Summary
يعرض هذا البروتوكول وسيلة لخلق حج القحف من جانب واحد كبير على المناطق الزمنية والجداري من الماوس القشرة المخية. وهذا مفيد خصوصا للتصوير في الوقت الحقيقي على مساحة شاسعة من الكرة الأرضية القشرية.
Abstract
حج القحف هو إجراء يقوم عادة لفضح الدماغ لإجراء التجارب في الجسم الحي. في مجال البحوث الماوس، معظم معامل الاستفادة من حج القحف صغيرة، وعادة 3 ملم × 3 مم. هذا البروتوكول يقدم طريقة لإنشاء إطار الجمجمة أكبر بكثير 7 مم × 6 مم تعريض أكثر من نصف الكرة المخية على الماوس القشور الزمنية والجداري (على سبيل المثال، bregma 2،5-4،5 مم، الأفقي 0-6 ملم). لإجراء هذه الجراحة، يجب إمالة الرأس حوالي 30 درجة والكثير من العضلات الزمنية يجب أن تراجع. ويرجع ذلك إلى كمية كبيرة من إزالة العظام، ويهدف هذا الإجراء فقط للتجارب الحادة مع الحيوان تخدير طوال الجراحة والتجربة.
والميزة الرئيسية لهذا الإطار الجمجمة الجانبي كبير المبتكرة هي توفير الوصول في وقت واحد إلى كل المناطق وسطي والجانبية من القشرة. ويمكن استخدام هذه النافذة الجمجمة من جانب واحد كبير لدراسة ديناميات العصبية بين الخلايا،وكذلك بين المناطق القشرية المختلفة من خلال الجمع بين متعدد القطب التسجيلات الكهربية، والتصوير من نشاط الخلايا العصبية (مثل التصوير جوهري أو خارجي)، والتحفيز علم البصريات الوراثي. بالإضافة إلى ذلك، كما يكشف هذا حج القحف كبير مساحة كبيرة من الأوعية الدموية القشرية، مما يسمح للتلاعب المباشر من الأوعية الدموية القشرية الجانبي.
Introduction
حج القحف هو إجراء القياسية المستخدمة من قبل علماء الأعصاب ليكشف عن جزء من الدماغ. منذ فجر الكهربية، وقد سمح حج القحف اختراقات غير مسبوقة في مجال علم الأعصاب. وقد أدى رسم الخرائط كثيفة من قشرة الدماغ مع أقطاب لفرضيات تجارب اختبار النظريات وبناء على هذه الخرائط. لقد دخلنا مؤخرا حقبة جديدة حيث يتم الاستفادة حج القحف لتصوير في الجسم الحي من تدفق الدم القشرية 1 و 2 و 3 و 4 العمارة الوعائية العصبية، مما يمكن التصور في الوقت الحقيقي من النشاط القشرية داخل المناطق المكشوفة 5 و 6 و 7. على الرغم من أن العديد من الدراسات تستخدم craniotomies جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير الضوئي في الجسم الحي لدراسة بنية ووظيفة الخلايا العصبية القشرية، الدبقية، وكورالأوعية الدموية tical 8، 9، المزيد من التحقيقات تقتصر التي كتبها مناطق صغيرة من قشرة يتعرض (ولكن انظر 10).
والغرض من هذا البروتوكول هو توفير وسيلة لخلق حج القحف الجانبي كبير، وفضح القشرة الدماغية من خط الوسط حتى العظم صدفي، وتتجاوز bregma وامدا. هذا حج القحف كبير يتيح العرض المتزامن للقشرات الجمعيات (خلف الطحال، الحزامي، والجداري)، والسيارات الابتدائي والثانوي، الحسية والبصرية، والقشرة السمعية. وقد اقترنت هذه الطريقة سابقا مع التصوير الجهد صبغة حساسة (VSDI) لمعرفة كيف تتفاعل متعددة المناطق القشرية مع بعضهم البعض خلال عفوية والناجم عن التحفيز النشاط القشرية 5 و 11 و 12. وتشمل الجوانب الأكثر تحديا من هذا الإجراء تحديد المواقع الرأسمن الحيوان، وتحديد لوحة الرأس، وتجنب نزف في حين فصل العضلات الزمنية من العظام الجداري. يجب أيضا أن تؤخذ الرعاية أثناء عمليات الحفر والجمجمة إزالة كما منحنيات الجمجمة في زاوية منحرف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكول التالية يتبع جامعة جنة رعاية الحيوان يثبريدج (ACC) المبادئ التوجيهية، وأجرى وفقا لمعايير المجلس الكندي للرعاية الحيوان (CCAC).
