3'非翻訳領域(3'UTRs)(3'LIFE)の機能的要素の発光同定は、miRNAまたは他の調節因子による3'UTRの機能調節を特定する技術です。このプロトコルは、96ウェルトランスフェクションやルシフェラーゼアッセイなどのハイスループット手法を利用して、機能的抑制のための数百の推定相互作用をスクリーニングします。
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この記事について
サマリー
要約
の3'UTR中の機能要素の発光識別（3'LIFE）は、照会の3'UTRの何百もの配列内の特定のmiRNAの標的の迅速な同定を可能にします。標的の同定は、miRNAが標的との機能的読み出しを与え、翻訳出力を測定することによって、mRNAレベルでの結合を検出するデュアルルシフェラーゼアッセイに基づいています。 3'LIFEが可能でコスト効率のゲノムワイドな画面を作り、非独占バッファーと試薬、および公的に利用可能なレポーターライブラリを使用しています。 3'LIFEは、標準的な実験室の設定のいずれかで行うか、液体処理ロボットや他の高スループットの計測器を使用してスケールアップすることができます。私たちは人間の96ウェルプレート中でクローニングの3'UTR、および2つのテストのmiRNAのデータセットを使用してのアプローチを例示し、及びmiR-10B-7Cてみましょう 。我々は、96ウェルフォーマットにおいてDNAの調製、トランスフェクション、細胞培養およびルシフェラーゼアッセイを行い、データのためのツールを提供する方法を示し分析。結論3'LIFEで体系的、迅速、高い再現性であり、かつ高い信頼性目標を識別します。
概要
この方法の全体的な目標は、検出し、正確に高スループットでマイクロRNA（miRNAの）ターゲットをマッピングすることです。 miRNAは、長さが約22ヌクレオチドの内因性の非コードRNAです。転写および処理に続いて、成熟miRNAは、タンパク質複合体中に組み込まれる（RISC）、複雑なRNA誘導サイレンシングと呼ばれます。各miRNAは、翻訳抑制またはmRNA切断1のいずれかで得られた、主にメッセンジャーRNAの3 '非翻訳領域（3'UTRを）（mRNAを）に位置要素を標的とするためにRISCを誘導します。 miRNAは、標準的なワトソン - クリックしてGに基づいて、標的部位を認識する：Uは、塩基対形成をウォブルし、本質的に縮重している、複数のミスマッチ塩基対を含有し、領域を膨らみました。多くのmiRNAが広く、彼らは生物学的役割の多様な範囲を再生する人間2,3に植物から保存されています。後生動物ではmiRNAは、細胞運命の決定4、発生のタイミング5を含む複数の生物学的プロセスに影響を与えることができます、および頻繁に組織特異的な発現パターン6,7を示します。誤発現のmiRNAは、標的遺伝子の機能のみに基づいて細胞の挙動に大きな影響を持つことができ、異常な遺伝子調節をもたらすことができます。このように、miRNAは、神経変性8,9、糖尿病10及び
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プロトコル
1.細胞培養（トランスフェクション前に24〜48時間）
- トランスフェクション前の種子に対して24〜48時間、96ウェルプレートの数に基づいて、HEK293T細胞の十分な量は、トランスフェクトされます。
注：一貫性のあるトランスフェクションのために、十分な密度でプレート細胞は急速な分裂を優先するように、まだトランスフェクションの時点で以上70〜90％の集密度になりません。 - 各96ウェルプレートは、（リザーバとマルチチャンネルピ ペットの使用を考慮するためにウェルあたり75,000細胞、およびプレートあたり120ウェル）9×10 6個の細胞を必要とします。 HEK293細胞（典型的には〜20時間）の倍加時間を計算し、そしてトランスフェクションの時点で少なくとも9×10 6個の細胞を得るために適切な数の細胞を播種。新しいプレートを再シードするために残りの細胞の〜10％、〜90％の集密度に増殖させた場合、145ミリメートルの円形培養プレートは、典型的には、3の96ウェルトランスフェクションのために十分です。
トランスフェクションの前に2.準備
_content ">注：これらの試薬の準備に時間がかかる可能性があるため、ステップ2.0から2.2のバッファとプラスミドDNAの調製は、トランスフェクション前に日に行われるべきです。- 3....
