Neural aktivitet Formering i utfoldet hippocampus Forberedelse med en Penetrating Micro-elektrode Array

Summary

Vi har utviklet en in vitro utfoldet hippocampus som bevarer CA1-CA3 utvalg av nerveceller. Kombinert med den inntrengende mikroelektrodesystem, kan nevral aktivitet overvåkes i både den langsgående og tverrgående retninger. Denne metoden gir fordeler i forhold til hippokampalt snitt preparater som forplantning i hele hippocampus kan registreres samtidig.

Abstract

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt in vitro flat hippocampus preparat i kombinasjon med en mikromaskinerte matrise til kart nevral aktivitet i hippocampus. Den tverrgående hippokampalt snitt preparat er den vanligste vevspreparat å studere hippocampus elektrofysiologi. En longitudinell hippocampus skive ble også utviklet for å undersøke langsgående forbindelser i hippocampus. De intakte mus hippocampus kan også bli opprettholdt in vitro, fordi dens tykkelse tillater tilstrekkelig oksygendiffusjon. Men disse tre preparatene ikke gir direkte tilgang til nevrale forplantning siden noen av vevet mangler eller brettet. Utbrettet intakt hippocampus gir både tverrgående og langsgående forbindelser i en flat konfigurasjon for direkte tilgang til vevet for å analysere det fulle omfanget av signalforplantning i hippocampus in vitro. For å effektivt overvåke nevrale aktiviteten fra tHan cellelag, et spesiallaget gjennomtrengende mikroelektrodesystem (PMEA) ble fremstilt og anvendt til utfoldet hippocampus. Den PMEA med 64 elektroder av 200 mikrometer i høyden kan spille inn nevrale aktiviteten dypt inne muse hippocampus. Den unike kombinasjonen av en utbrettet hippocampus preparat og PMEA gir et nytt in vitro redskap for å studere den hastighet og retning av forplantningen av nevral aktivitet i de todimensjonale CA1-CA3 regioner av hippocampus med et høyt signal-til-støy-forholdet.

Introduction

Forståelse av nevrale ledning eller forplantning av nervesignaler er avgjørende for bestemmelse av mekanismen for nevral kommunikasjon både i normal funksjon og patologiske tilstander i hjernen ^1-3. Hippocampus er en av de mest omfattende studert strukturer i hjernen, siden den er med fundamental rolle i flere hjernefunksjoner som hukommelse, og romlig sporing og er involvert i flere patologiske forandringer som dramatisk påvirke oppførselen samt ^1,6. Selv, viser hippocampus en kompleks organisasjon, kan de ulike elementene i sin struktur lett identifiseres og åpnes i stykket forberedelse ^4-6. I tverretningen av hippocampus, er nevral aktivitet er kjent for å forplante seg gjennom tri-synaptiske bane som omfatter gyrus dentatus (DG), CA3, CA1 andsubiculum ^4,5. Det antas at synaptisk overføring og aksonal conduction spille en viktig rolle for kommuniki denne tver kretsen ^4,6. Men tar forplantning av nevrale signal sted i både tverrgående og langsgående retninger ^4,6. Dette innebærer at hippocampus ikke fullt ut kan undersøkes ved hjelp av slice forberedelser som begrenser observasjon til en bestemt retning av forplantning ^4. Den langsgående skive ble utviklet for å undersøke de aksonale trasé langs den langsgående aksen ^5. Forskere har observert atferdsspesifikke gamma og theta svingninger hovedsakelig langs tverrgående og langsgående akser henholdsvis ^6. Disse atferd har blitt studert separat, men samtidig tilgang til begge retninger er avgjørende for å forstå disse problemene. Selv med utviklingen av den intakte hippocampus fremstillingen, er det vanskelig å overvåke forplantningen gjennom hele vev på grunn av den foldede struktur av hippocampus ^4. Utbrettet hippocampus gir tilgang til de pakket nevroneri form av en flat to-dimensjonal cellelaget ^7,8.

