Introduction
Estudio de Drosophila melanogaster ha proporcionado grandes conocimientos sobre la regulación genética de una amplia gama de fenómenos. En particular, ha habido una extensa investigación en el desarrollo de huevo, porque la ovogénesis proporciona una forma manejable para investigar muchos procesos de desarrollo diferentes, incluyendo patrones de tejido, los cambios de polaridad celular, la conmutación del ciclo celular, y la regulación de traducción 1,2,3,4. Un evento morfogénica importante durante la ovogénesis es la especificación, la adquisición de la motilidad, y la migración de un conjunto de células llamadas células de frontera (revisado en 5). Puesto que la migración celular es una característica clave de la morfogénesis animal, y porque la regulación genética de este proceso está bien conservada, mecanismos determinados en las moscas son propensos a ser importante en otros contextos. Por lo tanto, estamos investigando el control molecular de la migración celular frontera. Para nuestros estudios, hemos desarrollado un nuevo método para observar los polos anteriores de desarrollo de los huevos,donde surgen las células de frontera, para examinar cómo se desarrollan en detalle.
Dentro del ovario, existen cámaras de huevos en las distintas etapas de desarrollo a lo largo de las cadenas de llamadas ovarioles, que están provistas de un revestimiento delgado (Figura 1). Cada cámara de huevos pasará a formar un huevo. Durante la ovogénesis, varios tipos diferentes de células deben desarrollar de manera coordinada. El D. cámara de huevos melanogaster consta de 16 células de la línea germinal, entre ellos uno de los ovocitos, rodeado de una sola capa de epitelio folicular 6. Un pequeño número de células especializadas, llamadas células polares, surgen en los anteriores y posteriores polos del epitelio. Las células del borde 6-8 se originan en el epitelio anterior de la cámara de huevos, inducida por las células polares 5,7. A mediados de la ovogénesis (etapa 9), las células se desprenden de la frontera de sus vecinos y migran entre las células de la enfermera para alcanzar el ovocito en la parte posterior de la cámara de huevos 5,7. Este movimiento debe ser realizadomientras que las células permanecen en la frontera de un clúster que rodea dos células polares no móviles, haciendo de este un tipo de migración celular colectiva. Migración exitosa del grupo de células frontera garantiza el desarrollo adecuado de la micropilo de la cáscara del huevo, que es necesaria para la fertilización.
Las células polares anteriores instruyen destino celular frontera mediante la activación de una cascada de transducción de señales. Célula polar secretan una citoquina, Unpaired (UPD), que se une a un receptor transmembrana, domeless (DOMO), en células del folículo vecino durante la etapa 8 del desarrollo de los ovocitos 8,9. La unión de UPD causa de la tirosina quinasa Janus (JAK) para fosforilan el transductor de señales y activador de la transcripción (STAT) 8,10,11. STAT se mueve entonces al núcleo para activar la transcripción. Células del borde lento (SLBO) es un factor de transcripción que es una diana transcripcional directa de STAT y también se requiere para la migración de células frontera 12. Vistas laterales de cámaras de huevos indican tactividad STAT sombrero está regulada en un gradiente a través del epitelio anterior 8,11,13. Células del folículo más cercanos a las células polares tienen los más altos niveles de STAT activado, por lo que se convierten en células de frontera e invaden el tejido de la línea germinal adyacente.
Para entender cómo se especifican las células del borde interior y se desprenden del epitelio, tenemos que observar cómo se organiza el tejido. Si vemos cámaras de huevos desde una perspectiva anterior-en, esperaríamos la simetría radial de la actividad STAT en las células foliculares que rodean las células polares. Una vista frontal también mostrar con mayor precisión las diferencias de las proteínas de membrana y las interfaces de célula-célula antes y durante el desprendimiento de la comparación de células en diferentes planos focales. Porque cámaras de huevos son oblongas y unido entre sí por las células tallo, se instalan en portaobjetos lateralmente, por lo que es difícil de observar la arquitectura anterior. Por lo tanto, toda la información acerca de las células en los polos de la cámara de huevos tieneha inferido a partir de vistas laterales. Aunque alguna información puede ser obtenida a través de algoritmos reconstrucciones 3-D de las secciones ópticas, dispersión de la luz, fotoblanqueo y límites más pobres de la resolución en el eje Z que esta información menos detallada y fiable en ausencia de técnicas costosas como super-resolución microscopía 14 . Otros tipos de formación de imágenes basada en sección (por ejemplo, microscopía electrónica o seccionamiento microtomo) requieren una extensa manipulación de los tejidos, incluyendo la deshidratación, aumentando la probabilidad de artefactos. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo método para la imagen D. cámaras de huevos melanogaster mientras que en posición vertical. Este método ya ha demostrado su utilidad en la aclaración de cómo están destinados células móviles (ver resultados representativos y Manning et al, en revisión), y es probable que sea más ampliamente valiosa en el estudio de otros aspectos de la ovogénesis.
