Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: эксперименты на мышах были проведены в соответствии с институциональной защиты животных комитета (IACUC) руководящих принципов.
1. О восстановлении Rag-1 - / - мышей с клетками I N Vitro Искусственный Th17 (три дня до заражения)
- Для установления клетки Th17, культуры CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- наивные Т-клетки (3 х 104) в U-образным дном 96-луночных планшетах в одиночку, или совместного культивирования их вместе с 3 х 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + регуляторных Т-клеток в присутствии растворимых α-CD3 (1 мкг / мл), α-CD28 (2 мкг / мл) антител и антиген-представляющих клеток в условиях, Th17 (поляризованный с помощью IL-6 (25 нг / мл), TGF-β (2 нг / мл) , α-ИФН-γ (2 мкг / мл) и α -IL-4 (2 мкг / мл)) в течение трех-четырех дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наивные клетки и Т-регистры были отсортированы с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS)d процедур выделения магнитного клеток и культивировали, как описано ранее 19-22. - На 4-й день, после ресуспендирования клеток Th17 с помощью пипетки, собирать их из культур и центрифугировать их в стерильных условиях.
- Возьмите небольшую аликвоту этих клеток для изучения их жизнеспособности и для фенотипирования. Ресуспендируют их в 500 мкл RPMI среде, добавить пропидийиодидом (200 нг / мл) и сразу оценить их жизнеспособность с помощью проточной цитометрии. Выполните фенотипирование цитометрическим оценки IL-17A производства после повторной стимуляции (см раздел 6.3).
- Центрифуга и мыть основную массу клеток в стерильной PBS при 480 х г в течение 6 мин при 4 ° C на всех стадиях, если не указано иное.
- Используйте эти клетки для приемных передачи в 6-8-недельных CD45.2 RAG1 - / - иммунодефицитные мыши.
- Ресуспендируют клеток при плотности 1 х 10 7 клеток / мл клеточной использованием холодного стерильного PBS.
- Вводите 100 мкл клеток от intraperitoneal инъекции, используя 25 г иглы на 1 мл туберкулина шприцев, так что одна мышь получает 1 х 10 6 клеток. Некоторые мыши получают PBS или клетки Th17 только, и другие мышей получают Th17 клетки, которые были совместно культивировали с Treg клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги в асептических условиях.
2. Рост C. Albicans инфекции (один день до инфицирования)
- Перед посевом разогнать пять колоний из CAF2-1 С Albicans лабораторного штамма в 100 мкл стерильной PBS суспензии и добавить суспензию стерильной бульоне.
- Привить 5 колоний из С Albicans в 50 мл базе дрожжей азота (YNB без аминокислот) / пептон / декстроза бульона средних и инкубировать в шейкере инкубаторе при 30 ° С в течение 15-18 ч при 130 оборотах в минуту.
- Монитор бульон облачности, так как это является показанием для роста грибка.
3. CandidaЗаготовка и процедуры подсчета (в день инфекции)
- Соберите 10 мл Candida бульона в 15 мл пробирки. Для больших объемов, собирать Candida в 50 мл пробирки.
- Центрифуга бластоспоры в 1900 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре на всех стадиях, если не указано иное. Гранул бластоспоры центрифугированием, с последующим удалением надосадочной жидкости.
- Если есть больше, чем одна трубка, объединить бластоспоры Candida из нескольких трубок, добавлением стерильной PBS на гранулы и ресуспендируйте их в 10 мл PBS для подсчета.
- Взять 20 мкл бластоспоры в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках, добавить 20 мкл 2X параформальдегида и инкубировать при комнатной температуре в течение 15-20 мин. Количество фиксированных бластоспоры помощью гемоцитометра под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параформальдегид является канцерогенным. Откройте в неразбавленном решение только в вытяжном шкафу. - В то же время, повторить мытье бластоспоры по меньшей мере, в два раза, т центрифугированиемподол в PBS, и гранулирования в бластоспоры. Держите гранул в 15 мл пробирки при комнатной температуре, в капюшоне ABSL1, готовы к инфицированию.
