxp3 + CD45.1 negativ CD4 + celler påvist i CLN. Dette viser at de injiserte T kjørte ble også rekruttert til infeksjonsstedet (figur 1B). Resultatene representerer data fra en mus i hver gruppe. Mens smittet Rag-en - / - gå ned i vekt og gjenvinnes etter 4 dager med smitte, fikk kortison immunsupprimerte mus ikke gjenopprette men ytterligere mistet vekt, som vist tidligere 27. Begge grupper av mus som mottok Th17-celler i nærvær eller fravær av T kjørte tapt vekt i utgangspunktet. Men musene som fikk T regs utvinnes fra vekttap og løst infeksjonen. 2 misen ble brukt i Sham smittet gruppe, og 4 i hver Candida infiserte gruppe. Det var 3 mus i kortison gruppe. Musene som fikk Th17 celler bare, mistet vekt progressivt (figur 2) 19. Noen av musene i den gruppen måtte avlives. Disse resultater viser gjennomsnittet av vektene av alle musene i denne gruppen. Selv neutrofiler er nødvendig for den første klaring av infeksjonen, er deres kontinuerlige tilstedeværelse og rekruttering i vevet et tegn på inflammasjon uløst. Derfor nøytrofil infiltrering ble undersøkt i den infiserte tungen, ved å bestemme ekspresjon av en nøytrofil markør, Gr-1, ved senere tidspunkter som dag 7 etter infeksjon. Mus som mottok Th17-celler bare, hadde høyere inflammatoriske infiltrater (figur 3A), inkludert Gr-1 + nøytrofiler selv dag-4 etter infeksjonen, sammenlignet med de mus injisert med T kjørte (figur 3B). Disse resultatene viste at i presence av T regs, mus løst betennelsen mer effektivt og utvinnes fra infeksjon.
På dag 7 etter infeksjon, ble milt (SPLN), CLN og tunge vev isolert, og en enkelt cellesuspensjon ble gjort for flowcytometri analyser. CLN avslørte øket CD45.1 Th17-celler (figur 1) og øket TNF-α produksjon (figur 4A, 4B) i mus som mottok bare celler Th17. På den annen side, T reg mottakere viste redusert hyppighet av Th17-celler og redusert TNF-α produksjon av Th17-celler (figur 1 og 4A, 4B). I disse eksperimentene blir data fra CLN fra en enkelt mus og tunge vev høstet og slått sammen i 2 mus er vist. Selv på tidlige tidspunkter IL-17A produksjonen var høyere i T reg mottakere 19, ved senere tidspunkter i begge gruppene, IL-17A produksjon av Th17 celler var minimal (data ikke vist). Periodisk Acid Schiffs fargingav tungen viste økt sopp hyfer i mus som fikk Th17 celler bare, mens musene som fikk T regs samt ryddet sopp på dag-5 og dag-7 etter infeksjon (figur 5). Videre viste histopatologi scoring av tungen betennelse også redusert betennelse score i mus som fikk T regs, sammenlignet med mus som fikk bare Th17 celler (figur 6). Utføre betennelse var basert på tungen histopatologiske parametre slik som tilstedeværelse av papiller, den intakte den overfladiske epitellaget, synlig gjær eller hyfer, invaderende hyfer som indikerer ikke-oppløsnings infeksjon, fortykkelse av basallaget (som indikerer pågående vevsreparasjon), og tilstedeværelsen av infiltrerende immunceller (nøytrofiler og Th17-celler). Disse resultatene viser at injeksjon av Th17 celler ikke direkte redusere infeksjon, men økte sopp byrde og immunpatologi forårsaket av primær C. albicans Infecsjon, mens co-overføring av T regs bedres immunpatologi.
