Introduction
Undersøgelse af Drosophila melanogaster har tilvejebragt stor indsigt i den genetiske regulering af en lang række af fænomener. Især har der været omfattende forskning på æg udvikling, fordi oogenesen giver en medgørlig måde at undersøge mange forskellige udviklingsmæssige processer, herunder væv mønsterdannelse, cellepolaritet ændringer switching cellecyklus, og translationel regulering 1,2,3,4. En vigtig morfogent hændelse under oogenesen er specifikationen, køb af bevægelighed og migration af en række celler kaldet grænsekontrol celler (revideret i 5). Da celle migration er et centralt element i animalsk morfogenese, og fordi den genetiske regulering af denne proces er godt bevaret, mekanismer bestemt i fluer vil sandsynligvis være vigtigt i andre sammenhænge. Således undersøger vi den molekylære kontrol med grænsekontrol celle migration. For vores undersøgelser har vi udviklet en ny metode til at observere de forreste poler udvikle æg,hvor der opstår grænseoverskridende celler, til at undersøge, hvordan de udvikler sig i detaljer.
I æggestokken, findes æg kamre på forskellige udviklingsstadier langs kaldet ovarioles kæder, som er indkapslet i en tynd kappe (figur 1A). Hvert æg kammer vil gå på at danne et æg. Under oogenesen skal flere forskellige celletyper udvikle på en koordineret måde. D. melanogaster æg kammer består af 16 kim-linje-celler, herunder en oocyt, omgivet af et enkelt lag follikulær epitel 6. Et lille antal specialiserede celler, der kaldes polære celler, opstår på forreste og bageste poler epitelet. De 6-8 grænseoverskridende celler oprindelse i det forreste epitel af ægget kammeret, induceret af de polare celler 5,7. I midten af oogenesen (trin 9), grænseområderne cellerne løsnes fra deres naboer og migrere mellem sygeplejerske cellerne at nå ægget ved den bageste af ægget kammer 5,7. Denne bevægelse skal udføresmens de tilgrænsende celler forbliver i en klynge omkring to ikke-bevægelige polære celler, hvilket gør dette til en form for kollektiv celle migration. Vellykket migration af grænsen celleklynge sikrer korrekt udvikling af micropyle af æggeskallen, som er nødvendig for befrugtning.
De forreste polære celler instruere celleskæbnen grænse ved at aktivere en signaltransduktionskaskade. Polar celler secernerer et cytokin, Uparret (UPD), der binder til et transmembrant receptor, Domeless (DOME) på nærliggende follikelceller under trin 8 oocytudvikling 8,9. Bindingen af UPD forårsager Janus tyrosinkinase (JAK) at phosphorylere signaltransducer og aktivator af transkription (STAT) 8,10,11. STAT flytter derefter til kernen for at aktivere transkription. Langsomme Border Cells (SLBO) er en transskription faktor, er en direkte transkriptionel mål for STAT og er også nødvendig for grænsen cellemigration 12. Lateral udsigt over æg kamre angiver that STAT virksomhed er lovreguleret i en gradient på tværs af forreste epitel 8,11,13. Follikelceller tættest på polære celler har de højeste niveauer af aktiveret STAT, således de bliver grænserne celler og invaderer den tilstødende kim-line væv.