Ved utfolding dentate gyrus (DG) (figur 1), inntar hippocampus en flattrykt form med en rektangulær konfigurasjon hvor både tverrgående og langsgående forbindelser forblir intakt med pyramidal cellelaget anordnet i et todimensjonalt ark inneholdende både CA3 og CA1, forlater et flatt stykke av nervevev som kan brukes til å undersøke nevrale formering (figur 2) ^8. Nerveaktivitet kan overvåkes deretter med individuelle glass pipetter, microelectrode matriser, stimulerende elektroder, samt spenningsfølsomme fargestoffer (VSD) ^3,7,8. I tillegg kan genetisk kodede spenningsindikator fra transgene musene anvendes for å spore utbredelsesmønsteret ^9.

Den flate konfigurasjon av den utbrettede hippocampus nettverket er godt egnet for optisk metode opptak, men også for en microelectrode array. Most av de kommersielt tilgjengelige arrays er fabrikkert med flat eller lav profil elektroder og kan ta opp nevrale aktiviteten i både vev skiver og dyrkede nerveceller ^10-12. Imidlertid reduserer signal-til-støy-forhold (SNR) når signalene mottas fra et intakt vev, siden soma av neuronene er plassert dypere inn i vevet. Microelectrode elektrodegrupper med høyt sideforhold er nødvendig for å forbedre SNR.

For dette formål har et gjennomtrengende microelectrode array (PMEA) er utviklet i vårt laboratorium, og gir mulighet for direkte å sondere i vevet ved å sette inn 64 pigger med en diameter på 20 um og en høyde på 200 mikrometer inn i de utspredte hippocampus ^7,13 . Dette microelectrode matrise har høyere SNR i forhold til spenningen sensitive fargestoff bildebehandling og SNR forblir stabil under et eksperiment ^7,13. Kombinasjonen av den ikke-brettede hippocampus preparatet og PMEA gir en ny måte å investereIgate nevrale forplantning over en to-dimensjonal planet. Eksperimenter ved hjelp av denne teknikken har allerede gitt betydelige resultater om mekanismene for nevrale signal forplantning i hippocampus der nevrale aktiviteten kan forplante uavhengig av synaptiske eller elektriske synapser ^7.

Protocol

MERK: Animal eksperimentelle protokoller ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved universitetet. CD1 mus av begge kjønn i alderen P10 til P20 er brukt i denne studien.

1. Løsninger for kirurgi og eksperimentell Recording

1. Forbered normal kunstig cerebrospinalvæsken (aCSF) buffer som inneholder (mm): NaCl 124, KCl 3,75, KH ₂ PO4 1.25, _MgSO4 2, _NaHCO3 26, dekstrose 10, og CaCl _{2 2.} Bruk av dette normalt aCSF for vev restitusjon etter disseksjon, så vel som for vaskesystemet ved begynnelsen av forsøket.
2. Forbered sukrose aCSF som brukes under hippocampus disseksjon og inneholder (mM): Sukrose 220, KCl 2,95, NaH ₂ PO4 1,3, _MgSO4 2, _NaHCO3 26, Dextrose 10, og CaCl _{2 2.} For å indusere epileptiform aktivitet i intakt hippocampus vev forberedelse, legg 4-aminopyridin (4-AP) til normal aCSF påkonsentrasjon på 100 pM.

