Introduction
Studie av Drosophila melanogaster har lämnat stora insikter i den genetiska regleringen av ett brett spektrum av fenomen. Framför allt har det skett omfattande forskning om utveckling av ägg, eftersom oogenes ger en lätthanterlig sätt att undersöka många olika utvecklingsprocesser, bland annat vävnads mönstring, cell polaritet förändringar, cellcykel växling, och translationell reglering 1,2,3,4. En viktig morfogen händelse under oogenes är specifikationen, förvärv av motilitet, och migrering av en uppsättning celler som kallas gränsceller (granskas i 5). Eftersom cellmigration är en viktig del av djur morfogenes, och eftersom den genetiska regleringen av denna process är väl bevarad, mekanismer som bestäms i flugor är sannolikt viktiga i andra sammanhang. Således undersöker vi den molekylära kontrollen av gränscellmigration. För våra studier har vi utvecklat en ny metod för att observera de främre poler hos utveckla ägg,där gränsceller uppstår, för att undersöka hur de utvecklas i detalj.
Inom äggstocken, ägg kamrarna vid olika utvecklingsstadier existerar längs kedjor kallas ovarioles, vilka är inneslutna i en tunn mantel (Figur 1A). Varje ägg kammare kommer att gå på att bilda ett ägg. Under oogenes måste flera olika celltyper utvecklas på ett samordnat sätt. Den D. melanogaster ägg kammare består av 16 bakterielinjeceller, varav en äggcell, omgiven av ett enda lager follikulär epitel 6. Ett litet antal specialiserade celler, som kallas polära celler, uppstår vid de främre och bakre poler epitel. De 6-8 gränscellerna har sitt ursprung i den främre epitel av ägget kammaren, framkallad av polar cellerna 5,7. I mitten av oogenes (etapp 9), gränscellerna lossnar från sina grannar och migrera mellan sjuksköterska cellerna att nå äggcellen vid den bakre delen av ägget kammaren 5,7. Denna rörelse måste skemedan gränsceller kvar i ett kluster kring två icke-rörliga polära celler, vilket gör detta en typ av kollektiv migrationscell. Framgångsrik migrering av gränsen cellkluster säkerställer god utveckling av micropyle av äggskal, vilket är nödvändigt för befruktning.
De främre polära celler instruera gränscell öde genom att aktivera en signaltransduktion kaskad. Polära celler utsöndrar en cytokin, oparat (UPD), som binder till en transmembranreceptor, Domeless (Dome), på angränsande follikelceller under etapp 8 av oocytutveckling 8,9. Bindningen av UPD orsakar Janus tyrosinkinas (JAK) att fosforylera Signal Givare och Aktivator för transkription (STAT) 8,10,11. STAT flyttar sedan till kärnan att aktivera transkription. Slow Gräns Celler (SLBO) är en transkriptionsfaktor som är en direkt transkriptions mål på STAT och krävs också för gräns cell migration 12. Sidoutsikt över ägg kammare indikerar thatt STAT verksamhet är reglerad i en gradient över den främre epitelet 8,11,13. Follikelcellerna närmast de polära cellerna har de högsta nivåerna av aktiverad STAT, sålunda blir de gränsceller och invadera intilliggande grodd-linje vävnad.
