Introduction
Studie av Drosophila melanogaster har gitt stor innsikt i den genetiske regulering av et bredt spekter av fenomener. Spesielt har det vært omfattende forskning på egg utvikling, fordi oogenesen gir en medgjørlig måte å undersøke mange ulike utviklingsprosesser, inkludert vev mønster, celle polaritetsskift, cellesyklus switching, og translasjonsforskning regulering 1,2,3,4. En viktig morphogenic hendelse i løpet oogenesen er spesifikasjonen, oppkjøp av motorisk uro og migrasjon av et sett med celler som kalles grenseceller (anmeldt i 5). Siden cellemigrasjon er en viktig funksjon i dyr morphogenesis, og fordi den genetiske reguleringen av denne prosessen er godt bevart, mekanismer fastsatt i fluer er sannsynlig å være viktig i andre sammenhenger. Dermed er vi undersøker den molekylære kontroll av grensen celle migrasjon. For våre studier, har vi utviklet en ny metode for å observere de fremre stolper for å utvikle egg,hvor grenseceller oppstår, for å undersøke hvordan de utvikler seg i detalj.
I eggstokken, egg kamre på ulike utviklingsstadier eksisterer sammen kjeder kalt ovarioles, som er innkapslet i en tynn slire (figur 1A). Hvert egg kammeret vil gå på å danne ett egg. Under oogenesen, må flere forskjellige celletyper utvikle seg på en koordinert måte. D. melanogaster egg kammeret består av 16 bakterie linjer celler, inkludert en eggcelle, omgitt av en ettlags follicular epitel 6. Et lite antall spesialiserte celler, kalles polare celler, oppstår på fremre og bakre polene på epitel. De 6-8 grensecellene stammer i fremre epitelet av egget kammeret, indusert av de polare celler 5,7. I midten av oogenesen (stadium 9), grense cellene løsner fra sine naboer og migrere mellom sykepleier cellene å nå eggcelle ved bakre av egget kammer 5,7. Denne bevegelsen må oppfyllesmens grense celler forblir i en klynge rundt to ikke-bevegelige polare celler, noe som gjør dette til en slags kollektiv celle migrasjon. Vellykket migrering av grensecelleklase sikrer riktig utvikling av micropyle av eggeskallet, som er nødvendig for befruktning.
Fremre polare celler instruere grensen celle skjebne ved å aktivere en signaltransduksjon kaskade. Polare celler utskiller et cytokin, Uparet (UPD), som binder til et transmembran reseptor, Domeless (DOME), på nabo hårsekkceller i trinn 8 av oocytt utvikling 8,9. Bindingen av UPD fører Janus tyrosin kinase (JAK) til phosphorylate Signal Svinger og Activator av transkripsjon (STAT) 8,10,11. STAT beveger seg deretter til kjernen for å aktivere transkripsjon. Langsomme Border Cells (SLBO) er en transkripsjonsfaktor som er en direkte transcriptional mål av STAT og er også nødvendig for grensen celle migrasjon 12. Sideutsikt over egg kamre indikere tlue STAT aktivitet er regulert i en gradient over fremre epitel 8,11,13. Hårsekkceller nærmest polar celler har de høyeste nivåene av aktivert STAT, og dermed blir de grense celler og invadere nabo bakterie-linje vev.