2. Kirurgisk prosedyre for Intakt Hippocampus Forberedelse

1. Avle isofluran (1 ml) inn i kammeret i bunnen av en eksikator glasskrukke (No.1 i Spesifikke materialer og utstyr) og bruke en vanlig papirhåndkle for å dekke overflaten av den nederste fasen, slik at dyret ikke komme i kontakt med væsken. Deretter plasserer den CD1 musen ned i glasset og lukk lokket. Holde dyret i lukket krukke i ca. 1 min til 2 min. Når pust frekvens er ca. en pr, fjerner mus fra glasset.
2. Plasser musen på kirurgi scenen og halshogge med en passende saks. Umiddelbart etter halshogging, legger hodet i isen-kaldt (3-4 ° C), oksygenrikt sukrose aCSF i ca 30 sek.
3. Bruk tynne saks (No.5 i Spesifikke Materialer og utstyr) for å fjerne huden på toppen av skallen og å kutte skallen langs midtlinjen av hodet samt ved to endene nærheten tempoetral lapp. Bruk pinsett (# 6 i Spesifikke Materialer og utstyr) til å skrelle kuttet skallen mot hver side av hodet for å avdekke hjernen.
4. Sett inn en micro lab slikkepott (nr 8 i Spesifikke Materialer og utstyr) inn i gapet mellom de parietallappene av hjernen og hodeskallen til å plukke hjernen fra bunnen av skallen, og deretter slippe den på en forberedt iskald (3 -4 ° C) kirurgisk scene dekket med vått filterpapir (nr 2 i Spesifikke Materialer og utstyr). Fjern cerebellum med en is-kjølt blad og skille de to halvkuler ved å skjære midtlinjen av hjernen. Deretter plasserer de to separerte halvkuler i et beger fylt med iskald sukrose aCSF boblet med 95% O _2/5% CO _2.
5. Ta den ene halvdelen av halvkulen og plass på det iskalde filter papir scenen. Plassere vanlige papirhåndklær eller filterpapiret rundt hjernen til å suge ekstra løsning. Bruk to brann polert glass pipette verktøy (nr 10 i materialer ogUtstyr) for å separere cortex fra resten av den sentrale delen av hjernen.
6. Etter at hippocampus er utsatt fra innsiden av hjernebarken og sette på det iskalde scenen, plasserer du to eller tre dråper iskald sukrose aCSF på vev og deretter fjerne ekstra løsning rundt hippocampus. Skjær forbindelser med cortex på to endene av hippocampus. Deretter dissekere hippocampus ut av hjernen med brann polert glass verktøy og fjerne den gjenværende delen av hjernen.
7. Separer hele hippocampus med sin alveus siden opp og hippocampus sulcus vendt ned. Raskt slippe to eller tre dråper iskald sukrose aCSF på vevet igjen og fjerne den ekstra løsning rundt vev ved hjelp av et stykke papir håndkle. Bruke en brann polert glass verktøyet for å slå over hele hippocampus å eksponere sulcus (figur 1 B, C).
8. Under en normal optisk mikroskop, sette inn et spesiallaget glass nål (nr 11 i Specific MateriALS og utstyr) i én ende av sulcus og kutte fiberforbindelser, fra dentate gyrus (DG) for å subiculum eller CA1-feltet langs retningen av sulcus (figur 1C). Påfør en iskald blad å trimme septal og time ender av hippocampus om nødvendig. Sett en skreddersydde metalltråd sløyfe (nr 12 i Spesifikke Materialer og utstyr) i cut sulcus og trekk over DG vekk fra vevet mens du holder subiculum / CA1 slutten av hippocampus ved en brann polert glass verktøyet (figur 1D) .
9. Etter utfoldingsprosessen ovenfor, legge til ytterligere to eller tre dråper av iskald sukrose aCSF på vev og fjerne den ekstra løsning rundt vevet. Deretter trimme den utfoldet hippocampus med iskald blad på kantene (figur 1E) og plasser utarbeidelsen av en slikkepott til å utvinne kammer fylt med normal aCSF og boblet med 95% O _2/5% CO ₂ ved RT (ca. 25 ° C). Reiseutbrettet hippocampus vev å gjenopprette ca 1 time før du legger den inn i innspillingen kammeret.
10. Ta den andre hjernehalvdel og bruke den til å gå gjennom trinn 2,5 til 2,9. Vanligvis tar 1 til 2 min å fullføre hele prosedyren for å brette ut et enkelt hippocampus og slippe iskald sukrose aCSF kontinuerlig for å holde vevet oksygen og hydrert.