För att förstå hur gränscellerna specificeras inom och lossas från epitel, behöver vi för att observera hur vävnaden är organiserad. Om vi ser på ägg kammare från en främre-on perspektiv skulle vi förvänta oss radiell symmetri STAT aktivitet i follikelcellerna omger polar cellerna. En ändvy skulle också mer exakt visa skillnader i membranproteiner och gränssnitt cell-cell före och under lossnar än att jämföra celler i olika fokalplan. Eftersom ägg kamrarna är avlånga och fästa till varandra genom stjälkceller, de sätter sig på diabilder i sidled, vilket gör det svårt att observera den främre arkitekturen. Således mycket information om cellerna vid polerna av ägget kammaren harvarit härledas från sidovyer. Även om viss information kan erhållas genom algoritm 3-D rekonstruktioner av optiska sektioner, ljusspridning, fotoblekning och fattigare gränser upplösning i Z-axeln göra denna information mindre detaljerade och tillförlitliga i avsaknad av dyra tekniker som superupplösning mikroskopi 14 . Andra typer av avsnitt baserad avbildning (t.ex. elektronmikroskopi eller mikrotom sektione) kräver omfattande manipulation av vävnader, inklusive uttorkning, vilket ökar sannolikheten för artefakter. Således har vi utvecklat en ny metod för att bilden D. melanogaster ägg kamrar medan upprätt. Denna metod har redan visat sig användbar för att belysa hur rörliga celler ödesbestämda (se Representativa resultat och Manning et al, under översyn), och kommer sannolikt att bli mer allmänt värdefulla i studier av andra aspekter av oogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissekering av Ovarioles
- Överför cirka femton 2-4 dagar gamla kvinnliga flugor och några hanar till en ny fluga flaska livsmedel med tillsatt aktiv torrjäst. Använd bomull som en plugg för flaskorna, och tillsätt några droppar vatten till bomull för att hålla luftfuktigheten hög.
- Placera flaskan i ett 25 ° C inkubator för 14-16 timmar för att maximera antalet scenen 8-10 ägg kamrar.
OBS: Inkubationstiden varierar beroende på temperatur och önskad scen. - Förbered dissektion medier, 0,1 M KPO 4 och NP40 lösningar efter behov för nästa dag (se Material).
- Bedöva flugorna använder CO2, och placera i en dissektion mikroskop. Pipet flera droppar dissektion medier i varje hålighet i glas depression bild.
- Håll pincett i varje hand på ett ungefär 30 ° vinkel mot bordsskivan och orientera en kvinnlig fluga med vingarna ner. Med din icke-dominanta hand, plocka upp den kvinnliga med pincett, gripa henne på ennterior av buken, nära bröstkorgen, och dränka henne i dissektion media i depression bild (Figur 1A infälld).
- Med den andra pincett, ta tag i exoskelett vid ventrala bakre delen av buken och tränga igenom. Ta äggstockarna vid den bakre änden, sedan dra dem ut ur buken och placera in i färskt medium på den andra sidan av depression bild. (Figur 1A infälld). Undvik att dra isär tarmen. Kassera stommen.
- Upprepa med de andra kvinnliga flugor tills alla äggstockar dissekeras. Kasta hanarna.
- Med en pincett, håll en äggstock vid den bakre änden (nära de största ägg kamrarna), och med den andra handen använder en pincett för att nypa en av de mest främre ägg kamrar (germarium). (Figur 1A).
- Långsamt och stadigt, dra en ovariole kedja ur äggstocken manteln. Fortsätt att dissekera ut ovarioles individuellt tills alla önskade ägg kamrarna är removed.
- Upprepa steg 1,7-1,8 för alla dissekerade äggstockar.
- När du är klar, överföra ovarioles till ett 0,6 ml rör med hjälp av en plast överföringspipett.
- Låt ovarioles sedimentera till botten av röret, sedan vidare till fäst och färgningssteg.
2. Immunofluorescerande (IF) Färgning av Ovarioles
- Försiktigt bort dissektion media från ovarioles med en pipett. Glöm inte att ta bort eventuella ovarioles eller ägg kamrar. Lämna ca 50 pl ovarioles och dissektion medier.
- Lägg 50 pl 16% paraformaldehyd till 150 pl 0,1 M KPO4 buffert i ett rör, och tillsätt lösningen till ägg kamrar att fixa dem. Inkubera medan gunga i 10 min. VARNING: paraformaldehyd är giftigt.
- Ta bort fixativ och skölj två gånger med 0,5 ml NP40 tvättbuffert.
- Tvätta två gånger i 15 min vardera vid RT.
- Se standard IF protokoll 15 för efterföljande steg.
- Kortfattat, efter fixering, läggaprimära antikroppar på lämpliga spädningar och inkubera O / N vid 4 ° C. Tvätta i NP40 flera gånger, sedan lägga sekundära antikroppar (1: 200 spädningar).
