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Developmental Biology

की ईमानदार इमेजिंग Published: March 13, 2015 doi: 10.3791/52636
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

Introduction

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की स्टडी घटना की एक विस्तृत श्रृंखला के आनुवंशिक विनियमन में महान अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। Oogenesis ऊतक patterning, सेल polarity परिवर्तन, कोशिका चक्र स्विचिंग, और translational विनियमन 1,2,3,4 सहित कई विभिन्न विकासात्मक प्रक्रियाओं, जांच करने के लिए एक विनयशील तरीका प्रदान करता है क्योंकि विशेष रूप से, अंडा विकास पर व्यापक शोध किया गया है। Oogenesis के दौरान एक महत्वपूर्ण morphogenic घटना (5 में समीक्षा) सीमा कोशिकाओं बुलाया कोशिकाओं का एक सेट के विनिर्देश, गतिशीलता के अधिग्रहण, और प्रवास है। सेल प्रवास के बाद से पशु morphogenesis की एक प्रमुख विशेषता है, और इस प्रक्रिया के आनुवंशिक विनियमन अच्छी तरह से संरक्षित है, क्योंकि मक्खियों में निर्धारित तंत्र अन्य संदर्भों में महत्वपूर्ण होने की संभावना है। इस प्रकार, हम सीमा सेल प्रवास के आणविक नियंत्रण जांच कर रहे हैं। हमारे अध्ययन के लिए, हम अंडे के विकास के पूर्वकाल डंडे निरीक्षण करने के लिए एक नई विधि विकसित किया है,बॉर्डर कोशिकाओं उठता है, जहां वे विस्तार से विकसित कैसे जांच करने के लिए।

अंडाशय के भीतर, विभिन्न विकासात्मक चरणों में अंडा कक्षों एक पतली म्यान (चित्रा 1 ए) में रखा जाता है जो ovarioles बुलाया चेन, साथ में मौजूद हैं। प्रत्येक अंडे चैम्बर एक अंडा फार्म पर जाना होगा। Oogenesis के दौरान, कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं के एक समन्वित तरीके से विकसित करना होगा। डी मेलानोगास्टर अंडा चैम्बर एक एकल परत कूपिक उपकला 6 से घिरा हुआ एक डिम्बाणुजनकोशिका, सहित 16 रोगाणु-लाइन कोशिकाओं, के होते हैं। ध्रुवीय कोशिकाओं बुलाया विशेष कोशिकाओं की एक छोटी संख्या, उपकला के पूर्वकाल और कूल्हों के खंभे पर उत्पन्न होती हैं। 6-8 सीमा कोशिकाओं ध्रुवीय कोशिकाओं 5,7 द्वारा प्रेरित अंडा चैंबर के पूर्वकाल उपकला, में आरंभ। मध्य oogenesis (चरण 9) में, सीमा कोशिकाओं अपने पड़ोसियों से अलग और अंडा चैम्बर 5,7 के पीछे में डिम्बाणुजनकोशिका तक पहुँचने के लिए नर्स की कोशिकाओं के बीच आ जाते हैं। इस आंदोलन को पूरा किया जाना चाहिएबॉर्डर कोशिकाओं को इस सामूहिक सेल प्रवास का एक प्रकार है, जिससे दो गैर गतिशील ध्रुवीय कोशिकाओं के आसपास के एक क्लस्टर में रहते हैं। सीमा सेल क्लस्टर के सफल प्रवास निषेचन के लिए आवश्यक है जो अंडे का खोल के micropyle, के समुचित विकास सुनिश्चित करता है।

पूर्वकाल ध्रुवीय कोशिकाओं को एक संकेत पारगमन झरना सक्रिय द्वारा सीमा सेल भाग्य हिदायत। ध्रुवीय कोशिकाओं डिम्बाणुजनकोशिका विकास 8,9 की अवस्था आठ दौरान कूप कोशिकाओं पड़ोसी पर, एक transmembrane रिसेप्टर, Domeless (डोम) को बांधता है, जो एक साइटोकाइन, unpaired (युपीडी), छिपाना। युपीडी के बंधन जानूस टाइरोसीन काइनेज (जे ए) प्रतिलेखन (स्टेट) 8,10,11 के सिग्नल ट्रांन्सड्यूसर और उत्प्रेरक phosphorylate का कारण बनता है। स्टेट फिर प्रतिलेखन को सक्रिय करने के नाभिक को ले जाता है। धीरे बॉर्डर कोशिकाओं (SLBO) स्टेट का एक सीधा ट्रांसक्रिप्शनल लक्ष्य है और यह भी सीमा सेल प्रवास 12 के लिए आवश्यक है कि एक प्रतिलेखन कारक है। अंडा कक्षों के पार्श्व विचारों टी का संकेतटोपी स्टेट गतिविधि पूर्वकाल उपकला 8,11,13 भर में एक ढाल में नियंत्रित किया जाता है। ध्रुवीय कोशिकाओं को निकटतम कूप कोशिकाओं इस प्रकार वे सीमा कोशिकाओं हो जाते हैं और आसन्न रोगाणु-लाइन ऊतक आक्रमण, सक्रिय स्टेट के उच्चतम स्तर है।