- Оставьте немного стерильной PBS при комнатной температуре ресуспендированием бластоспоры для инфекции.
- После подсчета, добавить стерильный PBS к осадку blastospore отрегулировать число дрожжевых клеток с blastospore 2 x10 8 дрожжевых клеток / мл. Это blastospore подвеска, которая будет использоваться, чтобы заразить мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги в асептических условиях.
4. Мыши инфекции (через 3-5 дней после клеточной передаче)
ПРИМЕЧАНИЕ: Основная процедура инфекция проводили, как описано ранее 19,23-25.
- Взвесьте Rag-1 - / - мышей, получавших PBS или клетки на три дня раньше.
- Рассчитать дозу анестетиков, используя их вес тела. Обезболить мышей при введении кетамина / ксилазина смеси (16,1 мг / мл и 1,6 мг / мл), с использованием 25 г игл на 1 мл туберкулина шприцев, с помощью INTRaperitoneal инъекции.
- Администрирование 50 мкл на 10 г веса тела. (То есть, 0,8 мг кетамина и 0,08 мг / ксилазина 10 г массы тела или 80 мг кетамина и 8 мг ксилазина на кг веса тела, соответственно). Соблюдайте для ответа ног щепотку каждые 15 мин после анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта доза вызовет 60-90 мин анестезии, которая достаточно для процедуры заражения. - Применить глазной смазки мазь в глаза мышей, чтобы предотвратить роговицы от высыхания. Как глаз смазка может высыхать, повторите офтальмологических смазки следует каждые 45 мин.
- Администрирование 50 мкл на 10 г веса тела. (То есть, 0,8 мг кетамина и 0,08 мг / ксилазина 10 г массы тела или 80 мг кетамина и 8 мг ксилазина на кг веса тела, соответственно). Соблюдайте для ответа ног щепотку каждые 15 мин после анестезии.
- Вводят 1 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) подкожно на спине рядом с передней лапы, чтобы помочь регидратацию мышей при анестезии.
- Получить новую, чистую клетку. Следуйте инфекции процедура одну мышь в то время, помещая каждую мышь в новую клетку После заражения. Выполните PBS / фальшивую инфекции, а затем приступить к инфекции ОПО Candidaups.
- Возьмите наркозом мышь и открыть рот широкий, чтобы показать основание языка.
- Поместите 3 мм в диаметре ватный тампон, насыщенный 50 мкл PBS или blastospore суспензии, сублингвально в полости рта в течение 90 мин. Флип мышей через 15 мин спереди и сзади для предотвращения легких заторов, убедившись, что ватные шарики не двигаются.
- Установить таймер для каждого мышь, чтобы обеспечить 90 мин Sham или Candida инокуляции в полости рта.
- Храните их в клетке под лампой тепло (4 футов), и каждой мыши на тепло гелевыми вкладышами.
- Убедитесь, что язык изымается внутри и от зубов, чтобы избежать зубы разрывая язык.
- В конце 90 мин, снять ватным тампоном из уст мыши. Следите за любой мыши, которые могут оправиться от наркоза быстрее, чем 75 минут. В таком случае, анестезию их снова кетамином (40 мг / кг) только.
5. Сообщение Procedurе Мониторинг (во время 90 мин анестезии)
- Используйте тепло гелевыми вкладышами и в течение 90 мин анестезии.
- Для поддержания температуры тела и предотвращения удушья, не позволяют мышей, чтобы восстановить на регулярной кукурузы початка мыши постельные принадлежности.
- После выхода из наркоза, вводить дополнительные 1 мл стерильного 0,9% NaCl подкожно в двух местах на задней.
- Держите до пяти PBS (мнимого), привитых мышей в клетке. Дом только 1-2 мышей, инфицированных в клетке.
- Заполните процедуру карты с инициалами каждый день после процедуры, чтобы записать изменения в массе тела, уход привычки и общее состояние здоровья.