3. Eksperimentell System Setup

1. Lim en tilpasset fabrikkert PMEA på en pinne Grid Array (PGA) pakke og bruke mikro ledning bonding å koble hver pad fra en enkelt microelectrode til pute av en nål på pakken (Figur 3B). Deretter setter du pakke inn i kontakten på en skreddersydd kretskort ^13.
2. Individuelt koble hver microelectrode til sine filtre med band pass cut-off frekvens fra en Hz til 4 KHz og forsterkere med gevinst på 100 på skreddersydde kretskort ^13. Digitalisere det analoge utgangssignal fra kretskortet ved hjelp av en A / D-konverting system, og erverve og lagre dataene på en datamaskin.
3. Lim en skreddersydd plast opptak kammer rundt array med innløp og utløp rør for væsketilførselen (Figur 4A). Bruke i det minste to flasker for å holde forskjellige løsninger i systemet, og delta og styre utgangsrøret fra flaskene av en tri-ventil. Koble utgangen av tri-ventilen til et rørsystem med et IV-dråpekammeret som er å føre oppløsningen inn i opptakskammeret.
4. Mellom tri-ventil og innløpet av opptakskammeret, legge til en elektrisk ovn for å oppvarme oppløsningen til en regulert temperatur (35 ° C) før oppløsningen føres til opptakskammeret. Fest utløpet av opptakskammeret til et vakuumrør for å samle opp løsningen i et vakuumrør koblet kolbe. Ikke resirkulere noen løsning på noen eksperiment i denne studien.

4. Plassere Utbrettet Hippocampus på PMEA å Noter Neural aktivitet

For å forberede den eksperimentelle oppsett, fylle en flaske med normal aCSF og en annen flaske med 4-AP aCSF. I begge flasker, boble 95% O _2/5% CO ₂ fra begynnelsen av hvert forsøk. Bruk en tri-ventil-kontakten for å kontrollere hvilken løsning vil bli valgt i løpet av et eksperiment. Koble en vakuumrøret ved utløpet av kammeret for å pumpe oppløsningen inn i en støvbeholder. Oppvarme rørledningen før levere den inn i opptakskammeret, og holde løsningen ved en kontrollert temperaturnivå (35 ° C).

Når innløp og utløp av opptak kammeret er lukket, kan du bruke en spesiallaget glass pipette dropper å overføre og plassere den utbrettede hippocampus i opptakskammeret. Under mikroskopet, plasserer den utbrettede hippocampus ved å bruke en vanlig liten pensel mens vevet er flytende i oppløsningen. Plasser utfoldet hippocampus med sin alveus siden ned, CA3 området peker bort, og CA1 feltet peker mot forskeren. Nøye suge bort løsningen i kammeret ved hjelp av en vakuum pipette fra kanten av opptakskammeret for å senke nivået til løsningen kammeret tørkes og vevet er senket ned på matrisen. Deretter forsiktig plassere en spesiallaget vev anker (figur 4) (nr 14 i Spesifikke Materialer og utstyr) på toppen av vev for å holde den utbrettede hippocampus på tabellen. Satt noen få dråper av løsningen inn i opptakskammeret for å fylle den, og gradvis åpne innløpet og utløpet for å justere strømningshastigheten til omtrent to dråper per sekund i IV dryppkammeret.

Inkuber vev i opptakskammeret med normal aCSF i omtrent 1 min for å gjenvinne, deretter skifte løsningen tilførselen til 4-AP oppløst aCSF og justere strømningshastigheten på riktig måte. Inkuber vevet i 4-AP oppløst aCSF i 5 til 10 min og deretter forskeren kan starte programvare for å registrere signalet når spontan aktivitet vises.