बॉर्डर कोशिकाओं के भीतर निर्दिष्ट और उपकला से अलग कर रहे हैं कि कैसे समझते हैं, हम ऊतक आयोजित किया जाता है कैसे निरीक्षण करने के लिए की जरूरत है। हम एक पूर्वकाल पर नजरिए से अंडा कक्षों देखते हैं, तो हम ध्रुवीय कोशिकाओं के आसपास कूप कोशिकाओं में स्टेट गतिविधि के रेडियल समरूपता की उम्मीद होगी। एक अंत पर देखें भी अधिक सही से पहले और विभिन्न फोकल विमानों में कोशिकाओं की तुलना से सेना की टुकड़ी के दौरान झिल्ली प्रोटीन और सेल सेल इंटरफेस के मतभेद दिखा सकते हैं। अंडा कक्षों आयताकार और डंठल कोशिकाओं द्वारा एक दूसरे से जुड़े होते हैं, क्योंकि वे यह मुश्किल पूर्वकाल वास्तुकला निरीक्षण करने के लिए कर रही है, पार्श्व स्लाइड पर बसा है। इस प्रकार, अंडा चैंबर के ध्रुवों पर कोशिकाओं के बारे में ज्यादा जानकारी नहीं हैपार्श्व विचारों से inferred किया गया। कुछ जानकारी photobleaching ऑप्टिकल वर्गों, प्रकाश बिखरने के एल्गोरिथम 3-डी पुनर्निर्माण, और जेड अक्ष में संकल्प के गरीब सीमा के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है हालांकि सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी 14 जैसी महंगी तकनीक के अभाव में यह जानकारी कम विस्तृत और विश्वसनीय बनाने के । खंड-आधारित इमेजिंग के अन्य प्रकार (उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या सूक्ष्म सेक्शनिंग) कलाकृतियों के लिए संभावना बढ़ रही है, निर्जलीकरण सहित ऊतकों के व्यापक हेरफेर की आवश्यकता है। इस प्रकार, हम छवि डी के लिए एक नई विधि विकसित ईमानदार, जबकि मेलानोगास्टर अंडा कक्षों। इस विधि को पहले से ही (समीक्षा के तहत प्रतिनिधि परिणाम और मैनिंग एट अल, देखें) गतिशील कोशिकाओं नसीब रहे हैं कि कैसे elucidating में उपयोगी सिद्ध, और अधिक मोटे तौर पर बहुमूल्य oogenesis के अन्य पहलुओं के अध्ययन में होने की संभावना है।

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Protocol

Ovarioles 1. विच्छेदन

  1. जोड़ा सक्रिय सूखी खमीर के साथ एक ताजा मक्खी भोजन शीशी के बारे में पन्द्रह 2-4 दिन पुरानी मादा मक्खियों और कुछ पुरुषों स्थानांतरण। शीशियों के लिए एक प्लग के रूप में कपास का उपयोग, और उच्च नमी बनाए रखने के लिए कपास के लिए पानी की कुछ बूँदें जोड़ें।
  2. 14-16 घंटे के लिए एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह शीशी चरण 8-10 अंडा कक्षों की संख्या को अधिकतम करने के लिए।
    नोट: ऊष्मायन समय तापमान और इच्छित मंच पर निर्भर करता है।
  3. अगले दिन के लिए जरूरत के रूप में विच्छेदन मीडिया को तैयार है, 0.1M केपीओ 4 और NP40 समाधान (सामग्री देखें)।
  4. सीओ 2 का उपयोग मक्खियों anesthetize, और एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे जगह है। Pipet गिलास अवसाद स्लाइड में प्रत्येक गुहा में विच्छेदन मीडिया की कई बूँदें।
  5. एक महिला मक्खी नीचे पंखों के साथ तालिका के शीर्ष और ओरिएंट के लिए एक लगभग 30 डिग्री के कोण पर एक हाथ में संदंश पकड़ो। अपने गैर प्रमुख हाथ के साथ, एक में उसे लोभी, संदंश का उपयोग कर महिला उठाओछाती के पास पेट के nterior, और अवसाद स्लाइड (चित्रा 1 ए इनसेट) में विच्छेदन मीडिया में उसे डूब।
  6. संदंश के अन्य जोड़ी के साथ, पेट के उदर पीछे पर बहिःकंकाल समझ और के माध्यम से घुसाना। पीछे अंत में अंडाशय ले लो, तो पेट से उन्हें बाहर खींचने के लिए और अवसाद स्लाइड के दूसरे पक्ष पर ताजा मीडिया में जगह है। (चित्रा 1 ए इनसेट)। आंत अलग खींच से बचें। शव त्यागें।
  7. सभी अंडाशय विच्छेदित कर रहे हैं जब तक अन्य मादा मक्खियों के साथ दोहराएँ। पुरुषों त्यागें।
  8. संदंश की एक जोड़ी के साथ, (सबसे बड़ा अंडा कक्षों के पास) पीछे अंत में एक अंडाशय पकड़ है, और दूसरे हाथ से सबसे पूर्वकाल अंडा कक्षों (germarium) की एक चुटकी संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। (चित्रा 1 ए)।
  9. धीरे धीरे और लगातार अंडाशय म्यान से बाहर एक ovariole चेन खींच। सभी वांछित अंडा कक्षों अनुसंधान कर रहे हैं जब तक व्यक्तिगत रूप से ovarioles बाहर टुकड़े करना जारी रखेंemoved।
  10. दोहराएँ सभी विच्छेदित अंडाशय के लिए 1.7-1.8 कदम।
  11. एक बार जब पूरा, एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर एक 0.6ml ट्यूब ovarioles हस्तांतरण।
  12. Ovarioles, ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित फिर फिक्सिंग और धुंधला कदम के लिए आगे बढ़ना।