For at forstå, hvordan de tilgrænsende celler er beskrevet i og løsnes fra epitel, vi har brug for at observere, hvordan vævet er organiseret. Hvis vi ser æg kamre fra en anterior-on perspektiv, ville vi forvente, radial symmetri STAT aktivitet i follicle celler, der omgiver de polære celler. En ende på visning ville også mere præcist viser forskelle i membranproteiner og celle-celle-grænseflader før og under løsgørelse end sammenligne celler i forskellige fokale planer. Fordi æg kamre er aflange og knyttet til hinanden ved stilk celler, de rette på dias sideværts, hvilket gør det vanskeligt at observere den forreste arkitektur. Således mange oplysninger om cellerne ved polerne af ægget kammeret harblevet udledes laterale visninger. Selv om nogle oplysninger kan fås gennem algoritmiske 3-D rekonstruktioner af optiske sektioner, lysspredning, fotoblegning og fattigere grænser for opløsning i Z-aksen gør oplysningerne mindre detaljerede og pålidelige i mangel af dyre teknikker som super-opløsning mikroskopi 14 . Andre typer sektion baseret billeddannelse (f.eks elektronmikroskopi eller mikrotomsektionering) kræver omfattende manipulation af væv, herunder dehydrering, hvilket øger sandsynligheden for artefakter. Således har vi udviklet en ny metode til at afbilde D. melanogaster æg kamre mens oprejst. Denne metode har allerede vist sig nyttig i at belyse, hvordan motile celler skæbnebestemt (se Repræsentative resultater og Manning et al, under revision), og vil sandsynligvis være mere bredt værdifuld i studier af andre aspekter af oogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissektion af Ovarioles
- Overfør omkring femten 2-4 dage gammel kvinde fluer og et par hanner til en frisk flue fødevarer hætteglas tilsat tørgær. Brug bomuld som et stik til hætteglassene, og tilføje et par dråber vand til bomuld for at holde luftfugtigheden høj.
- Anbring hætteglasset i et 25 ° C inkubator i 14-16 timer for at maksimere antallet af trin 8-10 æg kamre.
BEMÆRK: Inkubationstiden varierer afhængig af temperatur og den ønskede scene. - Forbered dissektion medier, 0,1 M KPO 4 og NP40 løsninger efter behov for den næste dag (se Materialer).
- Bedøver fluerne ved hjælp af CO 2, og placere under en dissektion mikroskop. Pipetter nogle dråber dissektion medier i hvert hulrum i glasset depression dias.
- Hold pincet i hver hånd på en 30 ° vinkel i forhold til bordpladen og orientere en kvindelig flue med vingerne ned. Med din ikke-dominerende hånd, afhente den kvindelige med pincet, greb hende i ennterior af maven, nær thorax, og dykke hende ind i dissektion medier i depression slide (figur 1A indsat).
- Med det andet par pincet, tag fat i ydre skelet på den ventrale bageste af maven og gennemtrænge. Tag æggestokkene ved den bageste ende, og derefter trække dem ud af maven og anbringes i den friske medier på den anden side af depression slide. (Figur 1A indsat). Undgå at trække fra hinanden tarmen. Kassér slagtekroppen.
- Gentag med de andre kvindelige fluer, indtil alle æggestokke dissekeres. Kassér hannerne.
- Med et par tænger, holde en æggestok ved den bageste ende (nær de største æg kamre), og med den anden hånd bruger en pincet til at knibe en af de mest forreste æg kamre (germarium). (Figur 1A).
- Langsomt og støt, trække en ovariole kæde ud i æggestokkene kappe. Fortsæt med at dissekere ud ovarioles enkeltvis, indtil alle ønskede æg kamre er removed.
- Gentag trin 1,7-1,8 for alle dissekerede æggestokkene.
- Når du er færdig, overføre ovarioles til en 0,6 ml rør ved hjælp af en plastik overførsel pipette.
- Lad ovarioles afregne til bunden af røret, derefter gå videre til fastsættelse og farvning trin.
2. Immunfluorescerende (IF) Farvning af Ovarioles
- Fjern forsigtigt dissektion medier fra ovarioles med en pipette. Sørg for ikke at fjerne ovarioles eller æg kamre. Efterlad ca. 50 pi ovarioles og dissektion medier.
- Tilføj 50 pi 16% paraformaldehyd til 150 pi 0,1 M KPO 4 buffer i et rør, og tilsæt løsning på æg kamre til at løse dem. Inkuber mens rocking for 10 min. ADVARSEL: paraformaldehyd er giftig.
- Fjern fiksativ og skylles to gange med 0,5 ml NP40 vaskebuffer.
- Vask to gange i 15 minutter hver ved stuetemperatur.
- Se standard IF protokol 15 for efterfølgende trin.
- Kort fortalt, efter fiksering, tilsættesprimære antistoffer ved de passende fortyndinger og inkuberes O / N ved 4 ° C. Vask i NP40 flere gange, derefter tilføje sekundære antistoffer (1: 200 fortyndinger).