5. FjerneVev fra PMEA Etter et eksperiment

1. Styr vev anker av en micromanipulator og gradvis løfte vev fra innspillingen kammeret. Slå av både innløp og utløp for å stoppe flyten i innspillingen kammeret. Innspillingen kammeret bør være full med løsning eller legge noen dråper av løsningen for å fylle kammeret om opptakskammeret er ikke full.
2. Bruk en liten pensel til å løfte hver hjørne av vev. Hvis vevet ikke er flytende i oppløsningen, og deretter anvende vakuumrøret for å tørke kammeret nøye med vevet fremdeles sitter på matrisen. Deretter åpner nøye innløpet til gradvis fylle kammeret og stenge innløpet til å stoppe flyten når innspillingen kammeret er full. Påfør liten pensel til å løfte hver hjørne av vevet igjen.
3. Gjenta trinn 5.2 til vev er løsrevet fra matrisen og flytende i oppløsningen. Hvis vevet er flytende i løsningen, og deretter bruke vakuumrør å suge vevet unna. Åpen tHan strømme i innløpet og åpner vakuum i utløpet. Vask systemet med destillert vann og tørke den ut.

Representative Results

Resultatene vist i figurene her data ble registrert i den ikke-brettede hippocampus preparat med 4-AP (100 pM) aCSF tilsatt under inkubering av vevet i opptakskammeret ved romtemperatur (25 ° C). Normalt aktivitet starter innen 5 min, men i noen hippocampus vev fra de eldre dyr kan det ta lengre tid. 4-AP-indusert neuronal avfyring observert med PMEA er den samme som tidligere rapportert ^14,15. Siden elektrodene ha en høyde på 200 um, blir elektrodespissene ligger like under cellelaget (figur 3C), fordi cellelaget er vanligvis 250 til 300 um ovenfor alveus av hippocampus (figur 2), opptak (57 ute av 64 i prøve eksperimentet) fra forskjellige kanaler har en hovedsakelig positiv avbøyning. Men noen av disse positive opptakene kunne vise små negative nedbøyninger i tillegg (Figur 5B) dersom opptak elektrode tips er nær nok til cellelaget.Hvis elektrode tips er plassert rett på nivået av celle laget, vil opptaket har veldig skarpe negativ spiking med positive skift på den eller bare negativ spiking (figur 5C) ^16. I data prøven vist her, fem kanaler ut av 57 innspillinger har negativ spiking. Etter å skaffe data fra alle 64 kanaler, er fremgangsmåten i enkelte normalisering (figur 6B) anvendes til å kartlegge det nevrale forplantning på en 2-D planet langs tidsaksen for opptak ^7. Med en kombinasjon av PMEA, og den utbrettede hippocampus, er neural forplantning kartlagt og observert for å initiere det meste i den ene siden av CA3 og beveges i lengderetningen i en diagonal bølgefront, som krysser hele området av hippocampus (Figur 6).

