Abstract
Analysant les réactions physiologiques des neurones sensoriels olfactifs (OSN) lorsqu'elles sont stimulées par des ligands spécifiques est essentiel de comprendre la base de comportements olfactifs moteur et leur modulation. Ces propriétés de codage dépendent fortement de l'interaction initiale entre les molécules d'odeur et le récepteur olfactif (OU) exprimées dans les ARS. L'identité, la spécificité et le ligand spectre du exprimés ou sont critiques. La probabilité de trouver le ligand de l'OU exprimé dans un OSN choisi au hasard dans l'épithélium est très faible. Pour relever ce défi, ce protocole utilise des souris génétiquement marquées exprimant la protéine fluorescente GFP sous le contrôle du promoteur des RUP définies. ARS sont situés dans un épithélium serré et organisé garniture de la cavité nasale, avec les cellules voisines influencer leur maturation et la fonction. Nous décrivons ici une méthode pour isoler un épithélium olfactif intact et enregistrer par patch-clamp enregistrements les propriétés des ARS expressing récepteurs olfactifs définies. Le protocole permet de caractériser les propriétés de la membrane OSN tout en maintenant l'influence du tissu voisin. Analyse des résultats de patch-clamp donne une quantification précise de ligand / ou des interactions, des voies de transduction et de la pharmacologie, les propriétés de codage de ARS et leur modulation au niveau de la membrane.
Introduction
Les neurones sensoriels olfactifs (OSN) représentent la première étape de la perception olfactive. Situé dans l'épithélium olfactif tapissant la cavité nasale chez les rongeurs, ils transforment les informations chimique de substances odorantes dans des potentiels d'action envoyés par leurs axones dans le cerveau. Pour mieux comprendre les mécanismes de codage olfactif, il est nécessaire de caractériser les propriétés de transduction et membranaires de ARS. Jusqu'à récemment, la plupart des techniques utilisées pour caractériser les propriétés des ARS de mammifères ont été effectuées sur dissocié ARS 4.1. Le processus de dissociation utilise divers (c.-à-enzymes) des procédés mécaniques et chimiques pour libérer les ARS de leur environnement. Ces processus induisent un faible nombre de cellules disponibles pour les enregistrements. Ce faible nombre peut être encore plus critique dans le cas des cellules GFP étiqueté. La dissociation supprime également les interactions locales de cellule à cellule entre les ARS et d'autres cellules de l'épithélium olfactif qui peuvent améliorer SURVIVal et la modulation des propriétés de ARS. Afin de contourner la procédure de dissociation, une préparation intacte 5 a été développé.
Chaque OSN exprime un récepteur olfactif (OU) choisi parmi une grande famille multigénique 6. Il ya ~ 1000 RUP exprimées dans la principale épithélium olfactif chez la souris. En raison du grand nombre d'OR dans les animaux de type sauvage, les chances d'enregistrer ARS exprimant le même OU sont très faibles. Pour surmonter ces limitations, les souris de gènes ciblés sont disponibles dans lequel tous les ARS exprimant une personne identifiée ou sont étiquetés avec une protéine fluorescente 7-9. Ces ARS marquées ont été utilisés pour faire l'analyse fonctionnelle dans les préparations dissociées 7,10,11 avec les inconvénients mentionnés plus haut. Une préparation de l'épithélium intact 5 de souris génétiquement marqués contourne donc sur ces questions. Il permet le suivi de l'activité des ARS exprimant RUP précisément définies dans un environnement aussi près dans vivo que possible. En outre, les enregistrements de patch-clamp de ARS permettent également une analyse précise des propriétés de la membrane, transduction voie pharmacologie, ligand / ou des interactions. Tous ces sujets peuvent difficilement être analysées à l'aide des enregistrements extracellulaires. Nous avons utilisé cette technique pour surveiller les réponses des ARS exprimant les récepteurs olfactifs SR1 et MOR23 12,13. La faisabilité de la technique a été confirmée par d'autres groupes sur MOR23 exprimant ARS 14 ainsi que sur les autres RUP exprimant neurones 15,16. Le suivi d'une population définie de ARS peut conduire à l'analyse de leurs propriétés dans de nombreux contextes différents tels que le développement 14, 17 vieillissement, odorant induite plasticité 18, et le rôle des variations de la séquence du récepteur olfactif de l'odeur de codage 15. Ce protocole fournit ainsi un outil puissant pour surveiller les propriétés fonctionnelles des ARS définies au niveau de la membrane.
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Protocol
Ce protocole suit les directives de protection des animaux de l'Université de Bourgogne et a été approuvé par le comité d'éthique de l'Université de Bourgogne.
1. Les animaux
- Utilisez la souris OU-IRES-tauGFP génétiquement disponibles au Laboratoire Jackson. Ces souris ont été développés dans le laboratoire du Dr Peter Mombaerts afin d'analyser le ciblage et le développement des axones du système olfactif 19. Par exemple, la ligne MOR23-IRES-tauGFP, numéro de stock 006643, porte le nom officiel de la souche B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; de même, la ligne SR1-IRES-tauGFP, stock number 6717 porte le nom B6 officielle; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
- En ce qui concerne l'âge des animaux: pour un meilleur résultat du protocole, utiliser des animaux entre 2 et 4 semaines d'âge. Dans ce groupe d'âge, la dissection est plus facile (os plus doux, plus ferme épithélium olfactif) et les boutons dendritiques sont bigger comparer aux animaux plus âgés.