1. إعداد
- لفترات طويلة الدراسة، الأوتوكلاف جميع المستلزمات الجراحية فتح وضمان الحفاظ على عقم في جميع أنحاء الجراحة. إذا كانت هناك حاجة جراحات متعددة، الأوتوكلاف بين العمليات الجراحية.
- تأكد من وجود الكثير من العازلة الدماغ على يد (لا يقل عن 50 مل). ويتألف الحل من 134 ملي كلوريد الصوديوم والبوتاسيوم 5.4 ملي، 1 ملم هيدرات كلوريد المغنيسيوم، و 1.8 ملم ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم، و 5 ملي HEPES الصوديوم، ودرجة الحموضة متوازنة إلى 7.4 مع كلوريد الهيدروجين 5 M.
- ضع الماوس في غرفة الاستقراء وتخدير مع 3-4٪ الأيزوفلورين. اتبع مع 1،0-2،0٪ الأيزوفلورين للصيانة خلال عملية جراحية. مزيد من خفض الى ما يصل الى 0،4-0،8٪ خلال التصويرs = "كريف"> 5 ، 13 ، 14 ، 15 ، بشرط الحفاظ على التخدير السليم. هذه المستويات المنخفضة من التخدير تتطلب مراقبة اليقظة ومتكررة من الماوس (حوالي كل 5 دقائق) للتأكد من أنه لا يزال عديم الحركة إلى المحفزات مؤلمة.
ملاحظة: الجفاف يمكن أن تصبح مشكلة بسبب ارتفاع نسبة السطح إلى حجم الماوس وتفاقم بسبب الاستخدام المطول لل إيسوفلوران.- استخدام الحقن تحت الجلد من المياه المالحة، 0.1 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم، كل 1-2 ساعات. عندما رطب بشكل كاف، فإن الماوس التبول مرة واحدة كل 1 - 2 ساعة.
- مراقبة عن كثب الماوس لضمان التخدير متسقة في جميع أنحاء الجراحة والتصوير. لا تترك الماوس غير المراقب، ورعاية أنه لا يستعيد وعيه.
- نقل الماوس تخدير إلى رئيس حامل انشاء ومكان على لوحة التدفئة الحرارية منظم تعيين إلى 37 درجة مئوية. تأمين الحساء العلويح في حامل الأسنان.
- تدوير رأس الفأر نحو اليسار ما يقرب من 30 درجة لفضح الجانب الوحشي الأيمن من الرأس وتأمين رأس الفأر مع نهاية حادة من الحانات الأذن (الشكل 1A).
- تطبيق مرهم للعين لمنع جفاف القرنية.
- للحد من وذمة دماغية، حقن ديكساميثازون (4 ملغ / كغ) في العضل.
- مسح الجلد فوق منطقة العمليات الجراحية مع مسحات القطن مغموسة في 4٪ الكلورهيكسيدين (3 مرات) و 70٪ من الإيثانول (3 مرات). استخدام كل قطعة من القطن مرة واحدة فقط.
- دون القفازات الجراحية وتغطية الحيوان مع غلاف بلاستيكي لاصق. توفير مخدر موضعي عن طريق حقن من يدوكائين (8-10 ملغم / كغم، 2٪ ادرينالين) تحت الجلد فوق موقع حج القحف. الانتظار 3-5 دقائق للدواء لاستيعابها في الأنسجة.
2. إزالة الجلد والإنسحاب العضلات من الجمجمة
- أداء ما يقرب من جميع هذه الإجراءات أثناء عرض الجمجمة تحتتشريح المجهر (على سبيل المثال، 0.7 - 4.5X السلطة، تبعا للحالة).
- رفع الجلد 1 ملم تبقى من خط الوسط (خلف الأذن) مع ملقط وجعل شق أفقي صغير مع مقص جراحي.
- جعل 5-6 ملم قطع الجانبي نحو الأذن اليمنى، ثم قطع في نهاية منقاري من الرأس.
- عند نقطة شق الأولية، إدراج مقص وقطع 10 مم rostrally.
- قطع الجلد حول الأذن اليمنى وبالقرب من العين اليمنى لفضح الجانب الأيمن من الجمجمة والعضلات الزمنية. ضمان اوسع جزء من المنطقة المعرضة هو 7 مم على الأقل. تقليم الجلد مرة أخرى إذا تحتاج منطقة العمليات الجراحية لتمديدها.