Figur 1. Kirurgisk prosedyre for en utbrettet hippocampus . (A) En av de to hippocampi er dissekert fra tinninglappen av en mus hjernen. (B) septal og timelige avslutninger langs lengdeaksen. (C) Hippocampus er snudd med en brann polert glass pipette å eksponere sulcus. Begge ender av hippocampus er trimmet og et glass nål brukes for å kutte forbindelsene mellom DG og CA1 eller subiculum langs lengdeaksen. (D) hippocampus er foldet ut av en skreddersydd av metall trådsløyfe. (E) utfolding med hippocampus subiculum og DG trimmet. (F) Den endelige vev utarbeidelse av en utbrettet hippocampus. Denne stilling viser orienteringen av hippocampus når den er plassert på rekke i et eksperiment. For flere detaljer om utbrettet hippocampus anatomi henvises til eksperimentelle metoder i tidligere publiserte manuskripter ^7.g1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Histologi tverrsnitt av den ikke-brettede hippocampus. Krystall-fiolett flekk viser posisjonen av CA1-CA3 pyramidale cellelaget i løpet av de utspredte hippocampus et nivå på 250 til 300 um ovenfor alveus for derved å lokalisere mikroelektroder rett under cellelaget (se figur 3C). For å få delene farget med krystallfiolett, vevet var etter fast etter hippocampus var utfoldet. Den utbrettede hippocampus ble plassert i 4% PFA O / N. Deretter ble vevet overført og oppbevart i sukrose-løsning (30%) i 48 timer, og etterfulgt av snap-frysing i en syklisten inneholdende isopentan (2-metylbutan) avkjøles til -35 ° C i tørris. Frosne delen ble deretter kuttet i en kryostat med20 mikrometer tykke seksjoner i tverrplanet (som vist i figur 2) for å avsløre plasseringen av pyramide celle laget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. utfoldet hippocampus på PMEA. (A) Top visning av en ny PMEA med mikroelektroder plassert ved enden av hver gull metall spor. Innsatsen på høyre side viser en enkelt mikroelektrode i henhold til elektronmikroskopi med en høyde på 200 um og en diameter på 20 um ^7,13. (B) microelectrode matrise er limt på en PGA-pakke med et plastopptakskammeret rundt om mikroelektroder et glass-substrat. Innsatsen til høyre viser en utbrettet hippocampus plassert på microelectrode array i midten. (C) På venstre viser Optical Coherence Tomography (OCT) avbildning utbrettet vev plassert på toppen av tabellen i et annet eksperiment. På høyre, to langsgående skive bildene innhentet fra OCT bildebehandling til venstre viser microelectrode tips (hvite prikker pekte pilene) komme inn i området rett under cellen kroppen lag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .

Figur 4. Eksperimentell oppsett. (A) En plastdeksel lokk med skruer er plassert over kretsene for å beskytte den mot mulig vannskader. Innspillingen Kammeret har både innløps- og utløpsrørene for å bære den væskemengde. En spesiallaget vevet anker limt med en nylonfiber mesh benyttes for å feste tissue under forsøkene. (B) Et bilde tatt fra bunnen av glass-substrat for PMEA viser vevet ankerholde en prøve skive løpet av et eksperiment. De buede ledninger er nylonfibrene fra mesh trykke på toppen av vevet. De runde prikkene er grunnlaget for mikroelektroder. Pilene peker til elektroder som ble skadet etter flere eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Rådata registrert av PMEA fra en utbrettet hippocampus. Venstre panel: 4-AP-indusert epileptiform aktivitet fra en enkelt microelectrode Høyre panel. Zoomet bygde versjonen av signalet merket i tidsvinduet til venstre. (A) 10 sek seksjon av et eksempel på den spontane aktivitet iredusert med 100 mM 4-AP aCSF ble oppnådd for et av de mikroelektroder som ligger i den basale regionen dendrittiske basert på polariteten av signalene med en SNR på 34,9 dB. (B) Rådata fra en annen mikroelektrode som ligger nærmere den somata med en SNR på 27,2 dB. (C) Eksempel på opptak oppnådd fra en elektrode plassert inne i somatisk lag. I dette eksempel er den SNR 18,53 dB. (D) for opptak oppnådd fra en bøyd elektrode fremdeles ledende, men ikke trenger inn i vevet. Det bøyde elektrode har en betydelig lavere SNR i forhold til de intakte elektroder (1,5 dB i dette eksempel). (E) Baseline støy tatt opp fra en mikroelektrode. Grunnlinjen har vanligvis en topp til topp verdi 150-200 uV og impedansen av en enkelt elektrode er rundt 1 til 2 Megohm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. Konvertering av nevrale registrering av data inn i den 2-D forplantning kart. (A) En 170 msek tidsvinduet avkorter en enkelt nerve spiking i hver kanal plottet på bildet av PMEA. Rådata er filtrert av en low-pass filter på 100 HZ. Signalene fra de knuste elektroder interpoleres med opptakene rundt den. I dette eksempelet, alle piggene er positive. (B) En enkelt nevrale pigg fra den rød piksel i (A) er normalisert til fargelinjen med en spesialutviklet metode for individuell normalisering (Vennligst referer til forrige publisering for mer informasjon om normalisering ^7). (C) Fargekartene som er skapt av den enkelte normalisering viser at forplantnings beveger seg over hele arealet av den utbrettede hippocampus ved forskjellige tidspunkt.www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Utviklingen av utbrettet hippocampus forberedelse, hvor de langsgående og tverrgående akser av hippocampus er bevart i kombinasjon med en gjennomtrengende microelectrode array, gir et kraftig verktøy for å undersøke anatomi tilkoblinger eller nevrale forplantning i hippocampus ^7. Dette utfoldingsprosessen er også aktuelt for å studere hippocampus hos voksne mus. Nyere studier med dette preparat viste at 4-AP-indusert epileptiform aktivitet kunne forplante seg med en diagonal bølgefront over hele arealet av den utbrettede hippocampus (figur 6) ^7,8. Disse studiene viste at intakte utfoldet hippocampus gir betydelige fordeler i forhold til hver tverrgående eller langsgående stykker når det nevrale forplantning i en flat hippocampus nevralt nettverk kan undersøkes (figur 6).