- Tvätta flera gånger i NP40, sedan lägga DAPI (1: 1000) under 10 minuter, sedan upprepa tvättar. När IF-protokollet är klar, tillsätt 200 | il av 50% glycerol i PBS till ägg kammare och låt sitta vid RT i 2 h.
- Ta lösning, ersätta det med 70% glycerol i PBS, och täck med folie. Placera provet vid 4 ᵒC tills klar för montering. Samtidigt fortsätter du med steg 3.
3. Advance Beredning av Glycerin Jelly Slides
- Mät minst 4 ml glycerin gelé med hjälp av en spatel och fylla ett glas cellodling röret till halvvägs märket. Smält glycerin gelé i ett vattenbad vid 55 ° C under 30 minuter.
- Häll en liten droppe av glycerol, ungefär 300 pl, från stamlösningen på två objektglas. Med hjälp av en vävnad, spred glycerol i en tunn layer över vart och ett av objektglasen. Detta ger en bas och möjliggör enkel borttagning av glycerin gelé i steg 5.6.
- Skär av spetsen på en filtrerad 1,000 l pipettspetsen. Använd cut Pipettspetsen att överföra 1000-1500 pl varma glycerin gelé långsamt till varje objektglas. Var noga med att undvika bubblor.
- Låt glycerin jelly diabilder sitta under 5 min vid RT för att ställa in.
- Placera varje glycerin gelé bild i 60 mm × 15 mm petriskål och täck med plastfolie. Placera vid 4 ° CO / N. Eventuellt butiken glycerin gelé diabilder i upp till 5 dagar vid 4 ° C.
4. Monterings Egg Chambers
- Använda prover från steg 2,5, pipett flera 3 il droppar ägg kammare i 70% glycerol över en glycerin gelé slide. Fortsätt pipettering 3 l droppar tills alla ägg kamrarna är på denna bild. Se till att varje droppe innehåller minst tio ägg kamrar. Under tiden, värm ett odlingsrör glycerin gelé i en 55 ° C vattenbad.
- Placera glycerin gelé slide med ägg kammare under ett dissektion mikroskop. Justera förstoringen så att endast en droppe ägg kammare är i synfältet (Figur 1B).
- Med hjälp av en 30 gauge nål som en sked, plocka upp önskad scenen ägget kammare. Vid behov separata önskade ägg kammare från en ovariole kedja med hjälp av nålen som en kniv.
- För att undvika skräp som kan störa avbildning, överföra ägget kammaren till den andra glycerin gelé slide, med den främre vänd åt vänster (Figur 1E -1). Upprepa tills det finns minst sju ägg kammare uppradade i en kolumn (Figur 1C).
- Bilda nya kolumner med sju tills alla önskade ägg kammare överförs till den andra glycerin gelé slide.
- Riv en liten bit vävnad och twist. Använd detta för att absorbera överskottet PBS-Glycerol från ägg kamrarna genom att lätt vidröra var och en. Var noga med att inte ta bort ägg kamrar.
- Skär avspetsen av en filtrerad 200 mikroliter pipettspets. Använd detta för att överföra 150 l av glycerin gelé för att täcka alla kolumner av ägg kamrar.
OBS: Mängden glycerin gelé behövs för att täcka kolumnerna är baserad på ägg kammarsteg och antal kolumner. Belopp kan justeras. - Låt monterade ägg kammare sitta i 5 min vid RT tills det översta lagret av glycerin gelé är helt stelnat (figur 1D).
- Placera bilden i monterade ägg kammare i en 60 mm × 15 mm petriskål och täck med plastfolie. Förvaras vid 4 ° CO / N för att låta glycerin jelly skikten stelna tillsammans (plats i mörker om det finns misstankar om att fotoblekning).
5. Beredning av Egg Chambers för Imaging
- Placera bilden i monterade ägg kammare under ett dissektion mikroskop. Justera förstoringen så att endast en kolonn av ägg- kamrarna är i synfältet.