For å forstå hvordan grensecellene er spesifisert innenfor og løsner fra epitel, må vi observere hvordan vevet er organisert. Hvis vi ser på egg kamre fra en anterior-on perspektiv, ville vi forvente radial symmetri av STAT aktivitet i hårsekken celler som omgir de polare celler. Et enderiss ville også mer nøyaktig vise forskjeller i membranproteiner og celle-celle grensesnitt før og under løsgjøring enn å sammenligne celler i forskjellige fokalplan. Fordi egg kamre er avlange og er festet til hverandre ved hjelp av stengel-celler, de slå seg på objektglass i sideretningen, noe som gjør det vanskelig å observere den fremre arkitektur. Således har mye informasjon om cellene ved polene av egg kammeretblitt utledes fra sidevisninger. Selv om noen informasjon kan fås gjennom algoritmisk 3-D rekonstruksjoner av optiske seksjoner, lysspredning, fotobleking, og dårligere grensene for oppløsning i Z-aksen gjøre denne informasjonen mindre detaljert og pålitelig i fravær av dyre teknikker som super-oppløsning mikros 14 . Andre typer seksjon baserte avbildnings (for eksempel elektronmikroskopi eller mikrotom snitte) krever omfattende manipulering av vev, blant annet dehydrering, øker sannsynligheten for gjenstander. Dermed utviklet vi en ny metode for å image D. melanogaster egg kamre mens oppreist. Denne metoden har allerede vist seg nyttig i å belyse hvordan bevegelige celler er skjebne (se Representative resultater og Manning et al, under vurdering), og vil sannsynligvis være mer bredt verdifull i studier av andre aspekter av oogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Disseksjon av Ovarioles
- Overføre ca femten 2-4 dager gamle kvinnelige fluer og noen få menn til en fersk flue mat hetteglass med ekstra aktiv tørrgjær. Bruke bomull som en plugin for hetteglassene, og tilsett noen dråper vann til bomull for å holde luftfuktigheten høy.
- Plasser flasken i en 25 ° C inkubator i 14-16 timer for å maksimere antallet av trinn 8-10 egg kamre.
MERK: Inkubasjonstid varierer avhengig av temperatur og ønsket scene. - Forberede disseksjon media, 0.1M KPO 4 og NP40 løsninger som trengs for neste dag (se Materials).
- Anesthetize fluene bruker CO 2, og plassere under en disseksjon mikroskop. Pipet flere dråper disseksjon media i hvert hulrom i glasset depresjon lysbilde.
- Hold tang i hver hånd på en ca 30 ° vinkel til bordplaten og orientere ett kvinnelig fly med vingene ned. Med ikke-dominant hånd, plukke opp den kvinnelige bruker pinsett, ta tak henne på ennterior av magen, i nærheten av thorax, og senk henne inn i disseksjon media i depresjon lysbilde (figur 1A innfelt).
- Med den andre pinsett, ta tak i exoskeleton på ventral posterior av magen og pierce gjennom. Grab eggstokkene ved bakre enden, deretter trekke dem ut av magen og plasser i frisk media på den andre siden av depresjon lysbilde. (Figur 1A innfelt). Unngå å trekke fra hverandre tarmen. Kast kadaveret.
- Gjenta med de andre kvinnelige fluer til alle eggstokkene blir dissekert. Kast hannene.
- Med en pinsett, hold en eggstokk på bakre enden (nær de største egg kamre), og med den andre hånden bruke en pinsett til å klemme en av de mest fremre egg kamre (germarium). (Figur 1A).
- Sakte og jevnt, trekker en ovariole kjettingen ut av eggstokken slire. Fortsette å dissekere ut ovarioles individuelt til alle ønskede egg kamre er removed.
- Gjenta trinn 01.07 til 01.08 for alle dissekert eggstokkene.
- Når prosessen er ferdig, overfører ovarioles til en 0,6 ml tube med en plast overføringspipetten.
- La ovarioles bosette til bunnen av røret, og deretter gå videre til feste og flekker trinn.
2. Immunofluorescent (IF) Farging av Ovarioles
- Fjern forsiktig disseksjon media fra ovarioles med en pipette. Pass på ikke å fjerne eventuelle ovarioles eller egg kamre. La ca 50 mL av ovarioles og disseksjon media.
- Legg 50 mL 16% paraformaldehyde til 150 ul 0,1 M KPO fire buffer i et rør, og legge til løsning på egg kamre for å fikse dem. Inkuber mens gynge i 10 min. FORSIKTIG: formaldehydet er giftig.
- Fjern fiksativ og skyll to ganger med 0.5 ml vaskebuffer NP40.
- Vask to ganger i 15 minutter hver ved RT.
- Se standard IF protokoll 15 for etterfølgende trinn.
- Kort, etter fiksering, leggeprimære antistoffer på de riktige fortynninger og ruge O / N ved 4 ° C. Vask i NP40 flere ganger, og deretter legge sekundære antistoffer (1: 200 fortynninger).