Ovarioles 2. Immunofluorescent (यदि) धुंधला

  1. ध्यान से एक विंदुक के साथ ovarioles से विच्छेदन मीडिया को हटा दें। किसी भी ovarioles या अंडा कक्षों को हटाने के लिए नहीं भूलें। Ovarioles और विच्छेदन मीडिया के लगभग 50 μl छोड़ दें।
  2. एक ट्यूब में 0.1 एम केपीओ 4 बफर के 150 μl के लिए 16% paraformaldehyde के 50 μl जोड़ें, और उन्हें ठीक करने के लिए अंडा कक्षों का हल जोड़ें। 10 मिनट के लिए कमाल की है, जबकि सेते हैं। चेतावनी: paraformaldehyde के विषैला होता है।
  3. लगानेवाला निकालें और 0.5 मिलीलीटर NP40 धोने बफर के साथ दो बार कुल्ला।
  4. आरटी पर 15 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धोएं।
  5. बाद के चरणों के लिए मानक कि प्रोटोकॉल 15 का संदर्भ लें।
    1. संक्षेप में, निर्धारण के बाद, जोड़उपयुक्त dilutions पर प्राथमिक एंटीबॉडी और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं। (: 200 dilutions 1) तो माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने, NP40 में कई बार धोएं।
    2. NP40 में कई बार धोएं, तो DAPI (1: 1000) जोड़ने के 10 मिनट के लिए, तो washes दोहराएँ। प्रोटोकॉल पूरा हो गया है एक बार अगर, अंडा कक्षों के लिए पीबीएस में 50% ग्लिसरॉल के 200 μl जोड़ने के लिए और दो घंटे के लिए आरटी पर बैठते हैं।
    3. , समाधान निकालें पीबीएस में 70% ग्लिसरॉल के साथ की जगह है, और पन्नी के साथ कवर किया। बढ़ते के लिए तैयार है जब तक 4 ᵒC पर नमूना रखें। इस बीच, चरण 3 के साथ जारी है।

ग्लिसरीन जेली स्लाइड्स 3. अग्रिम तैयारी

  1. जेली ग्लिसरीन एक रंग का उपयोग करने के लिए कम से कम 4 मिलीलीटर उपाय और आधे रास्ते चिह्नित करने के लिए एक गिलास सेल संस्कृति ट्यूब भरना। 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ग्लिसरीन जेली पिघला।
  2. दो खुर्दबीन स्लाइड पर शेयर समाधान से ग्लिसरॉल की एक छोटी सी बूंद, लगभग 300 μl, डालो। एक ऊतक का उपयोग करना, एक पतली ला में ग्लिसरॉल फैलyer के स्लाइड्स में से प्रत्येक के पार। यह एक आधार प्रदान करता है और कदम 5.6 पर ग्लिसरीन जेली की आसान हटाने के लिए अनुमति देता है।
  3. एक फ़िल्टर 1000 μl विंदुक टिप के बंद टिप कट। इस्तेमाल की कटौती विंदुक टिप धीरे धीरे प्रत्येक खुर्दबीन स्लाइड करने के लिए गर्म ग्लिसरीन जेली के 1,000-1,500 μl हस्तांतरण करने के लिए। बुलबुले को रोकने के लिए ध्यान रखना।
  4. ग्लिसरीन जेली स्लाइड सेट करने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए बैठते हैं।
  5. 60 मिमी × 15 मिमी पेट्री डिश में प्रत्येक ग्लिसरीन जेली स्लाइड प्लेस और प्लास्टिक की चादर के साथ कवर किया। 4 डिग्री सीओ / एन में जगह। वैकल्पिक रूप से, दुकान 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 5 दिनों के लिए जेली स्लाइड ग्लिसरीन।

4. अंडे मंडलों बढ़ते

  1. 2.5 कदम, एक ग्लिसरीन जेली स्लाइड भर में 70% ग्लिसरॉल में अंडा कक्षों के पिपेट कई 3 μl बूंदों से नमूने का उपयोग। सभी अंडे कक्षों इस स्लाइड पर कर रहे हैं जब तक pipetting के तीन μl बूँदें जारी रखें। प्रत्येक बूंद कम से कम दस अंडा कक्षों में शामिल है सुनिश्चित करें। इस बीच, एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ग्लिसरीन जेली की संस्कृति ट्यूब हीट।
  2. एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे अंडा कक्षों के साथ ग्लिसरीन जेली स्लाइड रखें। अंडा कक्षों की केवल एक बूंद को देखने के क्षेत्र (चित्रा 1 बी) में है कि इतनी बढ़ाई समायोजित करें।
  3. वांछित चरण अंडा चैम्बर लेने, एक चम्मच के रूप में एक 30 गेज सुई का उपयोग। जब एक चाकू के रूप में सुई का उपयोग कर एक ovariole श्रृंखला से आवश्यक, अलग वांछित अंडा कक्षों।
  4. इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि मलबे से बचने के लिए छोड़ दिया है (चित्रा 1E -1) का सामना करना पड़ पूर्वकाल के साथ, दूसरा ग्लिसरीन जेली स्लाइड करने के लिए अंडे चैम्बर हस्तांतरण। कम से कम सात अंडा कक्षों के एक कॉलम (चित्रा 1C) में लाइन में खड़ा कर रहे हैं जब तक दोहराएँ।
  5. सभी वांछित अंडा कक्षों दूसरा ग्लिसरीन जेली स्लाइड करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं जब तक सात के नए स्तंभ के रूप में।
  6. ऊतक और मोड़ का एक छोटा सा टुकड़ा फाड़। हल्के से हर एक को छूकर अंडा कक्षों से अतिरिक्त पीबीएस ग्लिसरॉल अवशोषित करने के लिए इसका प्रयोग करें। अंडा कक्षों को दूर नहीं करने के लिए ध्यान रखना।
  7. कट जानाएक फ़िल्टर 200 μl विंदुक टिप टिप। अंडा कक्षों के सभी स्तंभों को कवर करने के लिए जेली ग्लिसरीन के 150 μl हस्तांतरण करने के लिए इसका प्रयोग करें।
    नोट: कॉलम कवर की जरूरत ग्लिसरीन जेली की राशि अंडा चैम्बर चरणों और स्तंभों की संख्या पर आधारित है। राशि समायोजित किया जा सकता है।
  8. ग्लिसरीन जेली के ऊपर परत पूरी तरह से (चित्रा -1) जम जाता है जब तक घुड़सवार अंडा कक्षों आरटी पर 5 मिनट के लिए बैठते हैं।
  9. प्लेस एक 60 मिमी × 15 मिमी पेट्री डिश में रखा अंडा कक्षों की स्लाइड और प्लास्टिक की चादर के साथ कवर किया। 4 डिग्री सीओ / एन पर स्टोर (photobleaching के बारे में चिंता है कि अगर वहाँ अंधेरे में जगह) ग्लिसरीन जेली परतों को एक साथ दृढ़ करने की अनुमति देने के लिए।