- Vask flere gange i NP40, tilsæt derefter DAPI (1: 1.000) i 10 minutter, og gentag derefter vaske. Når IF-protokollen er afsluttet, tilsættes 200 pi 50% glycerol i PBS til æg kamre og lad det sidde ved stuetemperatur i 2 timer.
- Fjern løsning, erstatte det med 70% glycerol i PBS, og dæk med folie. Anbring prøven ved 4 ᵒC indtil den er klar til montering. I mellemtiden, fortsæt med trin 3.
3. Advance Forberedelse af Glycerin Jelly Slides
- Mål mindst 4 ml glycerin gelé med en spatel og fylde et glas cellekultur rør til den halvvejs mærket. Smelt glycerin jelly i et vandbad ved 55 ° C i 30 minutter.
- Hæld en lille dråbe glycerol, ca. 300 pi fra stamopløsningen på to mikroskopobjektglas. Ved hjælp af et væv, spredt glycerol i en tynd layer over hver af gliderne. Dette giver en base og giver mulighed for nem fjernelse af glycerin gelé i trin 5.6.
- Skær spidsen ud af en filtreret 1000 pi pipettespids. Brug cut pipettespids til at overføre 1.000-1.500 pi varm glycerin gelé langsomt til hver objektglas. Vær omhyggelig med at undgå bobler.
- Lad glycerin jelly slides sidde i 5 minutter ved stuetemperatur for at indstille.
- Placer hver glycerin gelé dias i 60 mm × 15 mm petriskål og dække med plast wrap. Anbringes ved 4 ° CO / N. Eventuelt butik glycerin jelly slides op til 5 dage ved 4 ° C.
4. Montering Egg Chambers
- Brug af prøver fra trin 2.5, pipette flere 3 pi dråber æg kamre i 70% glycerol på tværs af en glycerin gelé dias. Fortsæt pipettering 3 pi dråber indtil alle æg kamre er på dette dias. Kontroller, at hver dråbe indeholder mindst ti æg kamre. I mellemtiden opvarmes en kultur rør glycerin gelé i et 55 ° C vandbad.
- Placer glycerin gelé slide med æg kamre under en dissektion mikroskop. Juster forstørrelse, således at kun en dråbe af æg kamre er i synsfeltet (figur 1B).
- Ved hjælp af en 30 gauge nål som en ske, afhente den ønskede scene æg kammer. Om nødvendigt separate ønskede æg kamre fra en ovariole kæde ved hjælp af nålen som en kniv.
- For at undgå rester, der kan forstyrre billeddannelse, overføre ægget kammer til det andet glycerin gelé slide, med den forreste vender venstre (Figur 1E -1). Gentag, indtil der er mindst syv æg kamre linet op i en søjle (figur 1C).
- Form nye kolonner af syv indtil alle de ønskede æg kamre er overført til den anden glycerin gelé dias.
- Riv et lille stykke væv og twist. Brug dette til at absorbere overskydende PBS-glycerol fra ægget kamre ved let berøring hver enkelt. Vær omhyggelig med at ikke at fjerne æg kamre.
- Klipspidsen af en filtreret 200 pi pipettespids. Brug dette til at overføre 150 pi glycerin gelé til at dække alle de kolonner af æg kamre.
BEMÆRK: Mængden af glycerin gelé nødvendig for at dække kolonnerne er baseret på æg kammer etaper og antallet af kolonner. Beløb kan justeres. - Lad monteret æg kamre sidde i 5 minutter ved stuetemperatur, indtil det øverste lag af glycerin gelé er helt størknet (figur 1D).
- Anbring slide af monterede æg kamre i en 60 mm × 15 mm petriskål og dække med plast wrap. Opbevares ved 4 ° CO / N til at tillade glycerin gelé lag for at størkne sammen (sted i mørke, hvis der er bekymring fotoblegning).
5. Fremstilling af Egg Chambers for Imaging
- Placer dias af monterede æg kamre under en dissektion mikroskop. Juster forstørrelse, således at kun én kolonne af æg kamre er i synsfeltet.