6. Оценка воспаления
6.1) Потеря веса
- Взвесьте мышей каждый день в течение инфекции, начиная со дня до процедуры заражения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, иммунодефицитные мыши, которым вводили клетки Th17 и без каких-либо Т-регуляторными поддаваться 20-30% Потеря веса за счет роста грибковой нагрузки 19 и усугубляется воспаление.
6.2) Гистология забил языка
- Жертвоприношение мышей СО 2 удушья с последующим смещением шейных позвонков.
- Откройте челюсти и рассекать из языка с ножницами и щипцами. Используйте тупые щипцы провести языком, и с помощью ножниц дотянуться до задней части рта, чтобы надрезать заднюю часть языка.
- Для иммуногистохимического гематоксилином и эозином (Н & Е) окрашивания языка тканей, промыть язык тканей ледяным PBS. Добавить 5 мл 10% -ного формалина на 2-3 языках, и исправить их O / N в 15 мл пробирки.
- На следующий день, удалить формалина и погрузиться ткани в 5 мл 70% этанола, чтобы предотвратить гипер-фиксацию. Отправить их на коммерческой службы, чтобы продолжить парафин, срезы и окрашивание парафиновых срезов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческая гистология служба используется для выполнения этих шагов. - После того, как слайды назад от коммерческой эксплуатации гистологии, сорт воспаление при соблюдении срезах тканей под световым микроскопом.
- Результат от 0 до 5, где 0 не быть никакого воспаления, а 5 является наиболее сильное воспаление. Оценка воспаления с помощью таблицы 1.
6.3) производство цитокинов Th17 клеток
Примечание: Чрезмерное производство TNF-α является одним из показаний для чрезмерного иммунопатологии. При мышей адаптивно переносили с Th17 клеток только, это вызывает иммунопатологии, связанный с избыточной продукцией ФНО-α в Th17-клеток.
- Сбор клеточной суспензии из селезенки, лимфатических узлов, подмышечных лимфатических узлов и языка, с помощью ранее описанных методов 19,26.
- Рестимулировать клетки с форболмиристатацетата (РМА) (50 нг / мл) и иономицином (500 нг / мл) в течение 4 ч с брефелдин А (10 мкг / мл) в лАСТ 2 ч. Вымойте клеток с PBS и исправить их с помощью коммерческого набора Фиксация / пермеабилизирующего в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выполните внутрирегиональной окрашивание сотовой цитокинов с помощью Флуорохром сопряженных анти-ФНО-α, анти-IL-17A и ROR-сетей Y't антител, как описано выше 19.
- Вкратце, клетки вновь суспендируют в пермеабилизации буфера 1X с коктейлем из анти-ФНО-α, анти-IL-17A и ROR-сетей Y't антител, каждого антитела на 2 - 3 мкг / мл, конечная концентрация.
- Инкубируйте клетки в течение 1 ч при комнатной температуре.
- После инкубации, мыть клетки с 1X пермеабилизации буфера.
- Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл PBS с 0,5% бычьего сывороточного альбумина для проточной цитометрии.
- На следующий день, удалить формалина и погрузиться ткани в 5 мл 70% этанола, чтобы предотвратить гипер-фиксацию. Отправить их на коммерческой службы, чтобы продолжить парафин, срезы и окрашивание парафиновых срезов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой модели, оба -infected мышей Candida и неинфицированных мышей в RAG-1 - / - иммунодефицитные фон были адаптивно переданы с Th17 клеток 3-5 дней до заражения. В общей сложности 10-12 мышей были использованы в экспериментах с 2 мышей в каждой Sham инфицированных групп и 4-5 в каждой из групп зараженных Candida. Наивные клетки были получены из конгенных Thy1.1 или CD45.1 мышей, поэтому введенные клетки Th17 были записаны в естественных условиях с использованием Thy1.1 или CD45.1 окрашивание соответственно (рис 1а). Co-T переданы регистры были получены от мышей CD45.2 чтобы отличить их от CD45.1 Th17-клеток. Для некоторых экспериментов, CB-17 Thy1.2 SCID мышей получателя, были использованы клетки Th17-доноры, полученные от Thy1.1 Balb / C мышей и Т-регистры, полученных из конгенных Thy1.2 мышей. Только Candida -infected мышей, но не неинфицированных мышей выставлены вербовки и расширение восстановленного CD45.1 + (фиг.1А). Результаты представляют данные от одной мыши в каждой группе.