- Med hjälp av en 45 ° vinkel miniatyr skalpell, skär ett straight linje längs den högra sidan av den första kolumnen i ägg kamrar (nära den bakre sidan av ägget kamrarna). (Figur 1D-E)
- Därefter skär ovanför det första ägget kammaren upptill och under den sista ägget kammaren i kolonnen. Vid denna punkt pelaren ägg kamrar bör skäras på tre sidor.
- Med hjälp av en microknife, skiva längs den vänstra sidan av kolonnen, så nära som möjligt till den främre sidan av ägget kamrarna (Figur 1E -3).
- Pipettera 100 pl kall 1X PBT över klipp kolumnen.
- Använd en rund kanter spatel för att avlägsna överskottet glycerin gelé runt tre sidor av snittet kolumnen i ägg kammare och kasta, lämnar resten på bilden.
- Sätt spateln i snitt gjordes vid den främre sidan av ägg kamrar och separera kolumnen från den primära glycerin gelé block.
- Förbered prover för antingen inverterade (5.8.1) eller upprätt (5.8.2) mikroskopi.
- För inverterat mikroskop: Transfer tHan kolonn av äggprodukter kammare till ett täck med främre sidan av ägg kamrar nedåt. Upprepa steg 5,2-5,8 tills alla kolumner av glycerin gelé har tagits bort och monteras. Lägg ett par droppar 50% PBS-Glycerol på varje block av ägg kamrar för att hindra dem från uttorkning. Bild ägg kammare direkt på täck.
- För upprätt mikroskop: Överför kolonnen av ägg- kammare till ett mikroskopobjektglas med den främre sidan vänd uppåt. Upprepa steg 5,2-5,9 tills alla kolumner av glycerin gelé har tagits bort och monteras på objektglas. Lägg ett par droppar 50% PBS-Glycerol på varje block av ägg kammare och täckblock med en # 1 ½ täck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den upprättstående avbildningsmetod tillät oss att se direkt organisering av celler i främre follikulära epitelet i etapp 8. En allmän markör för follikelstimulerande cell öde, ögonen Frånvarande (Eya) protein, liksom kärn DNA-markör DAPI, visade även uttryck över detta område av celler, och visade att alla celler kunde ses med liknande färgningsintensitet (Figur 2B "). Proteiner som regleras som svar på cytokin UPD visade dock rörliga mönster och uttrycksnivåer. Polar celler släpper UPD apikalt före detta skede av utveckling av ägg 16,17, så vi förväntade STAT ska aktiveras radiellt om polar cellerna, vilket var ibland är fallet. Ofta, men observerade vi att målen för STAT nedströms, inklusive SLBO, hade mer komplexa uttryck mönster. Till exempel, GFP reporter för SLBO uttryck dök upp i de flesta, men inte alla, celler som omgav polar celler (Figur 2B, och se Manning et al under granskning). Vi märkte små skillnader i E-cadherin uttryck / lokalisering (Figur 2B), vilket kan speglar förändringar i vidhäftning, men mer arbete kommer att behövas för att kvantifiera och tolka detta resultat. Dessa subtiliteter inte var detekterbara genom lateral tredimensionell rekonstruktion av iscensatta ägg kammare (figur 2C-D). Skillnaderna i den apikala-basala axel follikelcellerna kan också särskiljas med användning av upprätt-metoden. Vi använde en reporter linje för ringen kanalen proteinet Visgun (VSG), som är närvarande i det apikala området av plasmamembran 18 (figur 3A). Upprätt avbildning bekräftad VSG uttryck detekterades i den apikala delen av follikelceller, nära den smalaste delen av de polära celler (figur 3B).
Vi har också funnit att den upprättstående avbildningsmetod fungerar bra för att visa den främre epitel i steg 9 ägg kamrar. Vid denna devellingsstadium, gränscellerna sammansmälter tillsammans runt polar celler (Figur 4A). Vi kunde observera dessa kompakte kluster använder slut på bildbehandling (Figur 4B-C). Som i scenen 8, fann vi liknande nivåer av Eya uttryck i alla epitelceller (visas ej), medan slbo -GFP samt aktiverad, kärnkraft STAT markerade rörliga gränsceller (Figur 4B och 4C). Lokalisering av FAS3 protein indikerade polarcell polar cellgränssnitt (Figur 4B). Dessutom, i båda stegen 8 och 9 kunde vi se de stora sjuksköterska cellerna, såsom indikeras med DAPI eller falloidin-färgning av kortikalt aktin (ej visad), vilket tyder på denna metod kommer också att vara användbara vid studier av könsceller eller bakterieceller -follicle cellinteraktioner.