इमेजिंग के लिए अंडे मंडलों के 5. तैयारी

  1. एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे घुड़सवार अंडा कक्षों की स्लाइड रखें। अंडा कक्षों का केवल एक स्तंभ देखने के क्षेत्र में है कि इतनी बढ़ाई समायोजित करें।
  2. एक 45 डिग्री के कोण लघु स्केलपेल का उपयोग करना, एक straig कटौती(अंडा कक्षों के पीछे पक्ष के करीब) अंडा कक्षों के पहले स्तंभ के दाईं ओर के साथ एचटी लाइन। (चित्रा -1-ई)
  3. अगला, कॉलम में पिछले अंडा चैम्बर शीर्ष पर प्रथम अंडा कक्ष के ऊपर और नीचे में कटौती। इस बिंदु पर अंडा कक्षों के स्तंभ तीन तरफ से कटौती की जानी चाहिए।
  4. अंडा कक्षों (चित्रा 1E -3) के पूर्वकाल ओर करने के लिए संभव के रूप में करीब एक microknife, स्तंभ के बाईं ओर के साथ टुकड़ा, का उपयोग करना।
  5. कटौती स्तंभ पर ठंडा 1X पीबीटी के 100 μl पिपेट।
  6. स्लाइड पर आराम छोड़कर, अंडा कक्षों और त्यागने की कटौती स्तंभ के तीन पक्षों के आसपास अतिरिक्त ग्लिसरीन जेली दूर करने के लिए एक दौर धार रंग का प्रयोग करें।
  7. अंडा कक्षों के पूर्वकाल पक्ष में किए गए कटौती में रंग डालें और प्राथमिक ग्लिसरीन जेली ब्लॉक से स्तंभ अलग।
  8. नमूने के लिए या तो उल्टे (5.8.1) या ईमानदार (5.8.2) माइक्रोस्कोपी तैयार करें।
    1. उलटा माइक्रोस्कोप के लिए: स्थानांतरण टीअंडा कक्षों के पूर्वकाल नीचे की ओर का सामना करना पड़ के साथ एक coverslip के लिए अंडा कक्षों की वह कॉलम। ग्लिसरीन जेली के सभी स्तंभों को हटा दिया है और घुड़सवार किया गया है जब तक दोहराएँ 5.2-5.8 कदम। बाहर सुखाने से उन्हें रोकने के लिए अंडा कक्षों में से प्रत्येक ब्लॉक पर 50% पीबीएस ग्लिसरॉल की बूंदों की एक जोड़ी जोड़ें। सीधे coverslip पर छवि अंडा कक्षों।
    2. ईमानदार माइक्रोस्कोप के लिए: पूर्वकाल पक्ष का सामना करना पड़ के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड पर अंडा कक्षों के स्तंभ स्थानांतरण। ग्लिसरीन जेली के सभी स्तंभों को हटा दिया है और खुर्दबीन स्लाइड पर मुहिम शुरू की गई है जब तक दोहराएँ 5.2-5.9 कदम। एक # 1 आधा coverslip के साथ अंडा कक्षों और कवर ब्लॉकों में से प्रत्येक ब्लॉक पर 50% पीबीएस ग्लिसरॉल की बूंदों की एक जोड़ी जोड़ें।

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Representative Results

ईमानदार इमेजिंग विधि हमें चरण 8. पर पूर्वकाल कूपिक उपकला में कोशिकाओं के सीधे संगठन को देखने के लिए अनुमति दी एक कूप सेल भाग्य के लिए सामान्य मार्कर, आंखें अनुपस्थित (EYA) प्रोटीन, साथ ही परमाणु डीएनए मार्कर DAPI के, यहां तक ​​कि अभिव्यक्ति दिखाया कोशिकाओं के इस क्षेत्र भर में, और सभी कोशिकाओं समान धुंधला तीव्रता (चित्रा 2 बी ") के साथ देखा जा सकता है कि प्रदर्शन किया। साइटोकाइन युपीडी के जवाब में विनियमित प्रोटीन, हालांकि, चर पैटर्न और अभिव्यक्ति के स्तर से पता चला है। ध्रुवीय कोशिकाओं अंडा विकास 16,17 के इस चरण के लिए apically पूर्व युपीडी जारी है, इसलिए हम स्टेट कभी कभी मामला था जो ध्रुवीय कोशिकाओं, के बारे में त्रिज्यात सक्रिय होने की उम्मीद। अक्सर, हालांकि, हम SLBO सहित स्टेट के बहाव के लक्ष्य, कि मनाया अधिक जटिल अभिव्यक्ति पैटर्न था। उदाहरण के लिए, SLBO अभिव्यक्ति के लिए GFP संवाददाता, लेकिन सभी नहीं, अधिकांश में ध्रुवीय कोशिकाओं घिरा हुआ है कि कोशिकाओं (चित्रा 2B दिखाई दिया, और मान देखनाआईएनजी ईटी की समीक्षा के तहत अल)। हम आसंजन में बदलाव को प्रतिबिंबित कर सकते हैं जो ई cadherin अभिव्यक्ति / स्थानीयकरण (चित्रा 2B ') में मामूली अंतर, देखा है, लेकिन अधिक काम यों और इस परिणाम की व्याख्या करने की जरूरत होगी। इन बारीकियों का मंचन अंडा कक्षों के पार्श्व तीन आयामी पुनर्निर्माण (चित्रा -2 डी) के माध्यम से पता लगाने योग्य नहीं थे। कूप कोशिकाओं के शिखर-बेसल अक्ष में मतभेद भी ईमानदार विधि का उपयोग प्रतिष्ठित किया जा सकता है। हम प्लाज्मा झिल्ली 18 (चित्रा 3 ए) के शिखर क्षेत्र में मौजूद है जो अंगूठी नहर प्रोटीन Visgun (VSG), के लिए एक पत्रकार लाइन का इस्तेमाल किया। ईमानदार इमेजिंग की पुष्टि की VSG अभिव्यक्ति ध्रुवीय कोशिकाओं (3B चित्रा) के सबसेसंकरेमें हिस्सा निकट, कूप कोशिकाओं के शिखर भाग में पाया गया था।