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Protocol
1. Disección de ovarioles
- Transferir unos quince 2-4 días de edad, las moscas hembras y unos pocos hombres a un nuevo vial de alimentos mosca con agregado de levadura seca activa. Utilice algodón como un tapón para los viales, y añadir unas gotas de agua para el algodón para mantener la humedad alta.
- Colocar el vial en una incubadora a 25 ° C durante 14-16 horas para maximizar el número de la etapa 8-10 cámaras de huevos.
NOTA: El tiempo de incubación varía dependiendo de la temperatura y la fase deseada. - Preparar los medios de disección, 0,1 M KPO 4 y NP40 soluciones según sea necesario para el día siguiente (ver Materiales).
- Anestesiar las moscas utilizando CO 2, y poner bajo un microscopio de disección. Pipet varias gotas de medios disección en cada cavidad en la diapositiva depresión de vidrio.
- Mantenga fórceps en cada mano en un ángulo de aproximadamente 30 ° a la superficie de la mesa y orientar una mosca hembra con las alas hacia abajo. Con la mano no dominante, recoger la hembra usando pinzas, agarrándola de la unanterior del abdomen, cerca del tórax, y sumerja en el medio de su disección en la diapositiva depresión (Figura 1A recuadro).
- Con el otro par de pinzas, sujete el exoesqueleto en la ventral posterior del abdomen y la traspasará. Coge los ovarios en el extremo posterior, a continuación, tire hacia fuera del abdomen y el lugar en el medio nuevo en el otro lado de la corredera de la depresión. (Figura 1A recuadro). Evite tirar aparte el intestino. Deseche la canal.
- Repita con el resto de las moscas hembras hasta que se disecan los ovarios. Deseche los varones.
- Con un par de pinzas, mantenga un ovario en el extremo posterior (cerca de las grandes cámaras de huevos), y con la otra mano usar un par de pinzas para pellizcar una de las cámaras de huevos más anteriores (germarium). (Figura 1A).
- Poco a poco y de manera constante, tirar de una cadena ovariole fuera de la vaina ovario. Continuar a diseccionar ovarioles individualmente hasta que todas las cámaras de huevo deseados son removed.
- Repita los pasos 1.7 a 1.8 para todos los ovarios disecados.
- Una vez completa, traslado ovarioles a un tubo de 0,6 ml con una pipeta de transferencia de plástico.
- Deje ovarioles depositan en el fondo del tubo, a continuación, proceder a los pasos de fijación y tinción.
2. Inmunofluorescencia (IF) La tinción de ovarioles
- Retire con cuidado los medios disección de ovarioles con una pipeta. Asegúrese de no eliminar cualquier ovarioles o cámaras de huevo. Deje aproximadamente 50 l de ovarioles y medios de disección.
- Añadir 50 l de 16% de paraformaldehído a 150 ml de 0,1 M KPO4 de búfer en un tubo, y añadir la solución de cámaras de huevos para solucionarlos. Incubar mientras se balancea durante 10 min. PRECAUCIÓN: paraformaldehído es tóxico.
- Retire el fijador y enjuague dos veces con tampón de lavado NP40 0,5 ml.
- Lavar dos veces durante 15 min cada uno a temperatura ambiente.
- Consulte la norma SI protocolo 15 para los pasos posteriores.
- Brevemente, después de la fijación, añadiranticuerpos primarios a las diluciones apropiadas y se incuban O / N a 4 ° C. Lave en NP40 varias veces, a continuación, añadir anticuerpos secundarios (1: 200 diluciones).
- Lavar varias veces en NP40, a continuación, añadir DAPI (1: 1000) durante 10 min, a continuación, repetir los lavados. Una vez SI protocolo es completa, añadir 200 l de glicerol al 50% en PBS para cámaras de huevos y dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 horas.