Figur 1. Injisert Th17 celler og T-reg cellene rekruttere og utvide i de drenerende lymfeknuter (CLN) av C albicans infiserte mus (A) Rag-1 -.. / - CD45.2 mus ble rekonstruert med Th17 celler eller Th17 + T reg celler som ble polarisert i henhold Th17 betingelser i 5 dager. Th17 celler ble hentet fra CD45.1 congenic mus og T reg celler ble hentet fra CD45.2 mus. Noen mus har ikke mottatt noen celler (Sham eller Candida + PBS). Resipientmus i hver gruppe ble smittet med humbug kontroller eller med C. albicans. På dag 5 etter infeksjon, CLN var ISOLATed å lage en enkelt celle suspensjon og spore den injiserte CD45.1 uttrykker Th17 celler ved flowcytometri (inngjerdet på alle leukocytter i FSC, SSC scatter) (B) Rag-en -. / - CD45.2 mus ble rekonstruert med Th17 celler eller Th17 + T reg celler som i "A" og albicans. CLN infisert med C. ble isolert for å lage en enkelt celle suspensjon og måle CD45.1 og intracellulær foxp3 uttrykk ved flowcytometri (inngjerdet på alle CD4-celler). De T reg portene i plottene viser CD45.1 negativ, foxp3 + CD4 + celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Injisert Th17 celler føre til vekttap i C . Albicans infiserte mus og samtidig administrering av T regs forbedrer utvinning fra vekttap. SCID CB-17 mus ble rekonstruert med Th17 celler eller Th17 + T reg celler som i figur 1A. 3 dager senere ble resipientmus infisert med C. albicans. Noen mus i hver gruppe ble smittet med humbug kontroller. Immunsupprimerte mus fikk kortison acetat (Cort) injeksjon. Den prosentvise vektendring hos mus rekonstituert med angitte celler og infisert med C. albicans, både med hensyn til d-1 (en dag før infeksjon) er vist. Data er normalisert i forhold til vektdata fra uinfiserte (Sham + PBS) mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
"Src =" / files / ftp_upload / 52538 / 52538fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Injisert Th17 celler føre tungen immunopathology i C. Albicans infiserte mus og samtidig administrering av T regs reduserer immunpatologi. Histologisk evaluering av tungene i C. albicans infiserte mus. Mus ble rekonstituert med angitte celler infisert og som i figur 1A. På dag 5 etter infeksjon, ble tunger isolert fra mus. (A) sagittal deler av tungene ble farget med H & E for å vurdere inflammasjon og infiltrasjon (IF) av immunceller. (Pa) og (Ep) betegne papiller og epitellaget av tungen hhv. Mikroskopiske bilder av lysbildene så at50X forstørrelse. (B) Histologisk immunofarging for Gr-en nøytrofile markeringen med anti Gr-1 antistoff (Clone: 1A8-Ly6g) i de tunge deler på dag 5 etter infeksjon (brun, betegnet ved IF). Mikroskopiske bilder av lysbildene så på 100X forstørrelse vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Samtidig administrering av T regs reduserer TNF α i injisert Th17 celler. (A) rag-1 - / - CD45.2 mus ble rekonstituert med Th17-celler eller Th17 + T-celler og reg infisert med C. albicans som i figur 1A. På dag 5 etter infeksjon, CLN og tunge vev ble isolert for å lage en enkel cellesuspensjon. Disse cellene ble restimulert med PMA og Ionomycin før intracellulær staining og flowcytometri analyser. Strømningscytometrisk kontur plott av intracellulær ROR-γt og TNF α ekspresjon av Th17-celler er vist (gated på CD4 + -celler). (B) Statistisk representasjon av