Только у мышей, которые совместно переданной с Т-регистры, отрицательная CD4 + клетки Foxp3 + CD45.1 были обнаружены в CLN. Это показывает, что вводили Т-регистры были набраны на месте инфекции (Фиг.1В). Результаты представляют данные от одной мыши в каждой группе. В то время как инфицированного ветоши-1 - / - похудеть и извлекают после 4 дней инфекции, кортизон иммунитетом мышей не восстановить, но дополнительно похудел, как было показано ранее 27. Оба группы мышей, которые получили клетки Th17 в присутствии или в отсутствие Т-регистры похудел на начальном этапе. Тем не менее, у мышей, получавших Т регистры оправился от потери веса и решил инфекции. 2 мльда были использованы в Sham инфицированных группы, и 4 в каждой зараженной группы Candida. Были 3 мышей в кортизон группы. Мыши, которые получили клетки Th17 только похудела постепенно (рис 2) 19. Некоторые из мышей в этой группе были быть умерщвлены. Эти результаты показывают, что среднее значение весов всех мышей в этой группе. Хотя нейтрофилы, необходимые для начального зазора инфекции, их постоянное присутствие и набор в ткани знак неразрешенной воспаления. Поэтому инфильтрацией нейтрофилов исследовали в инфицированной языка, определяя выражение нейтрофилов маркер, GR-1, на более поздних временных точках, таких как день-7 после заражения. Мыши, которые получили клетки Th17 только, имели более высокие воспалительные инфильтраты (фиг.3А), в том числе Gr-1 + нейтрофилов даже день-4 после инфекции, по сравнению с мышами, которым вводили Т-регистры (фиг.3В). Эти результаты показали, что в presencе Т регистры, мыши более эффективно решены воспаление и извлекают из инфекции.
На 7-й день после заражения, селезенки (SPLN), CLN и язык тканей были изолированы, и суспензии отдельных клеток были сделаны для проточной цитометрии анализа. CLN показали увеличение CD45.1 клетки Th17 (рисунок 1) и повышенной продукции ФНО-α (4А, 4В) у мышей, получавших только клетки Th17. С другой стороны, Т рег получатели показали снижение частоты Th17 клеток и снижение производства TNF-α с помощью Th17-клеток (фиг.1 и 4а, 4b). В этих экспериментах, данные CLN одного мыши, и язык тканей собирают и объедин ют с 2 мышей показаны. Хотя на ранних временных точках IL-17A производства был выше в Т рег получателей 19, на более поздних временных точках в обеих группах, IL-17A производства по Th17-клеток минимальна (данные не показаны). Периодическая окрашивание Acid Шиффаязыка показали увеличение гифы гриба у мышей, получавших только клетки Th17, в то время как у мышей, получавших Т регистры, а также очистили грибок на день-5 и изо дня 7 после заражения (рис 5). Кроме того, гистология озвучивание языка воспаления также показали пониженные показатели воспаления у мышей, которые получали Т-регистры, по сравнению с мышами, которые получали только клетки Th17 (рисунок 6). Подсчет воспаление было основано на языке гистопатологических параметров, таких как, наличием сосочков, неиспользованный поверхностной эпителиального пласта, видимого дрожжей или гиф, гиф вторжения, указывающий нон-разрешающую инфекции, утолщение базального слоя (свидетельствует о текущей восстановления тканей), и наличие инфильтрации иммунных клеток (нейтрофилы и клетки Th17). Эти результаты показали, что инъекция Th17 клеток напрямую не снижают инфекции, но увеличили грибковые бремя и иммунопатологии, вызванной первичными С Albicans Infecния, в то время как со-передача Т регистры уменьшаются иммунопатологии.