- Retire la solución, reemplazarlo con un 70% de glicerol en PBS, y cubrir con papel aluminio. Coloque la muestra en 4 ᵒC hasta que esté listo para el montaje. Mientras tanto, continúe con el paso 3.
3. Preparación previa de Glicerina Jalea Slides
- Medir al menos 4 ml de glicerina jalea usando una espátula y llenar un tubo de cultivo de célula de vidrio hasta la marca de medio camino. Derretir la jalea de glicerina en un baño de agua a 55 ° C durante 30 min.
- Verter una pequeña gota de glicerol, aproximadamente 300 l, a partir de la solución madre en dos portaobjetos de microscopio. El uso de un tejido, extendido glicerol en una delgada layer en cada una de las diapositivas. Esto proporciona una base y permite una fácil extracción de gelatina de glicerina en el paso 5.6.
- Corte la punta de una punta de pipeta de 1.000 l filtrada. El uso de puntas de pipeta de corte para transferir 1.000-1.500 l de jalea caliente glicerina lentamente a cada portaobjetos. Tenga cuidado para evitar burbujas.
- Deje diapositivas jalea glicerina sientan durante 5 minutos a temperatura ambiente para ajustar.
- Coloque cada diapositiva jalea glicerina en 60 mm × 15 mm plato de Petri y cubrir con papel plástico. Lugar a 4 ° CO / N. Opcionalmente, tienda de glicerina diapositivas jalea de hasta 5 días a 4 ° C.
4. Montaje de cámaras de huevos
- Usando muestras de la etapa 2.5, pipeta varias gotas 3 l de cámaras de huevos en 70% de glicerol a través de uno de glicerina jalea diapositiva. Continuar pipeteo 3 mu l gotas hasta que todas las cámaras de huevos están en esta diapositiva. Asegúrese de que cada gota contiene al menos diez cámaras de huevos. Mientras tanto, calentar un tubo de cultivo de gelatina de glicerina en un 55 ° C baño de agua.
- Colocar el portaobjetos jalea glicerina con cámaras de huevos bajo un microscopio de disección. Ajustar la ampliación de modo que sólo una gota de cámaras de huevo está en el campo de visión (Figura 1B).
- El uso de una aguja de calibre 30 como una cuchara, coger la cámara de la etapa de huevo deseado. Cuando sea necesario, cámaras de huevos deseados separados de una cadena ovariole utilizando la aguja como un cuchillo.
- Para evitar los desechos que puedan interferir con la imagen, transferir la cámara de huevos a la segunda diapositiva jalea glicerina, con la anterior frente a la izquierda (Figura 1E -1). Repita hasta que hay por lo menos siete cámaras de huevos alineados en una columna (Figura 1C).
- Formar nuevas columnas de siete hasta que todas las cámaras de huevos deseados se transfieren a la segunda diapositiva jalea glicerina.
- Corte un pequeño trozo de tejido y giro. Use esto para absorber el exceso de PBS-glicerol a partir de las cámaras de huevos tocando ligeramente cada una. Tenga cuidado de no eliminar cámaras de huevos.
- Cortar lapunta de una punta de pipeta 200 l filtrada. Utilice esta transferir 150 l de glicerina jalea para cubrir todas las columnas de cámaras de huevos.
NOTA: La cantidad de glicerina jalea necesario para cubrir las columnas se basa en las etapas de la cámara de huevo y el número de columnas. La cantidad puede ser ajustada. - Deje cámaras de huevos montados sientan durante 5 minutos a temperatura ambiente hasta que la capa superior de la jalea de la glicerina se solidifica por completo (Figura 1D).
- Ponga los portaobjetos de cámaras de huevos montados en una placa de 60 mm x 15 mm de Petri y cubrir con papel plástico. Almacenar a 4 ° CO / N para permitir que las capas de gelatina glicerina para solidifican juntos (lugar en la oscuridad si existe preocupación por photobleaching).
5. Preparación de Cámaras de huevo de la Imagen
- Coloque la diapositiva de cámaras de huevos montados bajo un microscopio de disección. Ajustar la ampliación de modo que sólo una columna de cámaras de huevo está en el campo de visión.