- إصلاح الجلد حول الجرح عن طريق وضع بضع قطرات من بوتيل غراء سريع الغراء بين الجمجمة والجلد. ضمان الأنسجة وقد تم تجفيفها سابقا مع تطبيقها القطن يميل أو الأنسجة تدحرجت إلى زيادة فعالية لاصقة.
- باستخدام قطعة من القطن، وفرك السطحمن الجمجمة في حركة دائرية لإزالة السمحاق من الجمجمة. تأكد من أن أي يبقى من خلال تجفيف الجمجمة تماما.
- باستخدام مقص الربيع والملقط، فصل العضلات الزمنية من الجمجمة. قطع وسحب العضلات أفقيا حتى تصل إلى العظام صدفي (الشكل 1C). خذ الحذر الشديد على عدم الاضرار الوريد الصدغي السطحي الذي يمتد على طول مستوى العظم صدفي بالقرب من العين، وإلا نزيف قد يحدث.
- السيطرة على النزيف مع هلام الرغوة قبل غارقة في المخزن الدماغ. لنزيف خطير استخدام cauterizer الحرارة. إسقاط بوتيل غراء سريع الغراء على مواقع النزيف بعد العلاج مع cauterizer الحرارة. ضمان تجفف المنطقة سلفا باستخدام أدوات تطبيقها القطن يميل أو الأنسجة تدحرجت إلى زيادة فعالية لاصقة.
3. حج القحف
ملاحظة: الجراح يجب أن تظل الدؤوب خلال إزالة الجمجمة والجافية لتجنب تعقيدات لا داعي لها. يتم تضمين خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها ينبغي مضاعفات تنشأ.
- علامة موقع bregma إما مع علامة غيض غرامة أو قطع الثلاثي قطعة شريط صغير ونقطة زاوية في bregma (الشكل 2A) لتوجيه مناطق الدماغ الكامنة.
- قبل لصق لوحة الرأس ضمان الجمجمة جافة تماما. والجمجمة الهواء بسرعة الجاف بعد تطبيق رغوة جل غارقة في المخزن الدماغ، إذا كانت هناك حاجة مزيد من التجفيف، واستخدام مسحات القطن طرف. هذه الخطوة حاسمة لوحة الرأس تثبيت (الشكل 1B).
ملاحظة: إذا كان هناك يسار السمحاق على الجمجمة، أو إذا الجمجمة ليست جافة قبل الإلتصاق على لوحة الرأس، فإنه من المرجح أن فصل. إذا حدث هذا، إزالة بلطف لوحة الرأس والبدء من جديد. النزيف قد تحدث أثناء هذه العملية؛ السماح لبضع دقائق لتجلط، ومن ثم إزالة بلطف. لا ينصح هذه العملية أن تتكرر أكثر من مرتين. <لى> تطبيق إيثيل غراء سريع الغراء حول الحافة السفلية من لوحة الرأس 16، والغراء لوحة الرأس فوق المنطقة حج القحف (1D الشكل والشكل 2A). - ملء الفراغ الافتتاحية بين لوحة الجمجمة والرأس مع الاسمنت الأسنان ولم يتبق سوى منطقة حج القحف عرضة للخطر. انتظر الاسمنت الأسنان لتجف وتتصلب، وعادة 5-10 دقيقة (الشكل 2B).
- مرة واحدة يتم تعيين الاسمنت، وملء لفترة وجيزة البئر مع العازلة الدماغ والسماح لينقع لمدة 3-5 دقيقة. استخدام منديل ورقي لإزالة توالت عازلة الدماغ قبل الحفر (الشكل 2C).
- الخطوط العريضة لمنطقة العمليات الجراحية بتسجيله برفق سطح الجمجمة مع حفر الأسنان. استخدام الحفر الهوائية (لتعيين الحد الأقصى من 20 PSI)، مع FG ¼ لدغ، والتي تسيطر عليها مع متغير دواسة السرعة القدم.
- تتبع برفق الحفر على طول التهديف الأصلي لتعميقها، والبريدنسورينغ الحفر لا تخترق الجمجمة في الدماغ ( الشكل 2D ). يتناوبون كل بضع دقائق بين الحفر والسطح سطح الجمجمة مع الأنسجة المدرفلة رطبة. وهذا سوف يقلل التدفئة والتجفيف من الجمجمة من الاحتكاك الميكانيكية والتعرض لفترات طويلة.
ملاحظة: الجمجمة سوف الهواء الجاف بسرعة بعد تطبيق الرغوة هلام الرطب. إذا كان هناك حاجة لمزيد من التجفيف، استخدم مسحات غيض القطن.