हम भी ईमानदार इमेजिंग विधि चरण 9 अंडा कक्षों में पूर्वकाल उपकला देखने के लिए अच्छी तरह से काम करता है कि मिल गया है। इस गतिविधियों परopmental मंच, सीमा कोशिकाओं ध्रुवीय कोशिकाओं (चित्रा -4 ए) के चारों ओर एक साथ संगठित होना। हम अंत पर इमेजिंग (चित्रा 4 बी-सी) का उपयोग कर इन जमा समूहों का निरीक्षण कर सकता। Slbo -GFP के रूप में अच्छी तरह से सक्रिय है, परमाणु स्टेट गतिशील सीमा कोशिकाओं (चित्रा 4B और 4C) के रूप में चिह्नित है, जबकि 8 स्टेज में रूप में, हम सब उपकला कोशिकाओं () नहीं दिखाया में EYA अभिव्यक्ति के समान स्तर पाया। FAS3 प्रोटीन का स्थानीयकरण ध्रुवीय सेल-ध्रुवीय सेल इंटरफेस (4B चित्रा) संकेत दिया। DAPI या इस विधि को भी रोगाणु लाइन कोशिकाओं या रोगाणु सेल के अध्ययन में उपयोगी होगा जो पता चलता है कॉर्टिकल एक्टिन () नहीं दिखाया, के phalloidin-धुंधला द्वारा संकेत के रूप में इसके अलावा, दोनों चरणों के 8 और 9 में हम बड़े नर्स कोशिकाओं को देख सकता था -follicle सेल बातचीत।