prosentandelen av TNFαpositive celler fra forsøk utført som i "A". Data representerer fire mus i infisert gruppe, og seks mus i hver infiserte gruppe, og er samlet fra to uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Økt immunpatologi er også assosiert med økt sopp byrde i C. Albicans infiserte mus. CB-17 scid mice ble rekonstruert med Balb / C Th17 celler, eller Th17 + T reg celler som i Figure1A, og ble smittet med C. albicans. Histologisk evaluering av tungen fra infiserte mus er vist. På dag 7 etter infeksjon, ble tunger høstet og farget med perjodsyre Schiff s (PAS) for å vurdere sopp lesjoner, inflammasjon og infiltrasjon (IF) av celler, og for å detektere sopp (Ca). Skinnene ble sett at100X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. T regs bøte immunopathology i C. Albicans infiserte mus. scid mus ble rekonstruert med Balb / C Th17 celler, eller Th17 + T reg celler som i figur 1A, og ble smittet med C. albicans. Statistisk representasjon av de gjennomsnittlige histologiske score til tunger fra infiserte mus vurdert som i figur 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Score | Kjennetegn |
| 0 | 0 - ingen synlig gjær eller hyfer, intakt overflateepitel den dorsale overflate av tungen, papiller klart til stede og uskadet (kan eller kan ikke være infiltrerende mononukleære celler i vev), ingen fortykkelse av basallaget, ingen infiltrerende immunceller. |
| 1 | 1 - ingen synlig gjær eller hyphae, fillete eller litt skadet overflateepitel, papiller tydelig tilstede med minimal skade og sjeldne infiltrere immunceller. |
| 2 | 2 - papiller redusert, men til stede med skade, fortykkelse av basal lag og hyppige infiltrere immunceller. |
| 3 | 3 - sporadiske klynger av synlig gjær og invadere hyfer, bevis av skadet papiller, sporadiske lesjoner av skadede epitel, fortykkelse av basal lag og og små klynger av infiltrere immunceller. |
| 4 | 4 - hyppige klynger av synlig gjær og invadere hyfer, bevis av skadet papiller, hyppige lesjoner av skadede epitel, minimal infiltrasjon av immunceller, fortykkelse av basal lag og hyppige klynger av infiltrere immunceller. |
| 5 | 5 - utbredt bevis på invaderende hyfer, omfattende skadet epitel over framsiden, stor infiltrasjon avimmunceller, få eller ingen påviselig papiller, fortykkelse av basallaget og svært hyppige og store klynger av infiltrere immunceller. |
Tabell 1: Histologiske Scorings Verdier
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne modellen er basert på induserende oral C. albicans infeksjon avhengig Th17 betennelse. På grunn av fraværet av T kjørte, er Th17 celle indusert inflammasjon uhemmet og fører til dårlig løst immunpatologi. In vitro avledet naive CD4-celler polarisert som Th17-celler ble anvendt for adoptiv overføring. 40 - 50% av den dyrkede CD4 + celler viser påvisbar IL-17A ekspresjon rundt dag 3 (Th17-celler), og derfor ble anvendt for injeksjon i mus. Den store fordelen med modellen er at Th17 celler forårsake infeksjon spesifikk immunpatologi som effektivt kan bedres med T reg injeksjon. Således modellen kan bli anvendt for å teste immunmodulering strategier med T reg injeksjon som en positiv kontroll. Betennelse er lett vurderes basert på vekttap, histopatologiske scoring og pro-inflammatorisk cytokin produksjon av Th17 celler av den infiserte mus.