الحذر: الجمجمة غير متساوية في سمك. على سبيل المثال، الحافة الزمانية الجدارية هي المنطقة الأكثر سمكا، في حين أن مناطق الجمجمة بالقرب من خط الوسط والمعالم السكواموسية رقيقة نسبيا. - أثناء الحفر، والتحقق دوريا عن التواء الجمجمة عن طريق الضغط بلطف على ذلك مع ملقط أو غير متحرك مثقاب. عندما يبدأ العظام في مشبك، وقف الحفر وتزج النافذة بأكملها في المخ المخزن المؤقت.
ملاحظة: إذا كان الدم يندفع من منطقة، قد تشير إلى أن الجافية قد تضررت. إذا كان هذا هو الحال، ضع سيمط الرطب رغوة جل فوق المنطقة ومحاولة لامتصاص الدم أثناء تطبيق الضغط بلطف على رغوة الجل مع مسحة القطن طرف. - الانتظار لمدة 5 دقائق على الأقل قبل إزالة الجمجمة لتليين العظام وتقليل فرصة الجافية التمسك العظام، مما يجعل عملية إزالة الجمجمة أسهل.
- تنفيذ عملية إزالة الجمجمة بينما هي غارقة في الجمجمة في المخزن الدماغ.
ملاحظة: إذا كان جزء من الجمجمة لا تزال تعلق بعناد، مشرط شفرة رقم 11 يمكن استخدامها لتسجيل بلطف الجمجمة. خذ الحذر الشديد لعدم ثقب نصل من خلال الجمجمة وفي الدماغ. - ابتداء من الحافة الأمامية، نقب بلطف الجمجمة فضفاض من الجافية باستخدام ملقط.
ملاحظة: في حال حدوث كمية صغيرة من النزيف أثناء عملية الإزالة الجمجمة، وإزالة المنطقة العازلة مع ماصة نقل أو حقنة، ثم قم باستبدال مع العازلة الجديد. - مرة واحدة في العظام واهية و"عائم" على الجافية، وقبضة بحزم العظام مع ملقط ورفع العظام منالجافية. ضمان العظام أبدا تخترق الدماغ.
- للسيطرة على النزيف، لفة الزاوية من الأنسجة إلى نقطة وإزالة معظم المخزن المؤقت من بئر الجمجمة. تطبيق بسرعة هلام رغوة، قبل غارقة في العازلة، إلى منطقة النزيف مع إضافة ضغط خفيف جدا مع مسحة طرف القطن.
ملاحظة: النزيف عادة ما يأتي من حافة العظام أو سطح الجافية. كلتا الحالتين طبيعيتين وسيتوقف النزيف سريعا إذا لم تتلف الأوعية الدموية الرئيسية. إذا استمر النزيف، قد يملأ الدم النافذة بأكملها، ويشكل ورقة جلطة على منطقة التصوير.- لإزالة ورقة الجلطة، واختيار بعناية قطع من الدم تخثر من منطقة التصوير مع ترك جلطة الدم سليمة حول مصدر تمزق الأوعية الدموية. احرص على عدم إزالة جلطات الدم من مصدر النزف لأن هذا قد يسبب المزيد من فقدان الدم. ري سطح الدماغ مع المخ المخزن لغسل أي الدم.
- الحرص على تجنب لمسأنسجة المخ الحساسة أو إضافة مواد غريبة إلى الدماغ. كرر حتى توقف النزيف، لحوالي 2-5 دقائق (الشكل 2E).
ملاحظة: عند هذه النقطة، حج القحف هو على استعداد لإعداد نافذة في الجمجمة (راجع الخطوة 5). إذا لزم الأمر، وإزالة الجافية قبل زرع نافذة الجمجمة (راجع الخطوة 4).
4. إزالة دورا
ملاحظة: إزالة دورا يتطلب الحذر الشديد، وربما يستغرق أكثر من 15 دقيقة.
- التعادل عازلة الزائدة من حج القحف. مع الحفاظ على سطح رطبة، والاستيلاء على قطعة صغيرة من الجافية مع ملقط والمسيل للدموع بلطف الجافية.
- استخدام ملقط ومقص الربيع المسيل للدموع بلطف وقطع الجافية.
- إسقاط أكثر عازلة الدماغ على سطح الدماغ لتعويم الجافية ومساعدته على فصل من الدماغ. يستمر حتى تتم إزالة جميع الجافية من موقع نافذة الجمجمة. عندما يقوم بشكل صحيح سوف تظهر الدماغ أن تكون نظيفة جدا مع BL متميزسفن العود وليس العيوب (قارن الشكل 2E مع 2F).