- Vask flere ganger i NP40, deretter legge DAPI (1: 1000) for 10 min, deretter gjenta vasker. Når IF protokoll er fullført, tilsett 200 ul av 50% glycerol i PBS til egg kammer og la stå ved romtemperatur i 2 timer.
- Fjern løsning, erstatte den med 70% glyserol i PBS, og dekk med folie. Plasser prøven ved 4 ᵒC til alt er klart til montering. I mellomtiden fortsetter du med trinn 3.
3. Advance Utarbeidelse av glyserin Jelly Slides
- Måle minst 4 ml glyserin gelé med en slikkepott og fylle et glass cellekultur røret til halvveis mark. Smelt glyserin gelé i et vannbad ved 55 ° C i 30 min.
- Hell en liten dråpe av glyserol, ca 300 gl, fra stamløsning på to objektglass. Ved hjelp av en vev, spre glycerol i et tynt layer over hver av lysbilder. Dette gir en base og gir mulighet for enkel fjerning av glyserin gelé i trinn 5.6.
- Skjær tuppen av av en filtrert 1000 mL pipette. Bruk kutt pipettespissen å overføre 1.000-1.500 mL av varm glyserin gelé sakte til hver objektglass. Ta vare å hindre bobler.
- La glyserin gelé lysbilder sitte i 5 min ved RT for å stille.
- Plassere hver glyserin gelé lysbilde i 60 mm × 15 mm petriskål og dekk til med plastfolie. Sted ved 4 ° CO / N. Eventuelt butikken glyserin gelé lysbilder for opp til fem dager ved 4 ° C.
4. Montering Egg Chambers
- Ved hjelp av eksempler fra trinn 2.5, pipette flere 3 pl dråper egg kamre i 70% glyserol over en glyserin gelé lysbilde. Fortsett pipettering 3 pl dråper til alle egg kamre er på dette lysbildet. Sørg for at hver dråpe inneholder minst ti egg kamre. I mellomtiden, oppvarme en kultur rør av glyserin gelé i et 55 ° C vannbad.
- Plasser glyserin gelé lysbilde med egg kamre under et disseksjon mikroskop. Juster forstørrelse, slik at bare en dråpe av egg kamre er i synsfeltet (figur 1B).
- Ved hjelp av en 30 gauge nål som en skje, plukke opp den ønskede scenen egg kammeret. Når det er nødvendig, separate ønskede egg kamre fra en ovariole kjede med nålen som en kniv.
- For å unngå rusk som kan forstyrre med bildebehandling, overføre egg kammeret til den andre glyserin gelé lysbilde, med fremre vendt til venstre (figur 1E -1). Gjenta til det er minst syv egg kamre stilt opp i en kolonne (figur 1C).
- Danne nye kolonner med sju til alle ønskede egg kamre blir overført til andre glyserin gelé lysbilde.
- Riv av et lite stykke vev og vri. Bruk dette til å absorbere overflødig PBS-Glyserol fra egg kamre ved lett berøring hver enkelt. Pass på å ikke fjerne egg kamre.
- Avskårettuppen av en filtrert 200 mL pipette. Bruk denne til å overføre 150 mL av glyserin gelé til å dekke alle kolonner med egg kamre.
MERK: Mengden av glyserin gelé som trengs for å dekke kolonnene er basert på egg kammer scener og antall kolonner. Beløpet kan bli justert. - La montert egg kamre sitte i 5 min ved RT til det øverste laget av glyserin gelé er fullstendig størknet (figur 1D).
- Sted lysbilde av monterte egg kamre i en 60 mm × 15 mm petriskål og dekk til med plastfolie. Oppbevares ved 4 ° CO / N for å tillate glyserin gelé lag for å stivne sammen (sted i mørket hvis det er bekymring om fotobleking).
5. Utarbeidelse av Egg Chambers for Imaging
- Plasser lysbilde av monterte egg kamre under en disseksjon mikroskop. Juster forstørrelse, slik at bare en kolonne av egg kamre er i synsfeltet.