चित्र 1
ड्रोसोफिला अंडे चैंबर के चित्रा 1. ईमानदार बढ़तेएस। (ए) ड्रोसोफिला अंडाशय अंडा कक्ष, म्यान, और ovariole का संकेत है। चित्रण अंडाशय म्यान से धीरे-धीरे ovariole खींच लिए संदंश की स्थिति को दिखाता है। इनसेट विच्छेदन के लिए उड़ान भरने की स्थिति को दर्शाता है। महिला मक्खी के उदर पक्ष ऊपर की ओर चेहरे। एक-पूर्वकाल, पी-पीछे। अंडा कक्षों के बढ़ते (बी) प्रक्रिया। (बी) 70% ग्लिसरॉल-पीबीएस में अंडा कक्षों की एक छोटी सी बूंद, एक विच्छेदन stereomicroscope के तहत देखा। पीले तीर एक ovariole श्रृंखला इंगित करता है; पीले रंग की नोक एक व्यक्ति अंडा कक्ष को इंगित करता है। लाल तीर ग्लिसरॉल पीबीएस बूंद के किनारे इंगित करता है। जम ग्लिसरीन जेली की पतली परत पर व्यवस्था अंडा कक्षों के (सी) कॉलम। पीला Arrowhead एक व्यक्ति अंडा कक्ष को इंगित करता है। (डी) पिघल ग्लिसरीन जेली का एक दूसरा पतली परत उन्हें एम्बेड करने के लिए अंडा चैम्बर स्तंभों को शामिल किया गया। कटौती 4ᵒC में हे / एन ऊष्मायन के बाद किया जाना चाहिए जहां पीला बिंदीदार रेखा इंगित करता है। लाल तीर को इंगित करता हैग्लिसरीन जेली की दूसरी परत के किनारे। लाल संख्या अंडा चैम्बर कॉलम (क्षैतिज ऊपर और नीचे में कटौती नहीं दिखाया जाता है) को काटने के आदेश संकेत मिलता है। पूर्वकाल छोड़ दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
एक प्रारंभिक चरण 8 अंडे चैंबर के पूर्वकाल उपकला 2. इमेजिंग चित्रा। (ए) के एक चरण 8 धीमी गति सीमा कोशिकाओं (slbo) जीन संवाददाता अंडा चैंबर के पार्श्व दृश्य: DAPI और GFP> संकेत के रूप में या slbo के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग (जीनोटाइप slbo -Gal4, यूएएस mCD8 GFP) 19,20,। वर्मी (एआरएम) β-catenin की मक्खी Homolog है। पूर्वकाल (ए) सही करने के लिए छोड़ दिया, पीछे (पी) के लिए है। (बी ") एक अंडा चा के विचारों के अंत परmber। संकेत के रूप में एक चरण में 8 slbo- जीन संवाददाता अंडा चैंबर के जेड ढेर छवियों के तीन आयामी पुनर्निर्माण ईमानदार, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग मुहिम शुरू की। मैजेंटा तारक ध्रुवीय कोशिकाओं से संकेत मिलता है। DAPI के नाभिक के निशान। (बी ') slbo> GFP के केवल प्रकल्पित सीमा कोशिकाओं (SLBO) में व्यक्त किया है। ई cadherin (ई-सीएडी) की सीमा कोशिकाओं में झिल्ली के लिए स्थानीय और समृद्ध एक आसंजन अणु है। (बी '') आंखें अनुपस्थित (EYA) समान रूप से ध्रुवीय कोशिकाओं को छोड़कर सभी कूप कोशिकाओं के नाभिक में व्यक्त पाया जाता है। (सी) स्टैंडर्ड पार्श्व GFP के खिलाफ DAPI (नीला) और एंटीबॉडी (SLBO, हरा), एआरएम (लाल) के साथ दाग एक slbo -reporter चरण 8 अंडे चैंबर के देखने के लिए, और FAS3 (सफेद)। इनसेट कुल्हाड़ियों से पता चलता है: एक्स अक्ष (हरा तीर) के नीचे है, वाई अक्ष बाएँ (लाल तीर) की ओर है, और जेड अक्ष दर्शक (नीला) की ओर है (डी) नई तकनीक की तुलना के लिए। , इस पैनल के एक छोर पर-व्यू बनाने की प्रक्रिया से पता चलता हैसी इनसेट में दिखाया गया अंडा चैंबर के पार्श्व छवियों का एक z ढेर का उपयोग कर, Volocity सॉफ्टवेयर के साथ कार्रवाई की एक तीन आयामी पुनर्निर्माण, द्वारा टेड कर दिया कुल्हाड़ियों से पता चलता है: एक्स अक्ष नीचे है (हरा तीर), जेड अक्ष है अब बाएं (नीले तीर), और वाई अक्ष की दिशा में दर्शक (लाल) की ओर है। व्यक्ति की कोशिकाओं जेड अक्ष में कम संकल्प के कारण धुंधला कर रहे हैं; इस प्रकार, बी में दिखाया नए दृष्टिकोण एक महत्वपूर्ण इमेजिंग सुधार का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. एक चरण 8 अंडे चैंबर के कूपिक उपकला के पार्श्व और पूर्वकाल डोमेन में प्रोटीन अभिव्यक्ति मुकाबले। (ए) visgun (VSG) के एक चरण 8 अंडे चैम्बर -GFP रिपोर्टर के पार्श्व दृश्य के पुनर्निर्माण <समर्थन> 21-23, GFP या एआरएम (सफेद) के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के लिए दाग। DAPI के नीले रंग में नाभिक के निशान, और बड़े नर्स सेल नाभिक स्पष्ट कर रहे हैं। VSG कूप कोशिकाओं की अंगूठी नहरों (हरा) के लिए localizes। (बी बी ') अंत पर एक चरण 8 VSG-GFP संवाददाता अंडा चैंबर के चित्रों के एक z ढेर का एक अंडा chamber.Three आयामी पुनर्निर्माण के विचारों के साथ दाग प्राथमिक एंटीबॉडी संकेत के रूप में। SLBO प्रोटीन (लाल) ध्रुवीय और सीमा सेल नाभिक दोनों में पाया जाता है। एआरएम कूप कोशिका झिल्ली के निशान और सीमा कोशिकाओं में समृद्ध है; DAPI के नाभिक लेबल करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
प्रारंभिक चरण 9 अंडा कक्षों के 4. इमेजिंग चित्रा। (ए) के एक प्रारंभिक चरण 9 SL के पार्श्व दृश्यबो -reporter अंडा चैंबर। बॉर्डर कोशिकाओं (हरा) पूर्वकाल उपकला (सफेद तीर) के भीतर क्लस्टर है। ईसा पूर्व) के अंत पर अंडा कक्षों के विचार। एक प्रारंभिक चरण 9 slbo- जीन संवाददाता अंडा कक्ष से छवियों का एक z ढेर के तीन आयामी पुनर्निर्माण, संकेत दिया है या GFP के रूप में प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग दाग। (बी) slbo> GFP (हरा) की सीमा कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है , Fasciclin 3 (FAS3, सफेद) दो ध्रुवीय कोशिकाओं के बीच झिल्ली को अत्यधिक localizes जबकि; DAPI के नाभिक (नीला) के निशान। मैजेंटा तारक ध्रुवीय कोशिकाओं से संकेत मिलता है। (सी) ई cadherin (ई-सीएडी) कूप कोशिकाओं की झिल्लियों के निशान, और DAPI नाभिक को इंगित करता है, जबकि दोनों परमाणु (सक्रिय) स्टेट और slbo> GFP अभिव्यक्ति, केवल सीमा कोशिकाओं में पाए जाते हैं। मैजेंटा तारक ध्रुवीय कोशिकाओं से संकेत मिलता है। धुंधला परिणाम अलग-अलग slbo के लिए दिखाए जाते हैं> GFP (सी ') और स्टेट (सी' ') यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ हम एक छोर पर नजरिए से अंडा कक्षों के विकास, माउंट करने के लिए एक विधि का वर्णन है और छवि छोटा है। इमेजिंग अंडा कक्षों के लिए आम तकनीकों पार्श्व विचारों के लिए अनुकूलित और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग जब मुख्य रूप से Medio-पार्श्व कूप कोशिकाओं के सटीक दृश्य की अनुमति कर रहे हैं। कई फोकल विमानों को देखने में जेड के ढेर या 3-डी पुनर्निर्माण एड्स का उपयोग करते हैं, लेकिन अभी भी अण्डाकार अंडा कक्षों (चित्रा 2 डी) के डंडे के उप सेलुलर संकल्प के लिए अपर्याप्त है। इस तरह के सुपर संकल्प इमेजिंग के रूप में नवीनतम तकनीक माइक्रोस्कोपी के साथ आंशिक रूप से दूर किया जा सकता है, इन तरीकों में महंगा है और हमेशा उपलब्ध नहीं हैं। ड्रोसोफिला 24,25 बहुत छोटे अंडे कक्षों के लिए प्रयोग की जाने वाली भ्रूण के लिए हम ईमानदार इमेजिंग प्रोटोकॉल ढाल लिया है। भ्रूण की तुलना में अंडा कक्षों के बहुत छोटे आकार के लिए खाते में विधि में कई महत्वपूर्ण संशोधनों रहे हैं। वर्णित तकनीक के एक प्रमुख घटक भौतिक separ हैभ्रूण की आवश्यकता नहीं है, जो अलग-अलग कक्षों, का समझना। एक और परिवर्तन (4.4) बढ़ते दौरान एक दूसरे ग्लिसरीन जेली स्लाइड का इस्तेमाल होता है। अंडा कक्षों के आकार और अन्य अंडा कक्षों को डंठल कोशिकाओं के माध्यम से अपने लगाव सुई के साथ हेरफेर की आवश्यकता है और ग्लिसरीन जेली का विनाश होता है। इसलिए, अंडा कक्षों (4.5) बढ़ते के लिए एक नया ग्लिसरीन जेली स्लाइड करने के लिए एक सुई के साथ स्थानांतरित किया जाना चाहिए। ईमानदार इमेजिंग अंडा विकास के दौरान ऊतक संगठन के बारे में नई जानकारी का खुलासा, पार्श्व या क्षैतिज विचारों से धुंधला क्षेत्रों के दृश्य के लिए अनुमति देता है। इस patterning घटनाओं पर नए अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया है, और हम इस विधि oogenesis के अतिरिक्त पहलुओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रस्ताव।