تحذير: يتم إرفاق بعض المناطق من الجافية إلى الشرايين الصغيرة على سطح الدماغ (على سبيل المثال، بالقرب من خط الوسط الأقرب إلى منطقة جمعية الجدارية)، وإزالة هذا يمكن أن تمزق الشريان. في مثل هذه الحالات، قد يكون من الأفضل ترك قطعة صغيرة من الجافية سليمة على أعلى شرين. وVSD قد لا تتمكن من اختراق تلك المنطقة الصغيرة، ولكن هذا هو المفضل إلى وجود نزيف كبير. - إصلاح سطح الدماغ في الاغاروز في أقرب وقت ممكن لتقليل حركة من نبض ومنع مزيد من تورم (راجع الخطوة 5).
5. إعداد الإطار الجمجمة
- رش غطاء زجاجي مع الايثانول 70٪ واستخدام اسطوانة الهواء إلى الجافة بلطف. ضمان زجاج نظيفة تماما مع عدم وجود بقع أو الغبار الحاضر.
- إعداد 1.3٪ الاغاروز عن طريق تسخين 200 ملغ من مسحوق الاغاروز المذاب في 15 مل من العازلة الدماغ. تعيين أفران الميكرافي إلى الأعلى والحرارة لمدة 10-15 الصورة في كل مرة، واثارة بلطف بين، حتى يذوب كل أجار.
ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات أو جزيئات موجودة، وهذه سوف تتداخل مع التصوير. - وضع ميزان الحرارة في الاغاروز الساخنة وتبريد الاغاروز أسفل إلى ما فوق ترسيخ درجة الحرارة (~ 40 ° C).
ملاحظة: تشغيل الماء البارد على السطح الخارجي للحاوية الاغاروز قد تسرع عملية التبريد. يحرك بلطف بشكل مستمر لضمان عدم وجود فقاعات أو الجسيمات موجودة. - على الفور قبل تطبيق أجار، وإزالة المنطقة العازلة الدماغ من البئر الجمجمة. وضع في الاغاروز مع ماصة نقل وإسقاط الاغاروز مباشرة على الدماغ. المكان بسرعة زلة تغطية على السطح وربط زلة غطاء مع الاغاروز قطرات على الزوايا.
6. القتل الرحيم
ملاحظة: الجراحين في تجربتنا، ويأخذ هذا الإجراء من ذوي الخبرة لا تقل عن 3 - 4 عمليات جراحية الممارسة لتحقيق أكبر من 90٪معدل النجاح. قد تتطلب الجراحين ذوي الخبرة أقل مزيد من الممارسة. خلال حج القحف أو durotomy، الدماغ قد تتكبد أضرارا، كما لو اللكمات الحفر من خلال العظام إلى الدماغ. بعض أضرار طفيفة على حافة حج القحف قد يكون مسموحا به. ومع ذلك، إذا لم يكن الدماغ تبدو "نظيفة" مع الأوعية الدموية مشرق الحمراء التالفة والقشرة البيضاء، قد تحتاج إلى إنهاء التجربة. وتشمل الأمثلة على الاستعدادات الفقيرة الذين يعانون من الأوعية الدموية الميتة، أو عندما يتم وضع علامة على القشرة مع الأوعية الدموية الممزقة أو التالفة. إذا كان أي من هذه العلامات موجودة، فإن التجربة المرجح تسفر عن بيانات عالية الجودة. إذا كانت الجراحة / تجربة ناجحة أم لا، الموت ببطء إنسانية الماوس عند الانتهاء من التجربة.
- تخدير عميق مع 3.5 في المائة على الأقل الأيزوفلورين. ثم، وإعطاء حقنة داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم في 300 مغ / كغ. من الناحية المثالية، إذا تم إدراج الإبرة في الكبد والموت سيكون سريعا جدا (<1 دقيقة).
- إذا كنت بحاجة نضح، تحقق من أن هذا الحيوان هو تخدير بعمق قبل الشروع (راجع الخطوة 1.3).