Den gjennomtrengende microelectrode gir en betydelig fordel i forhold til eksisterende microelectrode arrays (MEA) som består av flere kontakter plassert over et flatt underlag ^11,12,17. MEA med flate overflateelektrodene er vanskelig å bruke den utbrettede hippocampus, siden cellelaget ligger fra 250 til 300 pm bort fra overflaten (figur 2). Den PMEA beskrevet her ble utviklet for å løse dette problem med 64-penetrerende elektroder som er egnet for å studere det nevrale forplantning med en høyde på 200 um til nå dypt inne i vevet ^7,13. I tillegg PMEA anvendelig også i en hvilken som helst flat vev preparat, så som kortikal skiver, hippocampus tversgående skiver etc.

En annen fordel ved å bruke denne PMEA er forbedret SNR. En prototype studium av denne PMEA viser SNR-forhold på nevrale signal registreres av denne PMEA har en gjennomsnittsverdi på 19,4 ± 3 dB, noe som er betydelig høyere og mer stabil sammenlignet med den i VSD opptak siden tidligere studier indikerte at giftigheten ogbilde bleking av ventrikkelseptumdefekt klart svekket evne til å ta opp data ^8. Med en forbedret eksperimentell protokoll ved å bruke vev ankeret i denne studien, er SNR av opptaket fra PMEA øker til et område fra omtrent 20 til 30 dB (figur 5), som har en høyere SNR i forhold til de flate-elektrodegrupper med en verdi fra 10 til 15 dB ^11,18. Evnen til å utfolde hippocampus er avgjørende for oppnå et lag av nevroner (CA1-CA3) som kan bli avhørt av en flat opptak array.

Videre, siden silisium matrisen er bygget på et gjennomsiktig substrat, spenningsfølsom fargestoff avbildningsteknikk kan integreres i PMEA system for å studere forplantningen av nevral aktivitet i hippocampus ^8. Transgene mus med fluorescerende spennings- følsomme indikatorer kan også brukes for å undersøke årsaken til og forplantning av signalet under fysiologiske betingelser, så vel som endringer indusert ved pharmacological agenter eller genetisk modifiserte vev fra ulike dyremodeller ^9.

Det er flere viktige skritt for å sikre høy kvalitet opptak. For det første for å sikre levedyktighet vev, må det kirurgiske inngrepet utføres så raskt som mulig. Vanligvis tar det ca 1 til 2 min å gå gjennom alle trinnene fra 2.1) til 2.10). Praktisering av utfoldelsen prosedyre på noen eksempler på dyr er svært foreslått før selve eksperimentell operasjon utføres. For det andre strømningshastig-heten må holdes konstant for å unngå enhver svingning av nivået av perfusjon fluidet i opptakskammeret. Videre bør vevet forankres ned for å unngå bevegelse i vevet i forhold til matrisen.