Рисунок 1. Введенный Th17-клетки и Т рег клетки набирать и расширяться в дренажных лимфатических узлов (CLN) в C Albicans инфицированных мышей () Rag-1 -.. / - CD45.2 мышей восстанавливали Th17 клеток или Th17 + Т рег клетки, которые были поляризованы в условиях Th17 в течение 5 дней. Th17 клетки были получены из CD45.1 конгенных мышах и Т рег клеток, полученных от мышей, CD45.2. Некоторые мыши не получали никаких клеток (фиктивном или Candida + PBS). Мыши-реципиенты в каждой группе были инфицированы управления фиктивных или С Albicans. На 5-й день после заражения, CLN были ISOLATизд сделать однородной клеточной суспензии и отслеживать вводят CD45.1 экспрессирующей клетки Th17 с помощью проточной цитометрии (закрытого со всех лейкоцитов в ФСБ, SSC разброса) (В) ветоши-1 -. / - мышей CD45.2 восстанавливали Th17 клеток или Th17 + T рег клетки, как и в «А» и инфицированных C. Albicans. CLN были изолированы, чтобы сделать одну клеточной суспензии и измерить CD45.1 и внутриклеточной FOXP3 выражение с помощью проточной цитометрии (коттеджный на все клетки CD4). Т рег ворота на участках показать CD45.1 негатив, FOXP3 + CD4 + клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Введенный клетки Th17 привести к потере веса в C . Альбиканс инфицированных мышей и совместное управление Т-регуляторными улучшает восстановление от потери веса. SCID CB-17 мышей восстанавливали Th17 клеток или Th17 + Т рег клеток как показано на рисунке 1А. 3 дня спустя, мышей-реципиенты были заражены с C. Albicans. Некоторые мыши в каждой группе были инфицированы управления имитацией. Ослабленным мыши получали кортизон ацетат (Cort) инъекции. Процентное изменение веса у мышей восстанавливали указанных клеток и инфицированных C. Albicans, по отношению к D-1 (за день до инфекции) показано. Данные нормированы по отношению к данным весом от неинфицированных (Sham + PBS) мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
"SRC =" / файлы / ftp_upload / 52538 / 52538fig3highres.jpg "/>
Рисунок 3. Введенный Th17 клетки вызывают язык иммунопатологии в C. Albicans инфицированных мышей и совместное управление Т регистры снижает иммунопатологии. Гистологическая оценка языками в С Albicans инфицированных мышей. Мышей восстановленный с указанными клетками и инфицированных, как на фиг.1А. На 5-й день после заражения, языки были выделены из мышей. (А) сагиттальных срезах этих языках окрашивали H & E для оценки воспаления и инфильтрации (IF) из иммунных клеток. (Па) и (Ер) означает сосочков и эпителиальный слой от языка соответственно. Микроскопические изображения слайдов, at50X увеличения. (B) Гистологическое иммуноокрашивание для Gr-1 нейтрофилов маркер с помощью анти Gr-1 антитела (CLONe: 1A8-Ly6g) в языке разделах, посвященных 5-й день после заражения (коричневый, обозначается IF). Микроскопические изображения слайдов, на 100-кратном увеличении показаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Совместное введение Т-регуляторными снижает ФНО α в вводили клетки Th17. () Rag-1 - / - CD45.2 мышей восстанавливали Th17 клеток или Th17 + Т рег клеток и инфицированных C. Albicans, как на фиг.1А. На 5-й день после заражения, CLN и язык ткани были изолированы, чтобы суспензии отдельных клеток. Эти клетки повторно стимулировали ФМА и иономицином до внутриклеточного stainiнг и проточной цитометрии анализа. Проточной цитометрии контурные графики внутриклеточного ROR-сетей Y't и TNF-α экспрессии клеток Th17 показаны (закрытого на CD4 + клеток). (B) статистического представления процент TNFαpositive клеток из экспериментов, выполненных, как и в "A". Данные представляют собой 4 