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結果
照度計の出力ファイルには、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の両方の生の測定値が含まれています。と- MangoneラボのWebサイト（から入手可能な「3'LIFE多分析」スプレッドシート-この生の形式は、「単板分析3'LIFE」と互換性がありwww.mangonelab.com ）。単板解析スプレッドシートを自動的にホタル/ ウミシイタケ比を計算し、適切な陰性対照を各miRNAを正規化し、各プレートを横切っ抑圧値を正規化します。このスプレッドシートは自動的に低ウミシイタケルシフェラーゼシグナルでウェルを特定し、陰性対照と比較して抑制を示す井戸を強調表示され、全体のプレート（ 図2）全体で抑制の手段を提供します。統計分析の詳細な説明のための24を参照してください。
複数の複製を分析することができますD「多分析」スプレッドシートを使用。各反復は、並べて比較し、データの.......
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ディスカッション
3'LIFEアッセイは、高スループットでの3'UTR中の機能のmiRNAのターゲットを識別します。このアッセイは、実験的に興味のあるmiRNAのための推定上の多数のターゲットを特定したい研究者のために有用です。アッセイがmiRNAの標的の機能的尺度を提供し、単一のmiRNAに対する3'UTR ::シングルレポーターのバイナリテストが自信を持って取り組むことができるという点で、3'LIFEアッセイは、3'UTR駆動制御のために照会するための強力なアプローチであります個々の遺伝子のターゲティング状態。このアプローチを検証するために、我々は275の3'UTRのパネルをスクリーニングし、2種のmiRNAに対して、 聞かせ-7C及びmiR-10bは 、このライブラリ内の10検証済みの標的遺伝子が含まれています。これら10個の遺伝子のうち8人は弾圧24を示しました。我々はまた、未検証のバイオインフォマティクス予測ターゲットの重要な濃縮、そして私たちのトップヒットのうち、正規のシード要素を含む予期せぬの3'UTRを観察し、SUG3.......
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開示事項
この研究は、アリゾナ州立大学のリベラルアーツアンドサイエンス学部とバイオデザイン研究所、およびNIH探索的/発達研究助成金1R21CA179144-01A1からの資金によって支援されています。
謝辞
アドバイスと議論をしてくれたStephen Blazie、Karen Anderson、Josh LaBaerに感謝します。Karen Anderson、John Chaput、Josh LaBaerは試薬と機器を共有し、Michael GaskinとAndrea Throopは技術的なアドバイスとプロトコルを提供してくれました。ジャスティン・ウォルターはマーハー奨学生であり、マーハー家の寛大な支援に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬 | |||
| グリシルグリシン | Σ | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Σ | P2222 | |
| EGTA | Σ | E3889 | |
| ATP | Σ | FLAAS | |
| DTT | Σ | D0632 | |
| MgSO4 | Σ | M7506 | |
| CoA | シグマ | C4282 | |
| ルシフェリン | シグマ | L9504 | |
| NaCl | シグマ | S7653 | |
| Na2EDTA | シグマ | E0399 | |
| K H2 P O4 | シグ | マ 1551139 | |
| BSA | シグマ | A2153 | |
| NaN3 | シグマ | S2002 | |
| セレンテラジン | シグマ | C3230 | |
| PBS/HEPES | コーニング | 21-040-CV | |
| DMEM | シグマ | D5546 | |
| FBS | シグマ | F2442 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | シグマ | P4333 | |
| トリプシン | T2600000 | ||
| 消耗品 | |||
| MaxiPrep キット | プロメガ | A2392 | |
| 96ウェルミニプレッププレート | Pall | 8032 | |
| 96ウェルシャトルプレート | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
| インスツルメンツ | |||
| 96ウェル GloMax プレートリーダー | Promega | E9032 | |
| Biomech FX リキッドハンドラーロボット | Beckmann | A31842 | |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
| 96ウェルシャトルシステム | Lonza | AAM-1001 | |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
参考文献
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (680....
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再版と許可
