Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié
Summary
Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.
Abstract
Analysant les réactions physiologiques des neurones sensoriels olfactifs (OSN) lorsqu'elles sont stimulées par des ligands spécifiques est essentiel de comprendre la base de comportements olfactifs moteur et leur modulation. Ces propriétés de codage dépendent fortement de l'interaction initiale entre les molécules d'odeur et le récepteur olfactif (OU) exprimées dans les ARS. L'identité, la spécificité et le ligand spectre du exprimés ou sont critiques. La probabilité de trouver le ligand de l'OU exprimé dans un OSN choisi au hasard dans l'épithélium est très faible. Pour relever ce défi, ce protocole utilise des souris génétiquement marquées exprimant la protéine fluorescente GFP sous le contrôle du promoteur des RUP définies. ARS sont situés dans un épithélium serré et organisé garniture de la cavité nasale, avec les cellules voisines influencer leur maturation et la fonction. Nous décrivons ici une méthode pour isoler un épithélium olfactif intact et enregistrer par patch-clamp enregistrements les propriétés des ARS expressing récepteurs olfactifs définies. Le protocole permet de caractériser les propriétés de la membrane OSN tout en maintenant l'influence du tissu voisin. Analyse des résultats de patch-clamp donne une quantification précise de ligand / ou des interactions, des voies de transduction et de la pharmacologie, les propriétés de codage de ARS et leur modulation au niveau de la membrane.
Introduction
Les neurones sensoriels olfactifs (OSN) représentent la première étape de la perception olfactive. Situé dans l'épithélium olfactif tapissant la cavité nasale chez les rongeurs, ils transforment les informations chimique de substances odorantes dans des potentiels d'action envoyés par leurs axones dans le cerveau. Pour mieux comprendre les mécanismes de codage olfactif, il est nécessaire de caractériser les propriétés de transduction et membranaires de ARS. Jusqu'à récemment, la plupart des techniques utilisées pour caractériser les propriétés des ARS de mammifères ont été effectuées sur dissocié ARS 4.1. Le processus de dissociation utilise divers (c.-à-enzymes) des procédés mécaniques et chimiques pour libérer les ARS de leur environnement. Ces processus induisent un faible nombre de cellules disponibles pour les enregistrements. Ce faible nombre peut être encore plus critique dans le cas des cellules GFP étiqueté. La dissociation supprime également les interactions locales de cellule à cellule entre les ARS et d'autres cellules de l'épithélium olfactif qui peuvent améliorer SURVIVal et la modulation des propriétés de ARS. Afin de contourner la procédure de dissociation, une préparation intacte 5 a été développé.
Chaque OSN exprime un récepteur olfactif (OU) choisi parmi une grande famille multigénique 6. Il ya ~ 1000 RUP exprimées dans la principale épithélium olfactif chez la souris. En raison du grand nombre d'OR dans les animaux de type sauvage, les chances d'enregistrer ARS exprimant le même OU sont très faibles. Pour surmonter ces limitations, les souris de gènes ciblés sont disponibles dans lequel tous les ARS exprimant une personne identifiée ou sont étiquetés avec une protéine fluorescente 7-9. Ces ARS marquées ont été utilisés pour faire l'analyse fonctionnelle dans les préparations dissociées 7,10,11 avec les inconvénients mentionnés plus haut. Une préparation de l'épithélium intact 5 de souris génétiquement marqués contourne donc sur ces questions. Il permet le suivi de l'activité des ARS exprimant RUP précisément définies dans un environnement aussi près dans vivo que possible. En outre, les enregistrements de patch-clamp de ARS permettent également une analyse précise des propriétés de la membrane, transduction voie pharmacologie, ligand / ou des interactions. Tous ces sujets peuvent difficilement être analysées à l'aide des enregistrements extracellulaires. Nous avons utilisé cette technique pour surveiller les réponses des ARS exprimant les récepteurs olfactifs SR1 et MOR23 12,13. La faisabilité de la technique a été confirmée par d'autres groupes sur MOR23 exprimant ARS 14 ainsi que sur les autres RUP exprimant neurones 15,16. Le suivi d'une population définie de ARS peut conduire à l'analyse de leurs propriétés dans de nombreux contextes différents tels que le développement 14, 17 vieillissement, odorant induite plasticité 18, et le rôle des variations de la séquence du récepteur olfactif de l'odeur de codage 15. Ce protocole fournit ainsi un outil puissant pour surveiller les propriétés fonctionnelles des ARS définies au niveau de la membrane.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité de ce protocole pour surveiller correctement les propriétés des ARS en bonne santé dépend fortement de la qualité de la préparation. Par conséquent, les étapes de dissection sont critiques. D'abord, il est essentiel de prêter attention à la qualité (pH, osmolarité), l'oxygénation et la température (glace-froid mais non congelé) du milieu de dissection. Deuxièmement, la manipulation de l'épithélium avec des outils de dissection doit être aussi limité que possible pour éviter …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil Régional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Université de Bourgogne (BQR program).
Materials
| heavy equipment | |||
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| recording electrodes /system | |||
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | warner instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride di hydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| MethylSulfoxide | Sigma-Aldrich | 47,135-6 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
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