- Ved hjelp av en 45 ° vinkel miniatyr skalpell, kuttet en straight linje langs den høyre side av den første kolonnen av egg kamre (i nærheten av den bakre side av egg kamre). (Figur 1D-E)
- Deretter skjærer over den første egg kammeret ved toppen og under den siste egg kammeret i kolonnen. På dette punktet kolonnen av egg kamre bør kuttes på tre sider.
- Ved hjelp av en microknife, stykke langs den venstre side av kolonnen, så nær som mulig til den fremre side av egg kamrene (figur 1E) -3.
- Pipette 100 ul kald 1X PBT over klippe kolonnen.
- Bruk en runde kanter slikkepott for å fjerne overflødig glycerin gelé rundt tre sider av kuttet kolonne med egg kamre og kast, mens resten på lysbildet.
- Sett spatel i snitt på fremre side av egg kammer og separere kolonnen fra den primære glyserin gelé blokk.
- Forberede prøver for enten inverterte (5.8.1) eller oppreist (5.8.2) mikroskopi.
- For Inverted Microscope: Transfer than kolonne av egg kamre til en dekkglass med fremre side av egg kamre vendt ned. Gjenta trinn 05.02 til 05.08 før alle kolonner med glycerin gelé er fjernet og montert. Legg et par dråper 50% PBS-Glyserol på hver blokk av egg kamre for å hindre dem fra å tørke ut. Bilde egg kamre direkte på dekk.
- For Upright Microscope: Overfør kolonnen av egg kamre til et objektglass med fremre siden opp. Gjenta trinn 05.02 til 05.09 før alle kolonner med glycerin gelé er fjernet og montert på objektglass. Legg et par dråper 50% PBS-Glyserol på hver blokk av egg kamre og dekkblokker med en # 1 ½ dekkglass.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den opprettstående avbildningsmetode tillot oss å se direkte organisering av celler i den fremre follikulær epitelet i trinn 8. En generell markør for celle follikkel skjebne, øynene Fraværende (EYA) protein, så vel som den kjernefysiske DNA-markør DAPI, selv viste ekspresjon på tvers av dette felt av cellene, og viste at alle celler kunne sees med liknende fargingsintensitet (figur 2B "). Proteiner er regulert i respons til cytokin UPD viste imidlertid variable mønstre og uttrykk nivåer. Polare celler slipper UPD apikalt før dette stadiet av egg utvikling 16,17, så vi forventet STAT skal aktiveres radialt om de polare celler, som var noen ganger tilfelle. Ofte skjønt, observerte vi at nedstrøms mål for STAT, inkludert SLBO, hadde mer komplekse uttrykk mønstre. For eksempel GFP reporter for SLBO ekspresjon først i de fleste, men ikke alle, celler som omga de polare celler (figur 2B, og se Manning et al under vurdering). Vi la merke til små forskjeller i E-cadherin uttrykk / lokalisering (figur 2B '), noe som kan gjenspeile endringer i heft, men mer arbeid vil være nødvendig for å kvantifisere og tolke dette resultatet. Disse spissfindigheter var ikke detekterbare gjennom lateral tredimensjonal rekonstruksjon av iscenesatte egg kamre (Figur 2C-D). Forskjellene i den apikale-basal aksen av hårsekkceller kan også skilles ved hjelp av opprettstående metode. Vi brukte en reporter linje for ringkanalprotein Visgun (VSG), som er til stede på den apikale område av plasmamembraner 18 (figur 3A). Oppreist avbildning bekreftet VSG ekspresjon ble påvist i den apikale del av hårsekkceller, nær den smaleste delen av den polare celler (Figur 3B).
Vi har også funnet at den opprettstående avbildningsmetode fungerer godt for å vise den fremre epitelet i trinn 9 egg kamre. På dette developmental scenen, grensecellene koaleserer sammen rundt polar celler (Figur 4A). Vi kunne observere disse komprimert klynger ved hjelp av slutt på imaging (Figur 4B-C). Som i trinn 8, fant vi tilsvarende nivåer av EYA ekspresjon i alle de epiteliale celler (ikke vist), mens slbo -GFP samt aktivert, atom STAT merket bevegelige grenseceller (figur 4B og 4C). Lokalisering av FAS3 protein indikerte polar celle-polar celle grensesnitt (Figur 4B). I tillegg er det i begge trinn 8 og 9 kan man se de store sykepleier celler, som vist ved DAPI eller phalloidin-farging av kortikale aktin (ikke vist), noe som antyder denne fremgangsmåte vil også være nyttige ved studiet av bakterie linjeceller eller bakteriecelle -follicle celle interaksjoner.