мышей в неинфицированных группы, и 6 мышей в каждой зараженной группы и объединяют с двух независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Повышение иммунопатологии также связано с повышенным грибковой нагрузки в C. Albicans инфицированных мышей. CB-17 SCID микрофоне восстанавливали линии BALB / C Th17 клеток, или Th17 + T рег клетки, как и в Figure1A, и были заражены с C. Albicans. Гистологическое исследование языка из инфицированных мышей показано. На 7-й день после заражения, языки были собраны и окрашивали периодной кислотой Шиффа (PAS) для оценки грибковых поражений, воспаление и инфильтрация (если) клеток, и, чтобы обнаружить грибок (Калифорния). Слайды были просмотрены at100X увеличения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. Т регистры улучшить иммунопатологии в C. Albicans инфицированных мышей. SCID мышей восстанавливали линии BALB / C Th17 клеток, или Th17 + T рег клетки как показано на рисунке 1А, и были заражены с C. Albicans. Статистические представление средних гистологических показателей язычков от зараженных мышей, которые расцениваются как на рисунке 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Гол | Характеристика |
| 0 | 0 - нет видимых дрожжей или гифы, нетронутыми поверхностным эпителием на дорсальной поверхности языка, сосочки явно присутствует и не поврежден (может или не может быть проникновение мононуклеарных клеток в ткани), не утолщение базальной слое, не проникают иммунные клетки. |
| 1 | не 1 - не видно дрожжей или гифые, оборванный или слегка поврежден поверхностный эпителий, сосочки явно присутствует с минимальным ущербом и редких проникающих иммунных клеток. |
| 2 | 2 - сосочки снижается, но присутствует с повреждением, утолщение базального слоя и частых проникающих иммунных клеток. |
| 3 | 3 - случайные скопления видимой дрожжей и вторжения гиф, что свидетельствует о поврежденных сосочков, случайных повреждений поврежденной эпителия, утолщение базального слоя и и малых кластеров проникновения иммунные клетки. |
| 4 | 4 - частые скопления видимой дрожжей и вторжения гиф, что свидетельствует о поврежденных сосочков, частые поражения поврежденного эпителия, минимальной инфильтрации иммунных клеток, утолщение базального слоя и частых кластеров проникновения иммунные клетки. |
| 5 | 5 - многочисленные свидетельства вторжения гифы, экстенсивно поврежден эпителий через спинной поверхности, большой инфильтрациииммунные клетки, несколько или нет заметного сосочки, утолщение базального слоя и очень частые и большие скопления проникают иммунные клетки. |
Таблица 1: гистологические Подсчет значения
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта модель основана на индукции устные С Albicans инфекции зависит Th17 воспаление. Из-за отсутствия Т-регистры, Th17 клеток индуцируется воспаление безудержный и приводит к плохо разрешенных иммунопатологии. В пробирке происходит наивных CD4 клеток поляризованным клетки Th17 были использованы для приемных передачи. 40 - 50% от культивируемых клеток CD4 + показать детектируемого выражение IL-17A вокруг 3-й день (клетки Th17), и, следовательно, были использованы для инъекции в мышей. Основным преимуществом модели является то, что клетки Th17 вызвать инфекцию конкретный иммунопатологии, которые могут быть эффективно облегчаются с впрыском T рег. Таким образом, эта модель может быть использована для проверки иммуномодуляции стратегии с впрыском Т рег в качестве положительного контроля. Воспаление легко оценить на основе потери веса, гистопатологической скоринга и продукции провоспалительных цитокинов в Th17 клеток, инфицированных мышей.