- بدلا من ذلك، إن لم يكن مطلوب نضح، الانتظار مدة لا تقل عن 5 دقائق ثم تحقق من أن الفأر هو ميت. تأكيد غياب التنفس، وضربات القلب، وكذلك عدم وجود سحب ألم وردود الفعل القرنية. أيضا، ومراقبة لشاحب زرقاء / تلوين البيض من الأطراف وسواد في الأوعية الدموية على القشرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لدراسة التفاعلات بين المناطق القشرية داخل نصف الكرة احدة، استخدمنا حج القحف كبيرة تمتد عبر الجيب السهمي و5-6 ملم الوحشي. شملت هذه النافذة الجمجمة الأساسي (السيارات، الحسية الجسدية، البصرية والسمعية) والثانوي (السيارات والمرئية)، وتكوين الجمعيات (خلف الطحال، الحزامي، جمعية الجدارية) القشور من نصفي الكرة الدماغ الأيمن (الشكل 3A). لهذا العمل كنا الجهد حساسة صبغ (VSD) والتصوير، والتي تعكس التغيرات في غشاء المحتملة 3. أن هذا البروتوكول يكون من المفيد أيضا لعرضية أخرى (مثل الكالسيوم 17 و 18 الغلوتامات التصوير) أو تجارب التصوير الجوهرية. عندما تحفيز hindlimb، forelimb، وشعيرات، والبصرية، أو النظام السمعي من الفئران تخدير بخفة باستخدام 0.5٪ الأيزوفلورين، لاحظنا أنماط إجماع الاستقطاب القشرية (> الشكل 3B). وتمشيا مع الدراسات السابقة 5، 19، 20، 21، 22، وجدنا أن التحفيز عن طريق اللمس وجيزة من C2 برميل قشرة أدى إلى تنشيط مناطق الحسية الجسدية الأولية، فضلا عن "الجزر" من الاستجابات في المجالات ذات الصلة وظيفيا. على سبيل المثال، القشرة الحركية الأولية (M1) أو التمثيل الثانوي من القشرة الحسية الجسدية (S2، الشكل 3Bi). وأدى واحدة 1 مللي ثانية لهجة نقطة (25 كيلو هرتز) التحفيز لتفعيل القشرة السمعية الأولية (A1) حوالي 20 مللي ثانية بعد التحفيز السمعي (الشكل 3Bii). خلال الألف القليلة المقبلة، والاستقطاب تنتشر عبر القشرة السمعية وتمريرها إلى القشرة الحسية الجسدية الثانوية المجاورة. ما يقرب من 25 مللي ثانية بعد ظهور لهجة، فإن الاستقطاب القشرية الثانوي تظهر، وتقع 1.07؛ 0.2 مم وسطي و 1.9 ± 0.1 مم الخلفي نسبة إلى bregma (ن = 9 الفئران). وهذا هو ما يقرب من موقع منطقة جمعية الجدارية (منطقة التجارة التفضيلية). إشارة VSD ثم نشر إلى منطقة خط الوسط حيث توجد أخرى مناطق جمعية القشرية بما في ذلك خلف الطحال (RS) والقشرة الحزامية (CG). ولذلك، أدى التحفيز السمعي إلى تفعيل مجالين رئيسيين منفصلة، والتي من السفر موجات من VSD انتشار الاستقطاب إلى مساحة أكبر داخل القشرة خط الوسط. التحفيز البؤري للعين المقابل مع الأخضر 1 مللي الصمام النبض، أدى إلى تنشيط القشرة البصرية الأولية خلال 40 مللي ثانية (الشكل 3Bv). وأعقب هذا التنشيط الرئيسي للقشرة البصرية من خلال: (1) التوسع المكاني لVSD الاستقطاب في المناطق المجاورة تقع بشكل إعلامي، وأفقيا، وسابقة لمنطقة تفعيلها الأولية؛ (2) الاستقطاب في منطقة القشرية وسطي الثانية ما يقرب من 50 مللي ثانية بعد التحفيز (ن = 8 تجارب) تقع على طول سا خياطة gittal. وكان هذا على غرار التحفيز الحسي من forelimb (الشكل 3Biii)، hindlimb (الشكل 3Biv)، C2 الطولي، أو الاختبار. ردود VSDI أثار من التحفيز الحسي للforelimb، hindlimb أو الاختبار تفعيلها في البداية القشور الحسية الأولية منها، يعقبه انتشار متباين الخواص من النشاط، وكذلك تنشيط خط الوسط من القشرة حول 20 - 40 مللي ثانية بعد التحفيز. وكانت هذه النتيجة مشابهة لردود من التحفيز البصري والطولي. نشر من النشاط الحسي-أثار على طول هذه المسارات خط الوسط وتفعيل المتكرر لنفس المناطق من حيث نوع النشاط العفوي 6 قد يوحي بأن هذه المناطق هي المحور المركزي لجوهر اتصال من القشرة الماوس، حيث المعلومات الحسية قد دمج مع النشاط القشرية من تلقاء أنفسهم.