Figur 1. Upprätt montering av Drosophila ägg kammarens. (A) Drosophila äggstocken indikerar ägg kammare, slida, och ovariole. Skildring illustrerar ställning pincett för att dra ovariole långsamt från äggstocken skidan. Inset visar positionering av fly för dissekering. Ventrala sidan av kvinnliga flugan är vänd uppåt. A-anterior, P-posterior. (BD) ordningen för montering ägg kamrar. (B) En liten droppe ägg kammare i 70% glycerol-PBS, betraktas under en dissektion stereomikroskop. Den gula pilen visar en ovariole kedjan; gul pilspets indikerar en individuell ägg kammaren. Röd pil visar kanten av Glycerol-PBS droppe. (C) Kolumner ägg kammare arrangerade på tunt lager av stelnad glycerin gelé. Gul pilspets indikerar en individuell ägg kammare. (D) Ett andra tunt skikt av smält glycerin gelé täcker ägget kammar kolumner för att bädda in dem. Gul streckad linje visar var nedskärningar ska göras efter O / N inkubation vid 4ᵒC. Röd pil indikerarkanten av det andra skiktet av glycerin gelé. Röda siffror anger ordningen skära ägget kammar kolumner (horisontell övre och undre snitt visas inte). Främre är till vänster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Imaging av den främre epitel av ett tidigt stadium 8 ägg kammare. (A) lateral vy av en etapp 8 långsam gränsceller (slbo) -genen reporter ägg kammare (genotyp: slbo -Gal4, UAS-mCD8-GFP) 19,20, färgades med DAPI och primära antikroppar som anges eller för slbo> GFP. Armadillo (ARM) är i farten homolog av β-catenin. Anterior (A) är till vänster, bakre (P) till höger. (BB ") End-on utsikt över ett ägg chamber. Tredimensionell rekonstruktion av Z-stack bilder av en scen 8 slbo- gen reporter ägg kammare monterad upprätt, färgas med primära antikroppar som indikeras. Magenta asterisker indikerar polära celler. DAPI markerar kärnorna. (B ') slbo> GFP uttrycks bara i de presumtiva gränsceller (SLBO). E-cadherin (E-CAD) är en adhesionsmolekyl lokaliserad till membranet och berikad i gränsceller. (B '') Ögon Frånvarande (Eya) hittas jämnt uttrycks i kärnan av alla follikelceller utom polära celler. (C) Standard lateral vy av en slbo -reporter steget 8 ägg kammaren färgades med DAPI (blå) och antikroppar mot GFP (SLBO, grön), ARM (röd), och FAS3 (vit). Inset visar axlarna: X-axeln är nedåt (grön pil), Y-axeln mot vänster (röd pil), och Z-axeln är mot betraktaren (blå) (D) för jämförelse med den nya tekniken. visar denna panel ett slut på-view creaTed genom en tre-dimensionell rekonstruktion, behandlas med Volocity programvara, med användning av en Z-stapel av laterala bilder av ägget kammaren som visas i C. Inset visar de svarvade axlar: X-axeln är nere (grön pil) är Z-axeln nu mot vänster (blå pil) och Y-axeln är mot betraktaren (röd). Individuella celler är suddiga på grund av låg upplösning i Z-axeln; alltså, den nya strategi som visas i B representerar en betydande bildförbättring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Jämföra proteinuttryck i sidled och främre domäner av follikulära epitelet i ett skede 8 ägg kammare. (A) Rekonstruktion av en lateral vy av en etapp 8 ägg kammare av visgun (VSG) -GFP reporter <sup> 21-23, färgades för antikroppar riktade mot GFP eller ARM (vit). DAPI markerar kärnorna i blått, och stora sjuksköterska cellkärnor är uppenbara. VSG lokaliserar till ring kanalerna i follikelceller (grön). (BB ') End-on utsikt över ett ägg chamber.Three-dimensionell rekonstruktion av ett Z-bunt med bilder av en scen 8 VSG-GFP reporter ägg kammare, färgas med primära antikroppar såsom anges. SLBO protein (röd) detekteras i både polära och gränscellkärnor. ARM markerar follicle cellmembranen och anrikas i gränsceller; DAPI etiketter kärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Imaging av tidiga stadium 9 ägg kamrar. (A) sidovy av ett tidigt stadium 9 slBo -reporter ägg kammaren. Gräns