Figur 1. Stående montering av Drosophila egg kammerets. (A) Drosophila eggstokk indikerer egg kammeret, kappe, og ovariole. Avbildning illustrerer posisjonen av tang for å trekke ovariole langsomt fra eggstokken kappe. Inset viser plassering av fly for disseksjon. Ventral side av kvinnelige flue vender oppover. A-anterior, P-posterior. (BD) Fremgangsmåte for montering egg kamre. (B) En liten dråpe av egg kamre i 70% glycerol-PBS, sett under et stereomikroskop disseksjon. Den gule pilen indikerer en ovariole kjeden; gul pilespiss indikerer en individuell egg kammeret. Rød pil indikerer kanten av Glyserol-PBS dråpe. (C) Kolonner av egg kamre arrangert på tynt lag av størknet glyserin gelé. Gul pilespiss indikerer en individuell egg kammer. (D) En annen tynt lag av smeltet glyserin gelé dekker egg kammer kolonner for å bygge dem. Gul stiplet linje indikerer hvor kuttene skal tas etter O / N inkubasjon ved 4ᵒC. Rød pil indikererkanten av det andre laget av glyserin gelé. Røde tall indikerer rekkefølgen kutte egg kammer kolonner (horisontal topp og bunn kutt er ikke vist). Anterior er til venstre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. avbildning av fremre epitel et tidlig stadium 8 egg kammeret. (A) Lateral visning av en scene 8 langsomme grenseceller (slbo) genet reporter egg kammer (genotype: slbo -Gal4, UAS-mCD8-GFP) 19,20, farget med DAPI og primære antistoffer som angitt eller for slbo> GFP. Armadillo (ARM) er sparket homolog av β-catenin. Anterior (A) er til venstre, bakre (P) til høyre. (BB ") End-on visninger av et egg chamber. Tredimensjonal rekonstruksjon av Z-stack bilder av en scene 8 slbo- genet reporter egg kammer montert oppreist, farget med primære antistoffer som angitt. Magenta stjernene indikerer polare celler. DAPI markerer kjerner. (B ') slbo> GFP uttrykkes bare i de presumptive grenseceller (SLBO). E-cadherin (E-CAD) er en adhesjonsmolekyl lokalisert til membranen og beriket i grenseceller. (B '') Eyes Fraværende (EYA) er funnet jevnt uttrykt i kjernen av alle hårsekkceller unntatt polare celler. (C) Standard lateral visning av en slbo -reporter scene 8 egg kammer farget med DAPI (blå) og antistoffer mot GFP (SLBO, grønn), ARM (rød), og FAS3 (hvit). Innfelt viser akser: X-aksen er ned (grønn pil), er Y-aksen mot venstre (rød pil), og Z-aksen er mot betrakteren (blå) (D) For forhold til den nye teknikken. viser dette panelet en slutt på-view created av en tredimensjonal rekonstruksjon, behandlet med Volocity programvare, ved anvendelse av en Z-stabel av sidebilder av egget kammeret vist i C. Innsatt viser de viste akser: X-aksen er nede (grønn pil), er Z-aksen nå mot venstre (blå pil), og Y-aksen er mot betrakteren (rød). Individuelle celler er uskarpe på grunn av lav oppløsning i Z-aksen; dermed den nye tilnærmingen vist i B representerer en betydelig bildeforbedring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sammenligning av protein ekspresjon i laterale og fremre domener av follikulær epitel fra et stadium 8 egg kammeret. (A) Rekonstruksjon av en lateral visning av en scene 8 egg kammer av visgun (VSG) -GFP reporter <sup> 21-23, farget for antistoffer rettet mot GFP eller ARM (hvit). DAPI markerer kjernene i blått, og store sykepleier cellekjerner er tydelige. VSG lokaliserer til ringen kanalene i hårsekkceller (grønt). (BB ') End-on visninger av et egg chamber.Three-dimensjonal rekonstruksjon av en Z-bunke med bilder av en scene 8 VSG-GFP reporter egg kammer, farget med primære antistoffer som angitt. SLBO protein (rød) er oppdaget i både polare og grensecellekjerner. ARM markerer hårsekken cellemembraner og er beriket i grense celler; DAPI etiketter kjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Imaging av tidlig stadium 9 egg kamre. (A) Lateral syn på et tidlig stadium 9 slBo -reporter