हम सफल ईमानदार बढ़ते में कई महत्वपूर्ण कदम निर्धारित किया है। हम जानते हैं कि यह आवश्यक विच्छेदन के दौरान म्यान से पूरी तरह से ovariole जंजीरों को दूर करने के लिए है, और इच्छित अंडा कक्षों ovariol से कटौती की जानी चाहिए पायाई श्रृंखला। Ovariole से मुक्त अंडा कक्षों करने में विफलता यह मुश्किल सही मंच अंडा कक्ष (4.3 चरण) लेने के लिए बनाता है। हम ट्यूबों में यह aliquoting द्वारा एक समय में ग्लिसरीन जेली की छोटी मात्रा के साथ काम करने की सलाह देते हैं। दोहराया हीटिंग इसकी निरंतरता परिवर्तन और ठीक से (3.1) solidifying से रोकता है क्योंकि दो बार की तुलना में जेली अधिक ग्लिसरीन गर्मी नहीं है। Pipettors में जेली aspirating को रोकने के लिए फिल्टर युक्तियों का उपयोग करें। ग्लिसरीन जेली 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 8 घंटे के लिए खुर्दबीन स्लाइड पर जमना करने की अनुमति दें। इस कदम को छोटा करने के लिए मुश्किल अंडा कक्षों (3.6) बढ़ते बनाता है। यह मुहिम शुरू की अंडा कक्षों (4.6) से सभी पीबीएस ग्लिसरॉल अवशोषित करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। बहुत अधिक तरल मौजूद है, तो यह नीचे का पालन करने से ग्लिसरीन जेली के ऊपर परत को रोकता है। इस मामले में, अंडा कक्षों तैरने लगते हैं और स्थिति बदल सकती है। सबसे अच्छा इमेजिंग परिणामों के लिए, जेली ब्लॉक ग्लिसरीन के रूप में शारीरिक रूप से संभव अंडा कक्षों के पूर्वकाल पक्ष (5.4) के करीब के रूप में कटौती की जानी चाहिए। इस पर बहुत ज्यादा ग्लिसरीन जेलीपक्ष की वजह से नमूना और coverslip के बीच वृद्धि की दूरी के लिए छवि गुणवत्ता घट जाती है।

ग्लिसरीन जेली में नमूने के बढ़ते कुछ निरंतर कर रहे हैं। एक के लिए, यह नमूना और उद्देश्य के बीच की दूरी बढ़ जाती है। उच्च वृद्धि पर यह दूरी, एक तेल उद्देश्य का उपयोग विशेष रूप से है, जबकि गरीब छवि गुणवत्ता में परिणाम कर सकते हैं जो नमूना, पर ध्यान केंद्रित करने में कठिनाई पैदा कर सकते हैं। यह देखते हुए, यह अंडा कक्षों के बहुत करीब ग्लिसरीन जेली ब्लॉक बाहर उत्कीर्ण करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। ग्लिसरीन जेली ऑप्टिकली स्पष्ट है, यह कुछ प्रकाश defract करता है। एक और सीमा एंटीबॉडी संकेत की वजह से काम कर रहे उद्देश्य की दूरी और ग्लिसरीन जेली की मोटाई का एक संयोजन को कम किया जा सकता है। एंटीबॉडी प्राथमिक और / या माध्यमिक दोनों की एकाग्रता के लिए एक वृद्धि कभी कभी इस समस्या को कम करने में सहायता कर सकते हैं। यह एंटीबॉडी से भिन्न होता है, हम आम तौर पर माध्यमिक चींटी की दोहरी एकाग्रता का उपयोग करके बेहतर छवियों का अधिग्रहणईमानदार इमेजिंग में ibody मानक पार्श्व इमेजिंग में इस्तेमाल राशि की तुलना में। हम ईमानदार अंडा कक्षों के बढ़ते के लिए जेली ग्लिसरीन के लिए कोई विकल्प के बारे में पता। ऐसे agarose और polyacrylamide रूप में अन्य सामग्री की कोशिश कर रहे थे, लेकिन सभी इमेजिंग जबकि स्पष्टता का एक नुकसान हो रहा है, और अधिक गंभीर रूप से प्रकाश defracted। इस प्रकार, इस बढ़ते तकनीक मानक माइक्रोस्कोपी के साथ प्रयोग के लिए वर्तमान में उपलब्ध है कि सबसे अच्छा है।