2fig1.jpg "/>
الشكل (1). إعداد الجراحية والتحضير. وحلق الرأس (A) الفأر، تطهير، استدارة نحو 30 درجة التعرض الوحشي، وتأمين مع نهاية حادة من الحانات الأذن. يتم تسليم مخدر الأيزوفلورين عبر قطعة الأنف وحامل الأسنان. يتم تغطية الفأر مع لاصقة النفس غلاف بلاستيكي لزيادة العقم والدفء. (B) عن قرب الجلد تظهر والسمحاق إزالتها من لوحة الجمجمة الجدارية، والعضلات الزمنية هي لم تمس. (C) والعضلات الزمنية تتم إزالة فضح لوحة الزمنية والعظام صدفي، لاحظ الوريد السطحي غير التالفة. (D) وقبل التثبيت، يتم وضع لوحة الرأس في المكان الصحيح مع الشمع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ن الصفحات = "1"> 
الشكل 2. خطوة بخطوة الإجراء الجراحي. ويرد (A) ولوحة الرأس في الجمجمة مع الغراء إيثيل غراء سريع في الأمامي والخلفي المواقع. لاحظ موقع bregma (قطعة سوداء من الشريط الثلاثي). (B) تم إعداد نافذة في الجمجمة عن طريق تطبيق الاسمنت الأسنان سميكة بين رئيس لوحة والجمجمة. لاحظ أن bregma وتبقى معالم صدفي مرئية. يتم إضافة عازلة الدماغ (C) وبعد التجفيف من الاسمنت لتليين الجمجمة ولمنع التصاق الجافية. وهناك الأنسجة توالت تساعد إزالة عازلة الدماغ قبل الحفر. (D) وقد سجل حواف حج القحف. ملاحظة ما ينظر الأوعية الدموية أكثر سهولة من خلال العظام ضعيفة بالقرب من حواف الاسمنت الأسنان. وكانت (E) لوحات الجدارية والجمجمة الزمنية ازالتهاإد والجافية مرئية. لاحظ عيوب الدم على الجافية من نزيف بسيط، وهو أمر طبيعي. الفحص الدقيق تحت 2 - 4X التكبير سوف تكشف طبقتين من الأوعية الدموية، واحدة في الجافية والآخر في الحنون. (F) يتم إزالة الجافية وكشف عن القشرة البكر. الأوعية الدموية بيال هو أحمر مشرق مع عدم وجود العيوب الحالية. لاحظ القطع الضالة من الجافية الملونة البيضاء على حواف النافذة الجمجمة. في هذا المثال، كان هناك نزيف جافية طفيفة في الجزء الخلفي من النافذة الجمجمة، التي تجلط بسرعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 . أنماط فريدة من نوعها والتوافق الإجماعي خلال أشكال متعددة من التحفيز الحسي. < / قوي> (A) رسم تخطيطي للحج القحف من جانب واحد تبين المناطق القشرية المصورة. (B) صورة مجهرية من حج القحف من جانب واحد واسعة مع bregma المشار إليها بواسطة دائرة بيضاء في كل صورة. وتظهر أنماط التنشيط القشرية في الماوس تخدير مع isoflurane (0.5٪) بعد (ط) التحفيز (STIM) من الخط الطولي C2 المقابل، (ب) التحفيز السمعي، (ج) تحفيز forelimb المقابل، (د) تحفيز hindlimb المقابل و (ت) التحفيز البصري للعين المقابل مع ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED). كان هناك تفعيل خط الوسط بعد كل أشكال التحفيز الحسي (السهام البيضاء) في 10 - 25 مللي ثانية بعد تنشيط القشرة الحسية الأولية. الردود هي متوسط 20 المحاكمات. الصورة الثانية من اليسار في الصف الثاني (ب) تشير الأمامي (A)، الخلفي (P)، وسطي (M) والجانبية الاتجاهات (L). التعديل بإذن من مهاجراني، وآخرون، 2013.p_upload / 52642 / 52642fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول مبتكرة لنافذة الجمجمة كبير يمكن التصوير في وقت واحد على المناطق الزمنية والجداري من القشرة الدماغية. جنبا إلى جنب مع التصوير الضوئي، فإنه يمكن أن يساعد في الكشف عن ديناميات العصبية داخل المناطق القشرية خلال النشاط العفوي والناجم عن التحفيز. كما يعرض هذا حج القحف توسعية امتداد واسع من شبكة الأوعية الدموية القشرية، بما في ذلك نهاية القريبة من الشريان الدماغي الأوسط (MCA)، مما يتيح في مجال التصوير المجراة من تدفق الدم والتلاعب المباشر للسفن الجانبية لنماذج الدماغية. هذه التقنية سوف تكون ذات فائدة كبيرة للخطوط وضعت مؤخرا من الفئران معربا عن الجهد ومؤشر الكالسيوم البروتينات 23. هذه الفئران توفر ميزة العملية لتجاوز الحاجة لاحتضان الجهد الأصباغ الحساسة على القشرة. هذه الأصباغ خارجي يستغرق وقتا طويلا لاختراق كاف أنسجة المخ (~ 60-90 دقيقة)، وتقتصر التي سميتها خفيفة. craniotomies كبير أيضااستخدمت سابقا لدراسة دماغ الفئران النامية VSDI 11. الفئران حديثي الولادة لها رأس أكبر من ذلك بكثير وغير قابلة للمقارنة في الحجم مع فئران بالغة. هذا يتيح للباحثين فرصة فريدة لدراسة المشاكل التنموية في علم الأعصاب، وإن لم يكن مع الفئران المعدلة وراثيا.