egg kammeret. Grenseceller (grønt) har gruppert innenfor fremre epitel (hvit pil). BC) End-on utsikt over egg kamre. Tredimensjonal rekonstruksjon av en Z-bunke bilder fra et tidlig stadium 9 slbo- genet reporter egg kammer, farget med primær antistoffer rettet mot proteiner som indikert eller GFP. (B) slbo> GFP er uttrykt i grensecellene (grønn) , mens Fasciclin 3 (FAS3, hvit) lokaliserer sterkt til membranen mellom de to polare celler; DAPI markerer kjerner (blå). Magenta stjernene indikerer polare celler. (C) Både kjernekraft (aktivert) STAT og slbo> GFP uttrykk finnes bare i grensecellene, mens E-cadherin (E-CAD) markerer membraner av hårsekkceller, og DAPI indikerer kjerner. Magenta stjernene indikerer polare celler. Fargingsresultater er vist hver for seg for slbo> GFP (C ') og STAT (C' ') Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en fremgangsmåte for å montere og lite bilde, utvikle egg kamre fra en ende-mot perspektiv. Vanlige teknikker for bildebehandling egg kamre er optimalisert for sidevisninger og primært tillate presis visualisering av medio-lateral hårsekkceller når farget med fluorescerende antistoffer. Anvendelsen av Z-stabler eller 3-D-rekonstruksjoner hjelpemidler i å vise flere fokale plan, men er fremdeles utilstrekkelig for sub-cellulære oppløsning av polene på elliptiske egg kamre (figur 2D). Selv om dette kan overvinnes delvis med de nyeste mikroskopiteknikker slik som super-bildeoppløsning, disse metoder er kostbare og ikke alltid tilgjengelig. Vi har tilpasset oppreist avbildningsprotokoller for Drosophila embryoer 24,25 som skal brukes for de mye mindre egg kamre. Det er flere viktige endringer i metoden for behandling av den mye mindre størrelse på egg kamre i forhold til embryoer. En viktig komponent i den beskrevne teknikk er den fysiske fraskillingasjon av individuelle kamre, som ikke kreves av embryoer. En annen endring er bruken av en andre glycerin gelé dekselet under montering (4.4). Størrelsen av egg kamrene og deres festing gjennom stilken celler til andre egg kamre krever manipulering med nålen og fører til ødeleggelse av glyserin gelé. Derfor må egg kamre overføres med en nål til en ny glyserin gelé lysbilde for montering (4,5). Oppreist bildebehandling åpner for visualisering av områdene uskarpe ved laterale eller horisontale utsikt, avslører ny informasjon om vevet organisasjon under egg utvikling. Dette førte til ny innsikt på mønstrings hendelser, og vi foreslår at denne metoden kan brukes til å utforske flere sider ved oogenesen.
Vi har bestemt flere kritiske trinn i vellykket oppreist montering. Vi har funnet at det er nødvendig å fjerne ovariole kjedene fullstendig fra kappen under disseksjonen og ønskede egg kamre må skjæres fra ovariole-kjeden. Unnlatelse av å frigjøre egg kamre fra ovariole gjør det vanskelig å plukke opp den riktige scenen egg kammer (trinn 4.3). Vi anbefaler å jobbe med små mengder av glyserin gelé på en gang ved å alikvoteringsprosessen det inn i rørene. Ikke varm glyserin gelé mer enn to ganger fordi gjentatt oppvarming endrer konsistens og hindrer den fra å størkne skikkelig (3.1). Bruk filter tips for å unngå aspire gelé i pipetter. Tillat glyserin gelé å stivne på objektglass i minst 8 timer ved 4 ° C. Forkorte dette trinnet gjør monteringen egg kamre vanskelige (3,6). Det er viktig å sørge for å absorbere all PBS-glyserol fra monterte egg kamre (4,6). Hvis for mye væske er til stede, det hindrer det øverste laget av glyserin gelé fester seg til bunnen. I dette tilfellet, kan egg kamre flyte og endre posisjon. For best tenkelig resultater, må glyserin gelé blokker kuttes så nær den fremre side av egg kamre som fysisk er mulig (5.4). For mye glyserin gelé på detteside avtar bildekvaliteten på grunn av den økte avstanden mellom prøvestykket og dekkglass.