हम सीमा सेल विनिर्देश और गतिशीलता की दीक्षा के चरणों पर ध्यान केंद्रित किया, वहीं विभिन्न चरणों का अंडा कक्षों केवल कुछ मामूली समायोजन के साथ इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, सुई का गेज अलग अलग आकार और विकास के चरणों का अंडा कक्षों में हेरफेर करने के लिए बदला जा सकता है। चरणों में 7-10 के लिए, एक 30 जी सुई अंडा कक्षों के उठाव में आसानी से फिट अच्छी तरह से काम करता है क्योंकि। पहले चरण अंडा कक्षों के लिए एक बड़ा गेज सुई (छोटे उठाव) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए और इसी तरह एक छोटे गेज (बड़ा उठाव) बाद में अनुसूचित जनजाति के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएवृद्ध अंडा कक्षों। एक पुराने विकास के चरण में कुछ भी इस गेज (4.3) के लिए बहुत बड़ी होगी। इसके अलावा अंडा चैंबर के किसी भी पक्ष उद्देश्य के प्रति रुचि के क्षेत्र के साथ अंडा कक्षों के ग्लिसरीन जेली ब्लॉक की व्यवस्था से इस तकनीक का उपयोग imaged किया जा सकता है।

ग्लिसरीन जेली में समर्थित छोटे नमूनों बढ़ते कई संदर्भों में उपयोगी होने की संभावना है। यह रणनीति है कि यह सिर्फ एक नजरिए से नमूनों की जांच करने के लिए अपर्याप्त होगा, खासकर जब अन्य जीवों से छोटे, फिक्स्ड ऊतकों के विभिन्न प्रकार कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तकनीक में महारत हासिल है, एक बार यह अंडा कक्षों जेली में तैनात रहे हैं पर निर्भर करता है, किसी भी वांछित कोण पर अंडे कक्षों देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि सेलुलर संगठन का एक बेहतर तीन आयामी समझ बनाने अद्वितीय विचार के लिए अनुमति देता है। Immunofluorescent एंटीबॉडी धुंधला के साथ संयोजन के रूप में अंडा कक्षों के ईमानदार इमेजिंग प्रोटीन का सटीक पता लगाने के लिए अनुमति देता हैमानक बढ़ते शर्तों के तहत संभव नहीं होगा कि एस और सेल सेल संपर्क। हम उपकला से सीमा सेल क्लस्टर के संघीकरण और सेना की टुकड़ी की अनुमति है कि सेल सेल बातचीत मानचित्रण में इस विधि का उपयोग करने की योजना है। इस समय, ईमानदार इमेजिंग तकनीक लाइव नमूनों के साथ प्रयोग नहीं किया जा सकता है, लेकिन हम भी इस बाधा को दूर करने के लिए काम कर रहे हैं। हम इस पद्धति का भी ड्रोसोफिला oogenesis के अन्य पहलुओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जाएगा आशा करते हैं, या नया कोण पर छवि अन्य छोटे ऊतकों को अनुकूलित किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C.
16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 methanol-free to preserve GFP fluorescence
30G x 1/2 inch needle  VWR BD305106 Regular bevel
Active Dry Yeast Genesee Scientific 62-103 To fatten female flies
Bovine Serum Albumin PAA-cell culture company A15-701 Used in NP40 Wash Buffer
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10 Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma Aldrich D9542 5 mg/ml stock solution  
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071 Added to supplement dissection medium (10%) 
Glass culture tube VWR 47729-576 14 ml
Glass Depression Slides VWR 470019-020 1.2 mm Thick, Double Cavity
Glycerin Jelly  Electron Microsocpy Sciences 17998-10 Mounting media
Glycerol IBI Scientific IB15760 70% in PBS
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I3021-500ML (interchangable for Nonidet P-40)  Used in NP40 Wash Buffer 
Leica Fluorescent Stereoscope  Leica Microsystems
Leica SP5 Confocal Microscope Leica Microsystems 40x/0.55NA dry objective 
Micro spatula  VWR 82027-518 Stainless steel
Microscope Slide VWR 16004-368 75x25x1 mm
NP40 Wash Buffer 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide
Penicillin-Streptomycin-Glutamine Life Technologies 10378-016 Added to supplement dissection medium (0.6X)
Petridish- Polysterine, sterile VWR 82050-548 60 W x 15 H mm
Phosphate Buffer Saline Sigma Aldrich P3813-10PAK 10 packs of Powder
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786-500G Used in 0.1 M KPO4 Buffer 
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P9791-500G Used in 0.1 M KPO4 Buffer 
Name Company Catalog Number Comments
Schneider’s Insect Medium Life Technologies
11720018		 With L-glutamine and sodium bicarbonate
Sodium azide Sigma Aldrich S2002-25G Used in fluorescent antibody staining
Sodium chloride Sigma Aldrich S3014-500G Used in NP40 Wash Buffer
TRIS-HCl IBI Scientific IB70144 1 M TRIS-HCl, pH 7.4
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer For processing confocal Z-stacks

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 97, Oogenesis कूप कोशिकाओं विकास इमेजिंग confocal माइक्रोस्कोपी इम्यूनोफ्लोरेसेंस
की ईमानदार इमेजिंग<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; अंडे मंडलों
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Manning, L., Starz-Gaiano, M.… More

Manning, L., Starz-Gaiano, M. Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers. J. Vis. Exp. (97), e52636, doi:10.3791/52636 (2015).

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