القيود الرئيسية لهذه الطريقة هي عدم قدرة التجارب المزمنة. انحناء الجمجمة يجعل عملية الحفر أكثر صعوبة وتستغرق وقتا طويلا من craniotomies أصغر. لهذا حج القحف كبير، فمن الأهمية بمكان لوضع الرأس مع المعالم خياطة وصدفي المركزية لتكون موازية لطائرة تركيز العدسة. في حين يتوقع بعض التشويه من الدماغ من انحناء في المخ، والتغلب على هذه من خلال التركيز في الطبقات السطحية للقشرة. وخففت هذه المشكلة أبعد من ذلك الحصول على العديد من التكرار من التحفيز والمتوسط. وباختصار، لدينا تقنية حج القحف كبيرة هي على نطاق واسع التطبيقlicable لدراسة المشاكل الحالية في علم الأعصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) اكتشاف غرانت # 40352، حرم ألبرتا لبرنامج كرسي الابتكار وبرنامج بحوث الزهايمر ألبرتا إلى MHM، وNSERC CREATE في BIF زمالة الدكتوراه وAIHS الزمالة العليا لMK. نشكر بو مين وانغ لتطوير هذا البروتوكول والتدريب الجراحي، وبهرو ميرزا آغا ودي شاو لتربية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating Pad | FHC | 40-90-2 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2 or more pairs are recommended |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00, 15000-10 | 1 pair should be designated for dura removal |
| Jet tooth shade powder | LANG Dental | Jet Tooth Shade Powder | to be mixed with the Jet Liquid |
| Jet tooth shade liquid | LANG Dental | Jet Tooth Shade Liquid | to be mixed wihth the Jet Powder |
| Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389 | Midwest Dental | 385201 | |
| Agarose Powder | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Gelfoam | Sinclair Dental Canada | Pfizer Gelfoam | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Centre Ltd | 124125 | |
| Lidocaine 2% Epinephrine | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125299 | |
| Dexamethazone 5 mg/mL | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125231 | |
| Butyl cyanoacrylate glue (VetBond) | Western Drug Distribution Centre Ltd | 12612 |
References
- Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11759-11764 (2009).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5 (11), 874-885 (2004).
- Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12670-12675 (2010).
- Mohajerani, M. H., et al. Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections. Nat Neurosci. 16 (10), 1426-1435 (2013).
- Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice. J Neurosci. 30 (10), 3745-3751 (2010).
- Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio. J Neurophysiol. 98 (1), 502-512 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 449-463 (2006).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
- Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Eur J Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
- McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat. J Neurosci. 32 (32), 10982-10994 (2012).
- Sweetnam, D., et al. Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke. J Neurosci. 32 (15), 5132-5143 (2012).
- Yin, Y. Q., et al. In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia. Neural Regeneration Research. 11 (12), 1951-1955 (2016).
- Sharp, P. S., et al. Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime. Scientific Reports. 5, 12621 (2015).
- Kyweriga, M., Mohajerani, M. H. Optogenetics: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kianianmomeni, A. 1408, Humana Press Inc. 251-265 (2016).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Vanni, M. P., Murphy, T. H. Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex. J Neurosci. 34 (48), 15931-15946 (2014).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs. Nat Commun. 6, 7738 (2015).
- Lim, D. H., et al. In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas. Front Neural Circuits. 6, (2012).
- Ferezou, I., et al. Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice. Neuron. 56 (5), 907-923 (2007).
- Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