- Ved hjælp af en 45 ° vinkel miniature skalpel skæres et lige lysstofrÃht linje langs den højre side af den første kolonne af æg kamre (tæt på den bageste side af ægget kamre). (Figur 1D-E)
- Dernæst skæres over den første æg kammer foroven og under den sidste æg kammer i kolonnen. På dette tidspunkt søjlen af æg kamre skal skæres på tre sider.
- Ved hjælp af en microknife, snit langs venstre side af kolonnen, så tæt som muligt til den forreste side af ægget kamre (figur 1E -3).
- Tilsæt 100 pi kold 1X PBT over cut kolonne.
- Brug en rund kantet spatel til at fjerne den overskydende glycerin gelé omkring tre sider af cut kolonne af æg kamre og kassér, mens resten på diaset.
- Sæt spatel i snittet foretaget på den forreste side af æg kamre og adskille kolonnen fra den primære glycerin gelé blok.
- Forbered prøver til enten omvendt (5.8.1) eller opretstående (5.8.2) mikroskopi.
- For omvendt mikroskop: Transfer than kolonne af æg kamre til et dækglas med forreste side af æg kamre nedad. Gentag trin 5,2-5,8 indtil alle kolonner af glycerin gelé er blevet fjernet og monteret. Tilføj et par dråber af 50% PBS-glycerol på hver blok af æg kamre for at forhindre dem i at tørre ud. Billede æg kamre direkte på dækglas.
- For Upright Microscope: Overfør kolonnen af æg kamre til et objektglas med den forreste side opad. Gentag trin 5,2-5,9 indtil alle kolonner af glycerin gelé er blevet fjernet og monteret på mikroskopobjektglas. Tilføj et par dråber 50% PBS-glycerol på hver blok af æg kamre og dække blokke med en # 1 ½ dækglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den opretstående billeddannelse metode tilladt os at se direkte organisationen af celler i den forreste follikulært epitel i trin 8. En generel markør for follicle celle skæbne, øjnene fraværende (EYA) protein såvel som det nukleare DNA markør DAPI viste endda udtryk på tværs af denne inden for celler, og viste, at alle celler kunne ses med lignende farvningsintensiteter (figur 2B "). Proteiner reguleres som respons på cytokinet UPD, viste imidlertid variable mønstre og ekspressionsniveauer. Polar celler frigiver UPD apikalt forud for denne fase af æg udvikling 16,17, så vi forventede STAT skal aktiveres radialt omkring de polære celler, som undertiden var tilfældet. Ofte Men vi observeret, at downstream mål for STAT, herunder SLBO, havde mere komplekse udtryk mønstre. For eksempel GFP reporter for SLBO ekspression optrådte i de fleste, men ikke alle, celler der omgav de polære celler (figur 2B, og se MannING et al under revision). Vi har bemærket små forskelle i E-cadherinekspression / lokalisering (Figur 2B), hvilket kan skyldes ændringer i vedhæftning, men mere arbejde vil være behov for at kvantificere og fortolke dette resultat. Disse finesser var ikke målbare gennem lateral tredimensionel rekonstruktion af iscenesatte æg kamre (figur 2C-D). Kan også skelnes Forskellene i den apikale-basal akse follikelcellerne hjælp af opretstående metode. Vi anvendte en reporter linje for ringen kanalen protein Visgun (VSG), som er til stede i det apikale område af plasmamembraner 18 (figur 3A). Upright billeddannelse bekræftet VSG-ekspression blev detekteret i den apikale del af follikelceller, nær den smalleste del af de polære celler (figur 3B).
Vi har også fundet, at den opretstående imaging metode fungerer godt for at se den forreste epitel i trin 9 æg kamre. På dette devellingsopgaver etape, grænseområderne cellerne coalesce sammen omkring de polære celler (figur 4A). Vi kunne overholde disse komprimeret klynger ved hjælp af end-på imaging (figur 4B-C). Som i trin 8, fandt vi tilsvarende niveauer af EYA ekspression i alle de epiteliale celler (ikke vist), mens slbo -GFP samt aktiveret, nuklear STAT markerede bevægelige grænserne celler (figur 4B og 4C). Lokalisering af FAS3 protein indikerede polære celle-polære celle interface (figur 4B). Desuden har vi i begge trin 8 og 9 kan se de store sygeplejerske celler, som indikeret ved DAPI eller phalloidin-farvning af cortical actin (ikke vist), hvilket tyder på denne fremgangsmåde vil også være nyttige i studiet af kønsceller eller kimcelle -follicle celle-interaktioner.