- Con un bisturí miniatura ángulo de 45 °, corte un straight línea a lo largo del lado derecho de la primera columna de cámaras de huevos (cerca de la parte posterior de las cámaras de huevos). (Figura 1D-E)
- A continuación, cortar por encima de la primera cámara de huevos en la parte superior y por debajo de la última cámara de huevos en la columna. En este punto la columna de cámaras de huevos se debe cortar en tres lados.
- El uso de un microknife, rebanada a lo largo del lado izquierdo de la columna, lo más cerca posible a la cara anterior de las cámaras de huevo (Figura 1E) -3.
- Pipetear 100 l de frío 1X PBT sobre la columna de la corte.
- Use una espátula de bordes redondeados para eliminar el exceso de gelatina de glicerina en torno a tres lados de la columna de la corte de cámaras de huevos y descartar, dejando el resto de la diapositiva.
- Inserte la espátula en el corte hecho en el lado anterior de cámaras de huevos y separar la columna desde el bloque de gelatina de glicerina primaria.
- Preparar las muestras, ya sea para invertidas (5.8.1) o vertical (5.8.2) de microscopía.
- Para Inverted Microscope: t Transferenciaque la columna de cámaras de huevos a un cubreobjetos con cara anterior de cámaras de huevos hacia abajo. Repita los pasos 5.2 a 5.8 hasta que se hayan eliminado todas las columnas de la jalea de glicerina y montado. Añadir un par de gotas de 50% PBS-glicerol en cada bloque de cámaras de huevos para evitar que se sequen. Cámaras de huevos imagen directamente sobre cubreobjetos.
- Para microscopio vertical: Transferir la columna de cámaras de huevos a un portaobjetos de microscopio con la cara anterior hacia arriba. Repita los pasos 5.2 a 5.9 hasta que se hayan eliminado todas las columnas de la jalea de glicerina y montadas en portaobjetos de microscopio. Añadir un par de gotas de 50% PBS-glicerol en cada bloque de cámaras de huevos y los bloques de la cubierta con un cubreobjetos ½ # 1.
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Representative Results
El método de formación de imágenes en posición vertical nos permitió ver directamente la organización de células en el epitelio folicular anterior en la etapa 8. Un marcador general de destino de las células del folículo, la ausencia Eyes (EYA) de proteína, así como el marcador de ADN nuclear DAPI, mostró incluso expresión a través de este campo de las células, y demostraron que todas las células se podían ver con intensidades de tinción similares (Figura 2B "). Proteínas reguladas en respuesta a la UPD de citoquinas, sin embargo, mostraron patrones variables y los niveles de expresión. Células polares liberan UPD apical antes de esta etapa de desarrollo de los huevos 16,17, por lo que espera STAT para ser activado radialmente alrededor de las células polares, que era a veces el caso. A menudo, sin embargo, se observó que los objetivos intermedios de STAT, incluyendo SLBO, tenían patrones de expresión más complejas. Por ejemplo, el reportero GFP para la expresión SLBO apareció en la mayoría, pero no todas, las células que rodean las células polares (Figura 2 B, y vea Manning et al en revisión). Nos dimos cuenta de ligeras diferencias en la E-cadherina expresión / localización (Figura 2B '), lo que puede reflejar cambios en la adhesión, pero se necesitarán más trabajo para cuantificar e interpretar este resultado. Estas sutilezas no eran detectables a través de la reconstrucción tridimensional lateral de cámaras de huevos por etapas (Figura 2C-D). Las diferencias en el eje apical-basal de las células del folículo también se pueden distinguir usando el método vertical. Se utilizó una línea reportero de la proteína de canal de anillo de Visgun (VSG), que está presente en la región apical de las membranas de plasma 18 (Figura 3A). Upright de imágenes confirmado la expresión VSG se detectó en la parte apical de las células del folículo, cerca de la parte más estrecha de las células polares (Figura 3B).
También hemos encontrado que el método de formación de imágenes en posición vertical funciona bien para ver el epitelio anterior en la etapa 9 cámaras de huevos. En este developmental etapa, las células de frontera se aglutinan juntos alrededor de las células polares (Figura 4A). Pudimos observar estas agrupaciones compactados utilizando el-en el extremo de imágenes (Figura 4B-C). Como en la etapa 8, hemos encontrado niveles similares de expresión EYA en todas las células epiteliales (no se muestra), mientras que GFP slbo así como activado, STAT nuclear marcaron las células del borde móviles (Figura 4B y 4C). La localización de la proteína FAS3 indica la interfaz célula-célula polar polar (Figura 4B). Además, en ambas etapas 8 y 9 podíamos ver las grandes células de la enfermera, según lo indicado por DAPI o faloidina-tinción de actina cortical (no mostrado), lo que sugiere este método también será útil en el estudio de las células de la línea germinal o de células germinales interacciones celulares Folículo.