После тОн приемным передача Th17 клеток, они мигрировали в вторичных лимфоидных органах и различных тканях, включая язык, на основной сайт инфекции. После заражения, другие воспалительные клетки были также работу с языком, чтобы очистить инфекции. Тем не менее, без T рег опосредованной иммуномодуляцию, клетки Th17 сами не решить инфекцию, но вызвала повышенный иммунопатологии. Co-передача Т уставы полностью решена воспаление. Интересно, что мыши с усиленным воспаления в отсутствие Т-регистры, также показали увеличение грибковой нагрузки. Наш предыдущий отчет показал, что это было связано с сокращением производства IL-17A у мышей, по сравнению с теми, с Т уставы. Наши текущие эксперименты подтверждают идею, что это также может быть связано с увеличением TNF-α, что ухудшило воспаление, возможно, за счет увеличения эпителиальных апоптоза клеток и увеличение грибковых бремя 28. Учитывая иммунозащитными эффекты IL-17A на слизистой оболочкеМы считаем, что воспалительной патологии, что мы наблюдаем с увеличением грибковой нагрузки не из-за IL-17A производства по Th17 клеток или отсутствия сопротивления хоста. Это вызвано из-ФНО-α и, возможно, других провоспалительных цитокинов, произведенных вводили клетки Th17. Это может быть подтверждено наблюдением, что Rag - / - мышей лишены Th17 клетки показывают только минимальное воспаление и последующее разрешение инфекции и только те, которые получили клетки Th17 поддался к серьезной потере веса (рис 1). В соответствии с этими данными, было также показано, что ранее Rag - / - мышей очистки первичной инфекции без большого OPC иммунопатологии 27. В этих условиях, компенсаторные механизмы зависит от IL-17A производства врожденные иммунные клетки, как было показано, чтобы очистить инфекции у Rag - / - мышей 17,29,30. Взятые вместе, хотя IL-17A производства Th17-клеток и набора нейтрофилов играют защитную роль на начальных этапах инфекции, отлщий производство TNF-α и других цитокинов Th17 клеток, и дальнейшего присутствия нейтрофилов причин усугубляется иммунопатологии. Роль провоспалительных цитокинов, кроме TNF-α, полученного путем Th17 клеток остаются быть исследованы в контексте иммунопатологии.
Основным недостатком этой модели является вопрос, нельзя ли физиологически отношение к человеческой OPC. Хотя Th17 клетки показано, что патологические посредники в нескольких заболеваний полости рта, будь то хронический активации Th17 клеток патогенными OPC остается быть расследованы. С учетом последних выводов, подразумевающие роль С. Albicans в воспалении и раке, Th17 иммунопатологии в полости рта является активным область исследований 31. Таким образом, модель, описанная здесь может быть использован для более тщательно изучать конкретные роли Th17 клеток, и как они взаимодействуют с врожденными иммунными клетками, давая подробное представление с устным иммунологических заболеваний и рака полости рта.
Важным шагом в технике является целесообразным привлечение и расширение адаптивно перенесенных клеток Th17. Это сильно зависит от жизнеспособности и IL-17A производства в пробирке поляризованных Th17 клеток до перевода. Лучше всего, чтобы проверить их жизнеспособность и продукции цитокинов методом проточной цитометрии анализирует 19. Правильное выполнение инъекции и мышей клетки инфекции Th17 приведет к инфекции зависимого Th17 иммунопатологии. Эта модель может быть применена для тестирования стратегий по срыву Th17 иммунопатологии и воспаление полости рта в контексте других инфекций, а также. Кроме того, с помощью этой модели, можно выполнять вторичные повторные инфекции и изучения роли Th17 клеток в обострении иммунопатологии в контексте хронических инфекций. Как эта модель включает в себя иммунодефицитных мышей, это может иметь очень большое значение для орального дисбактериоза наблюдается у больных СПИДом и PID, которые страдают от хронических рецидивирующих инфекций Candida.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CAF-2 | University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) | - | Candida culture |
| U-bottom 96 well plates | Fisher | 055588 | Used for cell culture |
| a-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| m-IL-6 | Bio Basic | RC232 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| h-TGF-b | R&D | 240-B | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IFN-g | eBiosciences | 16-7311-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IL-4 | eBiosciences | 16-7041-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| α-IL17A ef660 | eBiosciences | 50-7177-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| α-TNFa-PE-Cy7 | eBiosciences | 25-7423-41 | Used for cell culture - 1:100 |
| α-RORgt PE | eBiosciences | 12-6981-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium | Bio Basic | S507.SIZE | Mediium for candida growth |
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4300 | Incubation growth for candida |
| 15 ml tubes | Bio Basic | BT888-SY | Used for cell culture and candida growth |
| 50 ml tubes | Bio Basic | CT 788-YS | Used for cell culture and candida growth |
| Table top Centrifuge | VWR International LLC | 82017-654 | For pelleting candida -900 g |
| Allegra Centrifuge | Beckman Coulter | 392302 | Cell culture - 480 g |
| 1.5 ml eppendorf tubes | Bio Basic | BT620-NS | Preparing final concentration of candida |