2. Préparation des électrodes et Solutions
- Pour les pipettes de stimulation: achat prepulled stimuler pipettes. Sinon, les préparer manuellement.
- Utiliser une flamme, pliez six pipettes en verre de 1 mm à environ 1 cm de la pointe. Insérez ces six pipettes droites plus un 7 ème dans 1,5 cm gaine thermorétractable renforcer par un oeillet.
- Thermorétractable tube pour maintenir les barils attachés ensemble. Fixez un tube thermorétractable additionnelle à l'autre extrémité des barils. Tirez cette pipette stimulant avec un extracteur multi-canon.
- Ajouter un peu de colle liquide blanc autour de l'oeillet de renforcer les conseils pliés. Laisser sécher O / N.
- Préparez 1 ou 2 L de solution extracellulaire normale Ringer (en mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO 3 26, NaH 2 PO 4 1,25, le glucose 15; pH 7.6 et 305 mOsm). Conserver à 4 ° Cjusqu'à utilisation.
- Préparer une solution stock intracellulaire (en mM): KCl 70, 53 KOH, l'acide méthane 30, EGTA 5, HEPES 10, 70 saccharose; pH 7,2 (KOH) et 310 mOsm. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation. Conseillé pour plusieurs semaines.
- Préparer la solution intracellulaire d'enregistrement avec nystatine extemporanée (à la dernière minute) avant l'expérience.
- Peser 3 mg de nystatine, ajouter 50 pi de DMSO; vortex 20 sec Soniquer puis 2-3 min jusqu'à entièrement diluée.
- Ajouter 20 pi de solution de DMSO-nystatine dans 5 ml de solution de réserve intracellulaire. Vortex 20 sec, puis Soniquer 3 min. Gardez cette solution à 4 ° C et de protéger de la lumière directe, la nystatine est sensible à la lumière. Cette solution peut être utilisée pendant quelques heures. Remplacer tous les jours.
- Une fois la préparation de l'épithélium olfactif est sous le microscope, prendre un peu de cette solution dans une seringue de 1 ml avec une pointe jaune flamme allongée pour remplir les électrodes; protéger de la lumière directe. Une fois à température ambiante, la solution de nystatineest pas stable; remplacer la solution dans la seringue de 1 ml toutes les heures ou le garder dans la glace.
- Tirez électrodes d'enregistrement avec un extracteur d'obtenir à long cou et petit pourboire (~ 2 um) avec une résistance de 15-20 MQ avec la solution de nystatine interne.
- Préparer la solution odorant à 0,5 M dans le DMSO sous une hotte; aliquote et de garder à -20 ° C jusqu'à utilisation. Diluer substance odorante dans la solution de Ringer jusqu'à la concentration désirée. Remplissez la pipette stimulant.
3. Préparation de l'épithélium olfactif
Remarque: souris OU-IRES-tauGFP expriment la tauGFP sous le contrôle de l'OU promoteur. Chez ces souris, tous les neurones exprimant l'OU d'intérêt sont étiquetés avec la GFP. Ce protocole est adapté pour les RUP exprimées dans toutes les zones. Cependant, les dissections sont plus faciles et les enregistrements de RUP exprimées dans la zone dorsale.
- Anesthésier l'animal par injection d'un mélange de kétamine et de xylazine (150 mg / kg et 10 mg / kg DBOpoids y, respectivement). Décapitation peut être effectuée avec des ciseaux pointus pour les jeunes souris ou avec une guillotine de rongeur bien entretenu pour les souris âgées.
- Aide de la bague des ciseaux de dissection font une incision médiane longitudinale à travers la peau du dos. Retirer la peau en le tirant à part. En utilisant les ciseaux, couper les mâchoires inférieures à l'articulation de la mâchoire. Retirez les incisives supérieures par une coupe coronale parallèle aux dents.
- Faire une coupe coronale de la tête derrière les yeux et de ne conserver que la partie antérieure de la tête. Tremper dans une solution de Ringer glacée pour la dissection sous la portée.
- Disséquer sous le champ d'application: dans la face ventrale, faire une coupe longitudinale le long de la mâchoire supérieure / les dents. Couper les os dorsale longitudinalement, suivant la partie dorso-latérale de la cavité nasale. Retirer la plupart des os et du palais; transférer le septum et l'épithélium attaché à elle dans oxygéné Ringer à RT.
- Pour la dissection final: Juste avant de commencer l'enregistrementsession, décoller l'épithélium de la cloison sous-jacent avec une pince. Détachez l'épithélium avec une pince et avec deux coupes 4-5 mm de ciseaux (utilisation microvannas ciseaux) à la partie antérieure de la cloison où l'adhérence est plus forte.