Figur 1. Opretstående montering af Drosophila æg kammers. (A) Drosophila æggestok angiver æg kammer, skede, og ovariole. Afbildning illustrerer positionen af pincet til at trække ovariole langsomt fra æggestokken kappe. Indsat viser placering af flue til dissektion. Ventrale side af kvindelig flue vender opad. A-anterior, P-posterior. (BD) Procedure for montering æg kamre. (B) En lille dråbe af æg kamre i 70% glycerol-PBS, ses under et dissektion stereomikroskop. Den gule pil viser en ovariole kæde; gul pilespids angiver en enkelt æg kammer. Røde pil viser kanten af glycerol-PBS drop. (C) Kolonner af æg kamre anbragt på tyndt lag af størknet glycerin gelé. Gul pilespids angiver en individuel æg kammer. (D) Et andet tyndt lag smeltet glycerin gelé dækker ægget kammer kolonner for at indlejre dem. Gul stiplede linje angiver, hvor der skal skæres efter O / N inkubation ved 4ᵒC. Rød pil viser denkant af det andet lag af glycerin gelé. Røde tal indikerer rækkefølgen af skære æg kammer kolonner (horisontal øverste og nederste snit er ikke vist). Anterior er til venstre. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Imaging af den forreste epitel et tidligt stadium 8 æg kammer. (A) fra siden af en scene 8 grænserne celler langsom (slbo) gen reporter æg kammer (genotype: slbo -Gal4, UAS-mCD8-GFP) 19,20, farvet med DAPI og primære antistoffer som angivet, eller for slbo> GFP. Armadillo (ARM) er fluen homolog af β-catenin. Anterior (A) er til venstre, bageste (P) til højre. (BB ") fra enden visninger af et æg chamber. Tre dimensionel rekonstruktion af Z-stak billeder af en scene 8 slbo- gen reporter æg kammer monteret oprejst, farvet med primære antistoffer som angivet. Magenta stjerner angiver polære celler. DAPI markerer kernerne. (B ') slbo> GFP udtrykkes kun i de formodede grænserne celler (SLBO). E-cadherin (E-CAD) er en adhæsionsmolekyle lokaliseret til membranen og beriget i grænseområder celler. (B ') Eyes Fraværende (EYA) findes jævnt udtryk i kernerne i alle follikelceller undtagen polære celler. (C) Standard sidebillede af en slbo -reporter trin 8 æg kammer farvet med DAPI (blå) og antistoffer mod GFP (SLBO, grønt) ARM (rød), og FAS3 (hvid). Indsat viser akserne: X-aksen er nede (grøn pil), Y-aksen er til venstre (rød pil), og Z-aksen er mod betragteren (blå) (D) til sammenligning med den nye teknik. Dette panel viser en ende på-view CREATed af en tredimensional rekonstruktion, behandlet med Volocity software ved hjælp af en Z-stak af laterale billeder af ægget kammeret vist i C. indsatte viser drejede akser: X-aksen er nede (grøn pil), Z-aksen er nu til venstre (blå pil), og Y-aksen er mod betragteren (rød). Individuelle celler sløret på grund af lav opløsning i Z-aksen; således, den nye strategi er vist i B repræsenterer en betydelig billeddannelse forbedring. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Sammenligning protein ekspression i laterale og forreste domæner af follikulært epitel på en scene 8 æg kammer. (A) Rekonstruktion af en lateral billede af en scene 8 æg kammer visgun (VSG) -GFP reporter <sup> 21-23, farvet for antistoffer rettet mod GFP eller ARM (hvid). DAPI markerer kerner i blå, og store sygeplejerske cellekerner er tydelige. VSG lokaliseres til ringen kanaler i follikelceller (grøn). (BB ') End-on udsigt over et æg chamber.Three-dimensional rekonstruktion af en Z-stak af billeder af en scene 8 VSG-GFP reporter æg kammer, farvet med primære antistoffer som angivet. SLBO protein (rød) er påvist i både polære og grænsekontrol cellekerner. ARM markerer follicle cellemembraner og er beriget i grænseområder celler; DAPI etiketter kerner. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Imaging af tidlige stadie 9 æg kamre. (A) sidebillede af et tidligt stadium 9 slbo -reporter æg kammer. De grænseoverskridende celler (grøn) har grupperet inden for den forreste epitel (hvid pil). BC) End-on udsigt over æg kamre. Tre dimensionel rekonstruktion af en Z-stak af billeder fra et tidligt tidspunkt 9 slbo- gen reporter æg kammer, farves med primære antistoffer rettet mod proteinerne som angivet eller GFP. (B) slbo> GFP udtrykkes i grænseområderne celler (grøn) , mens fasciclin 3 (FAS3, hvid) lokaliseres stærkt til membranen mellem de to polære celler; DAPI markerer kerner (blå). Magenta stjerner angiver polære celler. (C) Både nuklear (aktiveret) STAT og slbo> GFP udtryk findes kun i grænseområderne celler, mens E-cadherin (E-CAD) markerer membraner follikelceller, og DAPI angiver kerner. Magenta stjerner angiver polære celler. Farvning Resultaterne er vist individuelt for slbo> GFP (C ') og STAT (C') Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en metode til at montere og image lille, udvikler æg kamre fra en ende-on perspektiv. Fælles teknikker til billeddannelse æg kamre er optimeret til laterale synspunkter og primært tillade præcis visualisering af medio-lateral follikelceller når farvet med fluorescerende antistoffer. Brugen af Z-stakke eller 3-D rekonstruktioner hjælpemidler i visning af flere fokusplaner, men stadig er utilstrækkelig for sub-cellulær opløsning af polerne af elliptiske æg kamre (figur 2D). Mens dette kan overvindes delvist med de nyeste mikroskopi teknikker såsom super-opløsning billeddannelse, disse metoder er dyre og ikke altid til rådighed. Vi har tilpasset opretstående billeddannende protokoller for Drosophila embryoner 24,25 der skal anvendes til de langt mindre æg kamre. Der er flere vigtige ændringer i den metode, der tegner sig for den meget mindre størrelse af æg kamre sammenlignet med embryoner. Et centralt element i den beskrevne teknik er den fysiske separation af individuelle kamre, som ikke kræves af embryoner. En anden ændring er anvendelsen af en anden glycerin gelé slide under montering (4.4). Størrelsen af æg kamre og deres fastgørelse gennem stilk celler til andre æg kamre kræver manipulation med nålen og fører til ødelæggelse af glycerin gelé. Derfor skal æg kamre blive overført med en nål til en ny glycerin gelé slide til montering (4.5). Upright billedbehandling giver mulighed for visualisering af de områder, sløret af laterale eller vandrette udsigt, afslører nye oplysninger om væv organisation under æg udvikling. Dette førte til nye indsigter på mønsterdannende begivenheder, og vi foreslår, at denne metode kan bruges til at udforske yderligere aspekter af oogenesen.
Vi har bestemt flere kritiske trin i vellykket stående montering. Vi fandt, at det er nødvendigt at fjerne ovariole kæder fuldstændigt fra hylsteret under dissektion, og de ønskede æg kamre skal skæres fra ovariole kæden. Manglende gratis æg kamre fra ovariole gør det vanskeligt at hente den korrekte fase æg kammer (trin 4.3). Vi anbefaler at arbejde med små mængder glycerin gelé ad gangen ved alikvotere det i rør. Må ikke opvarmes glycerin gelé mere end to gange, fordi gentagen opvarmning ændrer konsistens og forhindrer det i at størkne ordentligt (3.1). Brug filter tips til at forhindre opsugning gelé i pipetter. Tillad glycerin gelé at størkne på objektglas i mindst 8 timer ved 4 ° C. Afkortning dette trin gør montering af æg kamre vanskelige (3.6). Det er vigtigt at sørge for at absorbere alle PBS-glycerol fra monterede æg kamre (4.6). Hvis for meget væske er til stede, forhindrer det øverste lag af glycerin gelé klæbe til bunden. I dette tilfælde kan æg kamre flyde og skifte position. For de bedste imaging resultater skal glycerin gelé blokke skæres så tæt på den forreste side af æg kamre som fysisk muligt (5.4). For meget glycerin gelé på detteside nedsætter billedkvaliteten på grund af den øgede afstand mellem prøven og dækglasset.