Figura 1. montaje vertical de la cámara de huevo Drosophilas. (A) Drosophila ovario indicando cámara de huevos, la vaina, y ovariole. Representación ilustra la posición de fórceps para tirar del ovariole lentamente de la vaina de ovario. El recuadro muestra el posicionamiento de la mosca para la disección. Parte ventral de mosca hembra quede hacia arriba. A-anterior, P-posterior. (BD) Procedimiento de montaje de cámaras de huevos. (B) Una pequeña gota de cámaras de huevos en 70% de glicerol-PBS, se observa bajo un estereomicroscopio de disección. La flecha amarilla indica una cadena ovariole; punta de flecha amarilla indica una cámara de huevos individual. La flecha roja indica el borde de la gota de glicerol-PBS. (C) Columnas de cámaras de huevos dispuestos en capa delgada de gelatina de glicerina solidificado. Punta de flecha amarilla indica una cámara de huevos individual. (D) Una segunda capa delgada de gelatina de glicerina derretida cubre las columnas cámara de huevos para incrustar ellos. Línea de puntos amarillo indica dónde se deben hacer recortes después de O / N incubación a 4ᵒC. La flecha roja indica elborde de la segunda capa de gelatina de glicerina. Los números rojos indican el orden de corte de las columnas de la cámara de huevo (superior horizontal y cortes inferiores no se muestran). Anterior es a la izquierda. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imaging del epitelio anterior de una etapa 8 cámara de huevos temprana. (A) Vista lateral de un 8 células del borde lentas (slbo) cámara etapa reportero gen huevo (genotipo: slbo Gal4, UAS-mCD8-GFP) 19,20, se tiñeron con DAPI y anticuerpos primarios como se indica o para slbo> GFP. Armadillo (ARM) es el homólogo de la mosca de la β-catenina. Anterior (A) está a la izquierda, posterior (P) a la derecha. (BB ") End-en vistas de un cha huevombre. Reconstrucción tridimensional de imágenes Z-stack de un 8 slbo- reportero gen cámara de huevos escenario montado en posición vertical, se tiñeron con anticuerpos primarios como se indica. Asteriscos magenta indican células polares. DAPI marca los núcleos. (B ') slbo> GFP se expresa sólo en las células del borde presuntivos (SLBO). E-cadherina (E-CAD) es una molécula de adhesión localizado en la membrana y enriquecida en células fronterizas. Ojos (B '') Ausente (EYA) se encuentra expresado de manera uniforme en los núcleos de todas las células del folículo, excepto las células polares. (C) Vista estándar lateral de una etapa 8 cámara de huevos -reporter slbo se tiñeron con DAPI (azul) y los anticuerpos contra la GFP (SLBO, verde), ARM (rojo), y FAS3 (blanco). El recuadro muestra los ejes: el eje X es hacia abajo (flecha verde), el eje Y es hacia la izquierda (flecha roja), y el eje Z es hacia el espectador (azul) (D) para la comparación con la nueva técnica. Este panel muestra una creatina final en vistaTed por una reconstrucción tridimensional, procesado con software Volocity, utilizando un Z-pila de imágenes laterales de la cámara de huevos se muestra en C. El recuadro muestra los ejes convertido: el eje X es hacia abajo (flecha verde), en el eje Z es ahora hacia la izquierda (flecha azul), y el eje Y es hacia el espectador (rojo). Las células individuales son borrosas debido a la baja resolución en el eje Z; por lo tanto, el nuevo enfoque se muestra en B representa una mejora significativa de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Comparación de la expresión de proteínas en dominios lateral y anterior del epitelio folicular de una cámara de huevos etapa 8. (A) Reconstrucción de una vista lateral de una cámara de huevos etapa 8 de visgun (VSG) GFP reportero <sup> 21-23, manchado de anticuerpos dirigidos contra GFP o ARM (blanco). DAPI marca los núcleos en azul, y grandes núcleos celulares enfermera son evidentes. VSG se localiza en los canales de llamada de las células del folículo (verde) (BB ') de extremo en vistas de un huevo-chamber.Three dimensional reconstrucción de un Z-pila de imágenes de una etapa 8 VSG-GFP cámara de huevos reportero, se tiñeron con. anticuerpos primarios como se indica. Se detecta la proteína SLBO (rojo) en los dos núcleos de las células polares y de frontera. ARM marca membranas celulares del folículo y se enriquece en células de frontera; DAPI etiquetas núcleos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imagen de los primeros etapa 9 cámaras de huevos. (A) Vista lateral de una temprana etapa 9 slcámara de huevos bo -reporter. Las células del borde (verde) se han agrupado dentro del epitelio anterior (flecha blanca). BC) End-en vistas de las cámaras de huevos. Reconstrucción tridimensional de un Z-pila de imágenes desde una etapa temprana 9 slbo- cámara de huevos gen reportero, teñidas utilizando anticuerpos primarios dirigidos contra las proteínas como se indica o GFP. (B) slbo> GFP se expresa en las células del borde (verde) , mientras que fasciclina 3 (FAS3, blanco) se localiza altamente a la membrana entre las dos células polares; DAPI marca el núcleos (azul). Asteriscos indican Magenta células polares. (C) Tanto nuclear (activado) STAT y slbo> expresión de GFP se encuentran sólo en las células del borde, mientras que la E-cadherina (E-CAD) marca las membranas de las células del folículo, y DAPI indica los núcleos. Asteriscos magenta indican células polares. Resultados de la tinción se muestran individualmente para slbo> GFP (C ') y STAT (C' ') Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí se describe un método para montar y la imagen pequeña, el desarrollo de cámaras de huevos desde una perspectiva final sobre. Las técnicas comunes para cámaras de huevos de imagen se optimizan para las vistas laterales y permiten principalmente visualización precisa de las células del folículo medio-lateral cuando se tiñen con anticuerpos fluorescentes. El uso de la Z-pilas o 3-D ayudas reconstrucciones en la visualización de múltiples planos focales, pero sigue siendo insuficiente para la resolución sub-celular de los polos de cámaras de huevos elípticos (Figura 2D). Mientras que esto puede ser superado parcialmente con las técnicas más recientes, tales como imágenes de microscopía de super-resolución, estos métodos son caros y no siempre está disponible. Hemos adaptado protocolos de imagen vertical para Drosophila embriones 24,25 que se utilizará para las cámaras de huevos mucho más pequeñas. Hay varias modificaciones clave en el método para tener en cuenta el tamaño mucho más pequeño de cámaras de huevos en comparación con los embriones. Un componente clave de la técnica descrita es la SEPAR físicaación de cámaras individuales, que no se requiere de embriones. Otro cambio es el uso de un segundo portaobjetos jalea de glicerina durante el montaje (4.4). El tamaño de las cámaras de huevo y su fijación a través de las células de tallo a otras cámaras de huevos requiere la manipulación con la aguja y conduce a la destrucción de gelatina de glicerina. Por lo tanto, cámaras de huevos deben ser transferidos con una aguja para una nueva diapositiva jalea glicerina para el montaje (4.5). Imagen vertical permite la visualización de las áreas borrosas por las vistas laterales u horizontales, revelando nueva información sobre la organización del tejido durante el desarrollo del huevo. Esto dio lugar a nuevas perspectivas sobre los acontecimientos de modelado, y proponemos que este método podría ser utilizado para explorar otros aspectos de la ovogénesis.
Hemos determinado varios pasos críticos en el montaje vertical éxito. Hemos encontrado que es necesario remover las cadenas ovariole completamente de la vaina durante la disección, y cámaras de huevos deseados deben ser cortados de la ovariole cadena. La falta de cámaras de huevos libres de la ovariole hace que sea difícil para recoger la cámara etapa de huevo correcto (paso 4.3). Le recomendamos trabajar con pequeñas cantidades de jalea de glicerina a la vez alícuotas en tubos. No caliente glicerina jalea de más de dos veces porque calentamiento repetido cambia su consistencia y evita que se solidifique correctamente (3.1). Use puntas con filtro para evitar la aspiración de jalea en pipetas. Permita jalea glicerina se solidifique en portaobjetos de microscopio durante al menos 8 horas a 4 ° C. El acortamiento de este paso hace que el montaje de las cámaras de huevos difíciles (3.6). Es importante asegurarse de absorber toda PBS-glicerol de huevo cámaras montadas (4.6). Si demasiado líquido está presente, evita que la capa superior de la jalea de glicerina se adhiera a la parte inferior. En este caso, las cámaras de huevo pueden flotar y cambiar de posición. Para obtener los mejores resultados de las imágenes, glicerina bloques jalea debe cortarse lo más cercano a la cara anterior de cámaras de huevos como sea físicamente posible (5,4). Demasiado jalea de glicerina en estalado disminuye la calidad de imagen debido a la mayor distancia entre la muestra y el cubreobjetos.