celler (grön) har klustrade inom den främre epitel (vit pil). BC) End-on utsikt över ägg kamrarna. Tredimensionell rekonstruktion av en Z-bunt med bilder från ett tidigt stadium 9 slbo- gen reporter ägg kammare, färgas med primära antikroppar riktade mot proteinerna som anges eller GFP. (B) slbo> GFP uttrycks i gränscellerna (grön) medan fasciclin 3 (FAS3, vit) lokaliserar högt till membranet mellan de två polära celler; DAPI markerar kärnor (blå). Magenta asterisker indikerar polära celler. (C) Både kärn (aktiverat) STAT och slbo> GFP uttryck finns bara i gränscellerna, medan E-cadherin (E-CAD) markerar membranen i follikelceller och DAPI indikerar kärnorna. Magenta asterisker indikerar polära celler. Färgningsresultaten visas individuellt för slbo> GFP (C ') och STAT (C' ') Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en metod för att montera och bild liten, utveckla ägg kammare från en slut på perspektivet. Vanliga tekniker för avbildning ägg kammare är optimerade för sidovyer och främst möjliggöra exakt visualisering av medio-lateral follikelcellerna när färgas med fluorescerande antikroppar. Användningen av Z-stackar eller 3-D rekonstruktioner hjälpmedel i visnings flera fokalplan, men är fortfarande otillräckliga för sub-cellulära upplösning av polerna på elliptiska ägg kammare (Figur 2D). Även om detta kan övervinnas delvis med de nyaste mikroskopitekniker såsom superupplösning som avbildar, är dessa metoder dyra och inte alltid tillgängliga. Vi har anpassat upprätt avbildningsprotokoll för Drosophila embryon 24,25 som skall användas för de mycket mindre ägg kamrarna. Det finns flera viktiga ändringar i metoden för att redovisa den mycket mindre storlek ägg kammare jämfört med embryon. En nyckelkomponent i den beskrivna tekniken är den fysiska separation individuella kammare, som inte krävs av embryon. En annan förändring är att använda en andra glycerin gelé slide under montering (4,4). Storleken på ägg kamrarna och deras fastsättning genom stjälkceller till andra ägg kamrar kräver manipulation med nålen och leder till förstörelse av glycerin gelé. Därför måste ägg kamrar överföras med en nål till en ny glycerin gelé slide för montering (4,5). Upprätt avbildning möjliggör visualisering av de områden suddiga genom sido eller horisontella vyer, avslöjar ny information om vävnaden organisationen under utveckling av ägg. Detta ledde till nya insikter om de mönstringshändelser, och vi föreslår att denna metod skulle kunna användas för att undersöka ytterligare aspekter av oogenes.
Vi har bestämt flera viktiga steg i framgångsrika upprätt montering. Vi fann att det är nödvändigt att ta bort ovariole kedjor helt från slidan under dissektion, och önskade ägg kamrarna måste skäras från ovariole-kedjan. Underlåtenhet att fria ägg kammare från ovariole gör det svårt att plocka upp rätt skede ägget kammare (steg 4,3). Vi rekommenderar att arbeta med små mängder glycerin gelé i taget genom alikvotering det till rör. Värm inte glycerin gelé mer än två gånger eftersom upprepad uppvärmning ändrar sin konsistens och hindrar den från att stelna ordentligt (3,1). Använd filterspetsar för att förhindra aspire gelé i pipetter. Tillåt glycerin gelé stelna på objektglas under minst 8 timmar vid 4 ° C. Förkortning detta steg gör montering ägget kamrarna svåra (3,6). Det är viktigt att se till att absorbera all PBS-glycerol från monterade ägg kamrar (4,6). Om alltför mycket vätska är närvarande, den förhindrar det översta lagret av glycerin gelé från att vidhäfta till botten. I detta fall kan ägg kamrar flyta och ändra läge. För bästa resultat bildbehandling, glycerin gelé block måste skäras så nära den främre sidan av ägg kamrar som är fysiskt möjligt (5.4). För mycket glycerin gelé på dettasidan minskar bildkvaliteten på grund av den ökade avståndet mellan provet och täckglas.