| 2x paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixing candida for count |
| Hemocytometer | VWR International LLC | 15170-172 | Counting cells |
| PBS - Phosphate Buffered Saline | Bio Basic | PD8117 | Preparation of buffers |
| Ketamine/xylazine | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | Obtained from ARC approved protocol for anesthesia |
| Ophthalmic lubricant ointment | Allergan | - | Eye ointment for animals to prevent dryness |
| Saline (0.9% NaCl) | G Biosciences | 786-561 | Administerd to animals to prevent dehydration |
| 3-mm-diameter cotton wool ball | VWR International LLC | BP7603 | 3 mm balls for candida infection |
| Heat gel pads | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | for maintaining the body temperaturre and fast recovery |
| Hematoxylin and Eosin staining | Histoserv - MD | - | Tissue histology |
| 10% formalin | Electron Microscopy Sciences | JC1111/MC | Tissue histology |
| 70% ethanol | VWR International LLC | 97064-490 | Sterilization purpose |
| PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | Restimulation of cells |
| Ionomycin | Life Technologies | 124222 1mg | Restimulation of cells |
| Fixation permeabilization kit | eBiosciences | E16913-106 | Fixing cells for Flow cytometry |
| Tuberculin syringes | BD Biosciences | 309659 | Mice injection |
| 25 G x 3/8 needles | BD Biosciences | 309626 | Mice injection |
| Rag1 -/- mice | Jackson laboratories | Stock no: 002216 | Recipient mice |
| CD45.1 congenic mice | Jackson laboratories | Stock no:002014 | Donor Th17 cells |
| CB17-SCID mice | Jackson laboratories | Stock no: 001303 | Recipient mice |
| Balb/c mice | Jackson laboratories | Stock no: 000651 | Donor Th17 cells |
References
- Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
- Loesche, W. J. Periodontal disease: link to cardiovascular disease. Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).
- Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. Association between periodontal disease and stroke. Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).
- Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy. Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217 (2012).
- Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In. Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).
- Canabarro, A., et al. Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis. Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).
- Urzua, B., et al. Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets. Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).
- Ergun, S., et al. Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome. Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).
- Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment. Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).
- Gall, F., et al. Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions. The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).
- Grady, J. F., Reade, P. C. Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia. Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).
- Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia. Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).
- Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense. Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).
- Marodi, L., Johnston, R. B. Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms. Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).
- Kumamoto, C. A. Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In. Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).
- Kraneveld, E. A., et al. The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults. PloS One. 7 (8), e42770 (2012).
- Hernandez-Santos, N., et al. Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).
- Hasina, R., et al. ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis. Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).
- Pandiyan, P., et al. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model. Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).
- Pandiyan, P., et al. The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes. J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).
- Pandiyan, P., Lenardo, M. J. The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival. Biology Direct. 3 (6), (2008).
- Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells. Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al. Animal models for candidiasis. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. 105, 11-19 (2014).
- Conti, H. R., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Kamai, Y., et al. New model of oropharyngeal candidiasis in mice. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).
- Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. Isolation of T cells from mouse oral tissues. Biological Procedures Online. 16 (1), 4 (2014).
- Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation. International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).
- Bishu, S., et al. The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).
- Quintin, J., et al. Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice. Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).
- Ramirez-Garcia, A., et al. Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression. Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).