Hay algunas advertencias de muestras de montaje en gelatina de glicerina. Por un lado, aumenta la distancia entre la muestra y el objetivo. Esta distancia a gran aumento, especialmente durante el uso de un objetivo de aceite, puede crear problemas para enfocar la muestra, lo que puede resultar en la mala calidad de la imagen. Teniendo en cuenta esto, es muy importante para tallar los bloques de gelatina de glicerina muy cerca de las cámaras de huevos. Aunque la jalea de la glicerina es ópticamente transparente, lo hace difractar un poco de luz. Otra limitación es que la señal de anticuerpo puede ser reducida debido a una combinación de la distancia de trabajo del objetivo y el espesor de la jalea de glicerina. Un aumento de la concentración de ambos anticuerpos primarios y / o secundarios a veces puede ayudar a reducir este problema. Aunque varía por el anticuerpo, que normalmente adquirimos mejores imágenes usando el doble de la concentración de hormiga secundariaibody en imágenes en posición vertical en comparación con la cantidad utilizada en la formación de imágenes lateral estándar. No sabemos de alternativas a la glicerina jalea para el montaje de cámaras de huevos en posición vertical. Otros materiales tales como agarosa y poliacrilamida fueron juzgados pero toda la luz defracted más severamente, causando una pérdida de la claridad mientras que las imágenes. Por lo tanto, esta técnica de montaje es lo mejor que hay actualmente disponibles para su uso con el microscopio estándar.
Mientras nos centramos en las etapas de especificación celular frontera y el inicio de la motilidad, cámaras de huevos de diferentes etapas podrían ser utilizados en este protocolo con sólo unos pocos ajustes menores. Lo más importante, el calibre de la aguja se puede cambiar para manipular cámaras de huevos de diferentes tamaños y etapas de desarrollo. Para las etapas 7-10, una aguja de 30 G funciona bien porque las cámaras de huevos caben fácilmente en el bisel. Para cámaras anteriores etapa de huevo una aguja de calibre mayor (menor de bisel) se debe utilizar y de manera similar un menor calibre (bisel más grandes) se debe utilizar para después stcámaras de huevos de edad. Cualquier cosa en una etapa de desarrollo más antiguo sería demasiado grande para este indicador (4,3). También cualquier lado de la cámara de huevos se pueden obtener imágenes con esta técnica mediante la disposición del bloque de gelatina de glicerina de cámaras de huevos con el área de interés hacia el objetivo.
Montaje de pequeñas muestras soportados en gelatina de glicerina tiene el potencial de ser útil en varios contextos. Esta estrategia podría usarse para visualizar los diferentes tipos de pequeños tejidos fijados, de otros organismos, especialmente cuando sería insuficiente para examinar las muestras de sólo una perspectiva. Una vez que esta técnica se domina, puede ser usado para ver cámaras de huevos en cualquier ángulo deseado, dependiendo de cómo las cámaras de huevos se colocan en la gelatina. Este método permite vistas únicas, creando una mejor comprensión tridimensional de la organización celular. Formación de imágenes en posición vertical de las cámaras de huevo junto con la tinción de inmunofluorescencia permite la detección precisa de la proteínas y célula-célula contactos que no serían posibles en condiciones de montaje estándar. Tenemos la intención de utilizar este método en la cartografía de las interacciones célula-célula que permiten la fusión y desprendimiento de la agrupación de células frontera del epitelio. En este momento, la técnica de imagen vertical no se puede utilizar con muestras vivas, pero también estamos trabajando para superar este obstáculo. Creemos que este método también será aplicable al estudio de otros aspectos de la Drosophila ovogénesis, o podría adaptarse a imagen de otros tejidos pequeños en nuevos ángulos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
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