Etter than adoptiv overføring av Th17 celler, migrert de til sekundære lymfoide organer og ulike vev, inkludert tungen, det primære stedet for infeksjon. Etter infeksjon, ble andre betennelsesceller også rekruttert til tungen for å fjerne infeksjonen. Men uten T reg mediert immunmodulering, Th17 celler seg ikke løste infeksjon, men forårsaket økt immunpatologi. Co-overføring av T kjørte helt løst betennelsen. Interessant, mus med forsterket betennelse i fravær av T kjørte, også viste økt soppbelastning. Vår forrige rapport viste at dette var på grunn av redusert IL-17A produksjon i mus, sammenlignet med dem med T regs. Vår nåværende eksperimenter støtter ideen om at det kan også være på grunn av økt TNF-α som forverret betennelse, muligens ved å øke epitelcelle apoptose og økt sopp byrde 28. Tatt i betraktning den immunbeskyttende effekt av IL-17A på mukosaTror vi at inflammatorisk patologi som vi observerer med økende sopp byrde er ikke på grunn av IL-17A produsert av Th17 celler eller mangel på verts motstand. Det er forårsaket på grunn av TNF-α og muligens andre proinflammatoriske cytokiner produsert av injisert Th17 celler. Dette kan bekreftes av den observasjon at sk - / - mus blottet for Th17-celler viser bare minimal inflammasjon og påfølgende oppløsning av infeksjon og bare de som mottok Th17-celler bukket til alvorlig vekttap (figur 1). Konsekvent til dette, har det vært også tidligere vist at sk - / - mus fjerne primær OPC infeksjon uten mye 27 immunpatologi. Under disse forholdene, har kompensatoriske mekanismer avhengig IL-17A produsere medfødte immunceller vist seg å fjerne infeksjonen i Rag - / - mus 17,29,30. Tatt sammen, selv om IL-17A produsert av Th17 celler og nøytrofile rekruttering spiller en beskyttende rolle i innledende faser av infeksjon, excessiv produksjon av TNF-α og andre cytokiner ved Th17-celler, og den fortsatte tilstedeværelsen av nøytrofiler årsaker forsterket immunpatologi. Rollene til pro-inflammatoriske cytokiner i tillegg til TNF-α produsert av Th17-celler gjenstår å bli undersøkt i sammenheng med immunpatologi.
Den store begrensning av modellen er spørsmålet om det er fysiologisk relevant for menneskelig OPC. Selv Th17 celler er vist å være patologiske meklere i flere orale sykdommer, enten kronisk aktivering av Th17 celler er sykdomsfremkallende i OPC gjenstår å bli undersøkt. Med nyere funn som innebærer rollen C. albicans i betennelse og kreft, er Th17 immunpatologi i munnhulen et aktivt felt av undersøkelsen 31. Dermed den modellen som er beskrevet her kan brukes til mer nøye studere spesifikke roller Th17 celler og hvordan de samhandler med medfødte immunceller, noe som gir detaljert innsikt i til muntlig immunologiske sykdommer og kreft i munnhulen.
Det kritiske trinnet i den teknikk som er passende rekruttering og utvidelse av adoptivt overført Th17-celler. Dette er svært avhengig av levedyktighet og IL-17A fremstilling av in vitro-polariserte Th17-celler før overføringen. Det beste er å teste deres levedyktighet og cytokinproduksjon ved flowcytometri analyser 19. Forsvarlig gjennomføring av Th17 celle injeksjon og mus infeksjon vil føre til infeksjon avhengig Th17 immunpatologi. Denne modellen kan bli anvendt for å teste strategier for å hindre Th17 immunpatologi og oral inflammasjon i sammenheng med andre infeksjoner i tillegg. Også ved hjelp av denne modellen, kan man utføre sekundære re-infeksjoner og studere rollen til Th17-celler i å forverre immunpatologi i forbindelse med kroniske infeksjoner. Som denne modellen innebærer immunsvikt mus, kan det være svært relevant for oral dysbiosis sett i AIDS og PID-pasienter, som lider av tilbakevendende kronisk Candida infeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CAF-2 | University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) | - | Candida culture |
| U-bottom 96 well plates | Fisher | 055588 | Used for cell culture |
| a-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| m-IL-6 | Bio Basic | RC232 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| h-TGF-b | R&D | 240-B | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IFN-g | eBiosciences | 16-7311-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IL-4 | eBiosciences | 16-7041-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| α-IL17A ef660 | eBiosciences | 50-7177-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| α-TNFa-PE-Cy7 | eBiosciences | 25-7423-41 | Used for cell culture - 1:100 |
| α-RORgt PE | eBiosciences | 12-6981-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium | Bio Basic | S507.SIZE | Mediium for candida growth |
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4300 | Incubation growth for candida |
| 15 ml tubes | Bio Basic | BT888-SY | Used for cell culture and candida growth |
| 50 ml tubes | Bio Basic | CT 788-YS | Used for cell culture and candida growth |
| Table top Centrifuge | VWR International LLC | 82017-654 | For pelleting candida -900 g |
| Allegra Centrifuge | Beckman Coulter | 392302 | Cell culture - 480 g |
| 1.5 ml eppendorf tubes | Bio Basic | BT620-NS | Preparing final concentration of candida |
| 2x paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixing candida for count |
| Hemocytometer | VWR International LLC | 15170-172 | Counting cells |