Der er nogle advarsler for montering prøver i glycerin gelé. For én, øger afstanden mellem prøven og mål. Denne afstand ved stor forstørrelse, især mens du bruger en objektiv olie, kan skabe vanskeligheder med fokus på prøven, hvilket kan resultere i dårlig billedkvalitet. På denne baggrund er det meget vigtigt at skabe sig glycerin gelé blokke meget tæt på de æg kamre. Selvom glycerin gelé er optisk klar, det gør defract noget lys. En anden begrænsning er, at antistof signal kan reduceres på grund af en kombination af arbejdstiden afstand af målet og tykkelsen af glycerin gelé. En forøgelse af koncentrationen af både primær og / eller sekundær antistoffer kan undertiden støtte i at reducere dette problem. Selv om det varierer fra antistof, vi typisk erhvervet bedre billeder ved at bruge dobbelt koncentrationen af sekundære myreiBody i opretstående billedbehandling i forhold til mængden, der anvendes i standard lateral billeddannelse. Vi kender ingen alternativer til glycerin gelé til montering æg kamre oprejst. Andre materialer, såsom agarose og polyacrylamid blev forsøgt, men alle defracted lys mere alvorligt, forårsager et tab af klarhed, mens billeddannelse. Således er denne montage teknik er den bedste, der er i øjeblikket tilgængelig til brug med standard mikroskopi.
Mens vi fokuserede på de stadier af celle specifikation og initiering af motilitet grænse, kan æg kamre i forskellige stadier blive anvendt i denne protokol med kun et par mindre justeringer. Vigtigst er det, kan måleren af nålen ændres til manipulere æg kamre i forskellige størrelser og udviklingsstadier. For trin 7-10, en 30 G nål fungerer godt, fordi de æg kamre passer nemt i smig. For tidligere tidspunkt æg kamre bør anvendes en større gauge nål (mindre affasning) og tilsvarende en mindre gauge (større affasning) bør anvendes til senere stalderen æg kamre. Alt på et ældre udviklingstrin ville være for stor til denne gauge (4.3). Også enhver side af ægget kammeret kan afbildes ved hjælp af denne teknik ved at arrangere glycerin gelé blok af æg kamre med interesseområdet mod målet.
Montering små prøver understøttes i glycerin gelé har potentiale til at være anvendelig i flere sammenhænge. Denne strategi kan anvendes til at visualisere de forskellige typer af små, faste væv fra andre organismer, især når det ville være utilstrækkelig til at undersøge prøver fra kun et perspektiv. Når denne teknik beherskes, kan det bruges til at se æg kamre i enhver ønsket vinkel, afhængigt af hvordan æg kamre er placeret i gelé. Denne metode giver mulighed for enestående udsigt skabe en meget bedre tredimensionel forståelse af cellulær organisation. Upright billeddannelse af æg kamre i forbindelse med immunofluorescent antistoffarvning muliggør nøjagtig detektering af proteinS og celle-celle kontakter, der ikke ville være muligt under standard montering forhold. Vi planlægger at bruge denne metode i kortlægning af celle-celle-interaktioner, der tillader sammensmeltning og frigørelse af grænsen celle klynge fra epitel. På dette tidspunkt, kan det opretstående billeddannelsesteknik ikke anvendes med levende prøver, men vi arbejder også på at overvinde denne hindring. Vi forventer denne metode vil også kunne anvendes til at studere i andre aspekter af Drosophila oogenesen, eller kan tilpasses til billedet andre små væv på nye vinkler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