Det er noen begrensninger for montering prøver i glyserin gelé. For ett, det øker avstanden mellom prøven og målet. Denne avstand ved høy forstørrelse, spesielt ved anvendelse av et objektiv olje, kan skape problemer med å fokusere på prøvestykket, noe som kan resultere i dårlig bildekvalitet. Gitt dette, er det svært viktig å skjære ut de glyserin gelé blokkene svært nær egg kamre. Selv om glyserin gelé er optisk klart, det gjør det defract noen lys. En annen begrensning er at antistoff-signalet kan bli redusert på grunn av en kombinasjon av arbeidsavstand til målet og tykkelsen av glyserin gelé. En økning av konsentrasjonen av både primære og / eller sekundære antistoffer kan noen ganger hjelpe til å redusere dette problemet. Selv om det varierer med antistoff, vi vanligvis ervervet bedre bilder ved å bruke doble konsentrasjonen av sekundær mauriBody i oppreist bildebehandling i forhold til mengden som brukes i standard side bildebehandling. Vi kjenner ikke til noen alternativer til glyserin gelé for montering egg kamre oppreist. Andre materialer slik som agarose og polyakrylamid ble forsøkt, men alle defracted lyset mer alvorlig og føre til tap av klarhet og avbildning. Dermed er denne monteringsteknikk det beste som er tilgjengelig for bruk med standard mikroskopi.
Mens vi fokusert på de stadier av grensen celle spesifikasjon og initiering av bevegelighet, kan egg kamre av ulike stadier brukes i denne protokollen med bare noen små justeringer. Viktigst, kan måleren av nålen bli endret for å manipulere egg kamre av forskjellig størrelse og utviklingsstadier. For etapper 7-10, fungerer en 30 G nål vel fordi egg kamre passer lett i vinkel. For tidligere stadium egg kamre en større gauge nål (mindre skrå) bør brukes og tilsvarende en mindre sporvidde (større skrå) bør brukes for senere stalderen egg kamre. Noe på en eldre utviklingsstadiet ville bli for stor for denne måleren (4.3). Også en hvilken som helst side av egget kammeret kan avbildes ved hjelp av denne teknikken ved å anordne glycerin gelé blokk av egg kamre med området av interesse mot målet.
Monterings små prøver støttes i glyserin gelé har potensial til å være nyttig i flere sammenhenger. Denne strategi kan anvendes for å visualisere forskjellige typer av små, faste vev fra andre organismer, særlig når det ville være utilstrekkelig til å undersøke prøver fra bare ett perspektiv. Når denne teknikken beherskes, kan den brukes til å vise egg kamre på hvilken som helst ønsket vinkel, alt etter hvordan egg kamrene er plassert i gelé. Denne metoden gjør det mulig for unik utsikt skaper en mye bedre tredimensjonal forståelse av mobilnettet organisasjon. Oppreist avbildning av egg kamre i forbindelse med immunfluorescens antistoffarging tillater presis påvisning av proteiners og celle-celle kontakter som ikke ville være mulig under standard monterings forhold. Vi planlegger å bruke denne metoden i å kartlegge celle-celle interaksjoner som tillater sammenvoksing og avløsning av grensen celle klynge fra epitel. På dette tidspunktet, kan den oppreist avbildningsteknikk ikke brukes sammen med levende eksempler, men vi jobber også for å overvinne denne hindringen. Vi forventer denne metoden vil også være aktuelt å studere andre aspekter av Drosophila oogenesen, eller kunne tilpasses bilde andre små vev på nye vinkler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