Det finns några varningar för montering prover glycerin gelé. För en, det ökar avståndet mellan provet och målet. Detta avstånd med hög förstoring, särskilt när du använder en olje objektiv, kan skapa svårigheter att fokusera på provet, vilket kan resultera i dålig bildkvalitet. Med tanke på detta är det mycket viktigt att mejsla ut glycerin gelé block mycket nära ägget kamrarna. Även om glycerin gelé är optiskt klar, det gör det defract lite ljus. En annan begränsning är att antikroppssignalen kan reduceras på grund av en kombination av arbetsavstånd av målet och tjockleken glycerin gelé. En ökning av koncentrationen av både primär och / eller sekundär antikroppar kan ibland bidra till att minska detta problem. Även om det varierar beroende på antikropp, förvärvade vi vanligtvis bättre bilder genom att använda dubbla koncentrationen av sekundära myraibody i upprätt avbildning jämfört med den mängd som används i standard lateral avbildning. Vi känner inte till några alternativ till glycerin gelé för montering ägg kammare upprätt. Andra material, såsom agaros och polyakrylamid prövades men alla defracted ljus mer allvarligt, vilket orsakar en förlust av klarhet medan avbildning. Således är detta monteringsteknik det bästa som för närvarande är tillgängliga för användning med standardmikroskop.
Medan vi fokuserat på de olika stadierna i gränscell specifikation och initiering av motilitet, kunde ägg kamrarna olika stadier användas i detta protokoll med endast några smärre justeringar. Viktigast kan mätaren av nålen ändras för att manipulera ägg kammare av olika storlekar och utvecklingsstadier. För stadier 7-10, arbetar ett 30 G nål bra eftersom ägget kamrarna lätt ryms i vinkel. För tidigare skede ägg kamrar en större nål (mindre avfasning) bör användas och likaså en mindre spårvidd (större avfasning) bör användas för senare ståldern ägg kamrar. Allt på en äldre utvecklingsstadium skulle vara för stor för denna spårvidd (4,3). Också någon sida av ägget kammaren kan avbildas med denna teknik genom att arrangera glycerin gelé block av ägg kammare med intresseområdet mot målet.
Montering små prover stöds i glycerin gelé har potential att vara användbar i flera sammanhang. Denna strategi skulle kunna användas för att visualisera olika typer av små, fasta vävnader från andra organismer, särskilt när det skulle vara otillräckligt för att undersöka prover från bara ett perspektiv. När denna teknik är behärskar, kan den användas för att visa ägg kamrarna i varje önskad vinkel, beroende på hur ägget kamrarna är placerade i gelé. Denna metod möjliggör unik utsikt skapar en mycket bättre tredimensionell förståelse av cellulär organisation. Upprätt avbildning av ägg kammare i samband med immunofluorescens antikropps färgning möjliggör exakt detektering av proteins och cell-cellkontakter som inte skulle vara möjligt under normala monteringsförhållanden. Vi planerar att använda denna metod för att kartlägga cell-cell interaktioner som medger sammansmältning och lossnar gränsen cellkluster från epitel. Vid denna tid, kan den upprätt bildteknik inte användas med levande prover, men vi arbetar också för att övervinna detta hinder. Vi räknar med denna metod kommer också att gälla för att studera på andra aspekter av Drosophila oogenes, eller skulle kunna anpassas till bild andra små vävnader vid nya vinklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