Selv om PMEA beskrevet her kan gi nyttige signaler i overvåkingen av nevrale forplantning i utbrettet hippocampus, er det noen ulemper og begrensninger i denne opptaks metodikk.

For det førsteKan mikroelektroder brekke på grunn av den mekaniske kraft som er lagt på dem (figur 5D, E). Under prosedyren av vev plassering og fjerning, kan utilsiktet kontakt mellom liten pensel og rekke føre til at mikroelektroder å bøye eller brekke. Når vevet ankeret er senket ned av mikromanipulator, kan den horisontale bevegelse av vev langs bunnen av kammeret skape en skjærkraft som kan føre til bøyning eller brudd av elektrodene. I en fremtidig konstruksjon, bør mikroelektroder formes med en noe tykkere base for å gjøre dem sterkere. I den nåværende versjon av denne PMEA, opptakselektroder har en smal base i forhold til diameteren ^13, for derved å svekke elektrodene (figur 3A).

Rengjøringsprosessen bør også forbedres i tilstrekkelig grad å fjerne det gjenværende vev og fibre som kan festes til rekken. Etter hvert forsøk, små biterav vev kan forbli festet til mikroelektroder, og denne resterende vev igjen på elektrodene må fjernes. Hvis disse gjenværende vev ikke blir fjernet, kan impedansen av elektrodene og SNR av opptakene påvirkes. Spyling av systemet med destillert vann er foreslått som angitt i del 5 i protokollen delen. Brukere oppfordres til å skylle systemet med litt svak syrlig løsning som kan løse opp vev uten å skade systemet

En annen ulempe ved denne protokollen er at i løpet av den etterfølgende prosedyre, er perforantveien i utbrettet hippocampus skjæres, hindrer gransking av de mulige nervesignaler som utbrer seg fra DG til andre lag av hippocampus.

Som konklusjon, har vi beskrevet her er en ny metode for å undersøke forplantning av nerveaktiviteten i hippocampus ved å kombinere et høyt aspektforhold microelectrode array med ubrettet hippocampale tissue. Metoden førte til en bedre forståelse av hvordan neuronal aktivitet kan forplante seg både i lengde- og tverretning. Denne teknikken kan også bli brukt til kortikalt vev plasseres på en lignende måte på toppen av matrisen. Videre kombinerer optisk opptaksteknikk med dette preparatet er mulig siden matrisen er gjennomsiktig og kan også føre til noen viktige funn om signalutbredelse i nervevev.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
desiccator jar	LABRECYCLERS Inc.	5410	Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use.
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus	N/A	N/A	A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it.
Custom made tissue recovery chamber	N/A	N/A	Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
Straight Operating Scissors	Fisher Scientific	S17336B                                            Medco Instruments No.:81995	This scissors is used to   decapitate the mice.
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors	Fisher Scientific	12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320	This scissors is used to cut the skull of the mice.
Miltex Hysterectomy Forceps	Claflin Medical equipment	CESS-722033-00001	This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
Micro Spatula	Cardinal Health		This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber.
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula	Cardinal Health		this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
small paint brush	Lowe's	tem #: 105657                  Model #: 90219	The one with the smallest size in a normal paint brush package
Fire polished glass help tool	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass needle	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass tool with a metal wire loop	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
Custom made glass solution dropper	N/A	N/A	This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
Custom made tissue anchor	N/A	N/A	Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator.
Custom fabricated microelectrode array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Custom made filter and amplifiers circuits for the array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Data acquisition processor 3400a	Microstar Laboratories	N/A	This is a complete data acquisition system with A/D converter.