| PBS - Phosphate Buffered Saline | Bio Basic | PD8117 | Preparation of buffers |
| Ketamine/xylazine | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | Obtained from ARC approved protocol for anesthesia |
| Ophthalmic lubricant ointment | Allergan | - | Eye ointment for animals to prevent dryness |
| Saline (0.9% NaCl) | G Biosciences | 786-561 | Administerd to animals to prevent dehydration |
| 3-mm-diameter cotton wool ball | VWR International LLC | BP7603 | 3 mm balls for candida infection |
| Heat gel pads | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | for maintaining the body temperaturre and fast recovery |
| Hematoxylin and Eosin staining | Histoserv - MD | - | Tissue histology |
| 10% formalin | Electron Microscopy Sciences | JC1111/MC | Tissue histology |
| 70% ethanol | VWR International LLC | 97064-490 | Sterilization purpose |
| PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | Restimulation of cells |
| Ionomycin | Life Technologies | 124222 1mg | Restimulation of cells |
| Fixation permeabilization kit | eBiosciences | E16913-106 | Fixing cells for Flow cytometry |
| Tuberculin syringes | BD Biosciences | 309659 | Mice injection |
| 25 G x 3/8 needles | BD Biosciences | 309626 | Mice injection |
| Rag1 -/- mice | Jackson laboratories | Stock no: 002216 | Recipient mice |
| CD45.1 congenic mice | Jackson laboratories | Stock no:002014 | Donor Th17 cells |
| CB17-SCID mice | Jackson laboratories | Stock no: 001303 | Recipient mice |
| Balb/c mice | Jackson laboratories | Stock no: 000651 | Donor Th17 cells |
References
- Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
- Loesche, W. J. Periodontal disease: link to cardiovascular disease. Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).
- Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. Association between periodontal disease and stroke. Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).
- Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy. Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217 (2012).
- Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In. Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).
- Canabarro, A., et al. Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis. Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).
- Urzua, B., et al. Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets. Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).
- Ergun, S., et al. Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome. Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).
- Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment. Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).
- Gall, F., et al. Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions. The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).
- Grady, J. F., Reade, P. C. Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia. Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).
- Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia. Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).
- Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense. Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).
- Marodi, L., Johnston, R. B. Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms. Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).
- Kumamoto, C. A. Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In. Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).
- Kraneveld, E. A., et al. The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults. PloS One. 7 (8), e42770 (2012).
- Hernandez-Santos, N., et al. Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).
- Hasina, R., et al. ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis. Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).
- Pandiyan, P., et al. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model. Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).
- Pandiyan, P., et al. The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes. J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).
- Pandiyan, P., Lenardo, M. J. The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival. Biology Direct. 3 (6), (2008).
- Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells. Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al. Animal models for candidiasis. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. 105, 11-19 (2014).
- Conti, H. R., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Kamai, Y., et al. New model of oropharyngeal candidiasis in mice. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).
- Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. Isolation of T cells from mouse oral tissues. Biological Procedures Online. 16 (1), 4 (2014).
- Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation. International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).
- Bishu, S., et al. The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).
- Quintin, J., et al. Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice. Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).
- Ramirez-Garcia, A., et al. Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression. Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).