- Retirez délicatement l'organe voméronasal par découpe le long de sa connexion dorsale à l'épithélium septale. Transfert de l'épithélium à une chambre d'enregistrement avec la couche de mucus vers le haut; garder à plat dans la chambre avec une harpe.
- Installez chambre sous un microscope droit équipé d'une optique de fluorescence et une caméra sensible. Visualisez la préparation sur l'écran d'ordinateur à fort grossissement 40X par un objectif immersion dans l'eau (ouverture numérique de 0,8) et un 2X ou 4X grossissement supplémentaire atteint par une lentille grossissante. Perfuser continu avec oxygéné Ringer à RT (1-2 ml / min).
4. Enregistrement de session
- Rechercher cellule fluorescente: exciter la préparation à 480nm pour EGFP, qui émet de la lumière dans la gamme 530-550 nm; cibler un seul bouton dendritique qui est fiable visible dans fluorescence et sous champ lumineux.
- Remplir l'électrode avec une solution intracellulaire à la nystatine; éliminer les bulles en tapotant doucement sur l'électrode.
- Insérez électrode sur un support d'électrode, appliquer une pression positive dans la pipette; La résistance doit être 15-20 MQ.
- Apportez électrode proche de la cellule; une fois la résistance atteint ~ 40 MQ, relâcher la pression positive et appliquer une légère pression négative pour atteindre un gigaseal.
- Une fois joint est atteint, réglez le potentiel de membrane à environ -75 mV;
- Une fois que la cellule est ouverte, procéder à des protocoles de stimulation, les traitements pharmacologiques. Pour mesurer la réponse à une stimulation odorante unique, fiche 200-500 ms de l'activité spontanée, stimuler pour 500 ms et mesurer la réponse de la cellule pour un maximum de 10 sec 13. Pour les traitements pharmacologiques, perfuser les agents pharmacologiques àla 20 concentration souhaitée.
5. Analyse des données
- Analyser les courants induits par la stimulation odorante comme suit: l'amplitude maximale, le temps de montée (temps nécessaire pour atteindre 90% de l'amplitude maximale, en ms), le courant total (aire sous la courbe à pas), le temps à 50% (temps entre le début et le décalage de la réponse à 50% de l'amplitude maximale, en ms).
- En utilisant les courants de pointe de transduction (amplitude maximale atteinte) à différentes concentrations, dessiner et ajuster une courbe dose-réponse en utilisant l'équation de Hill: I = Imax / (1 + (K 1/2 / C) n), où je représente le courant de crête , Imax la réponse maximale à des concentrations de saturation, K1 / 2, la concentration à laquelle la moitié de la réponse maximale a été atteinte, C la concentration de substance odorante et n le coefficient de Hill.
- Analyser les enregistrements de potentiel de membrane en pince ampèremétrique pour la dépolarisation maximale, la total potentiel suscité (aire sous la courbe dans mVsec); enregistrent l'activité de dopage spontanée en 30 sec à 1 min enregistrements; fiche excitabilité travers pointes provoquées par injection de courants (5-10 Pa).
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Representative Results
Le résultat de ce protocole dépend de la qualité de la dissection. Cette dissection étapes doivent être courts (moins de 10 à 15 min) et précis (par exemple, pour éviter les dommages de l'épithélium). La figure 1 illustre comment une préparation idéale ressemble à différents niveaux de grossissement. A un faible grossissement sous champ lumineux les différents types de cellules (comme les poignées de ARS, des cellules de soutien) se distinguent (figure 1A). Au niveau de grossissement plus élevé, typiquement 80X à 160X, dans le champ lumineux, les boutons dendritiques des ARS doivent être clairement distingués des cellules de soutien (figure 1B). Sous une lumière fluorescente, seuls les boutons dendritiques et les cils des cellules GFP étiqueté sont visibles (figure 1C). En comparant les deux images, les cellules marquées peuvent être abordés avec la pipette d'enregistrement (figure 1D).
La température de la dissection afinlution et le calendrier de la dissection sont essentiels. La première partie de la dissection, la préparation de la cloison (section 3.1.1 à la 3.2) devrait avoir lieu dans les 5 à 10 min dans une solution glacée. La dissection finale (3.3) doit durer moins de 5 min à température ambiante. Dans le cas où la dissection a duré trop longtemps, ou a été réalisée dans une solution de dissection trop chaud, la préparation semble invariablement rapidement endommagé: boutons dendritiques flottent au-dessus de la surface de l'épithélium, et ressemblent à des cellules mortes.
Une fois que le joint est atteinte et ouvre la cellule sous l'effet de la nystatine, les courants de tension fermée typiques peuvent être observées (figure 2A). La forme et les caractéristiques de ces courants peuvent être utilisés pour surveiller la santé de la cellule: dans une cellule de mourir ou si la qualité de l'étanchéité est à la baisse, l'amplitude de ces courants va diminuer. Sous la configuration de pince de courant, des potentiels d'action peuvent être enregistrées soit spontanément (Figure 2B) ou par injection d'un courant de dépolarisation (figure 2C). Les propriétés de cuisson par injection de courant induites caractérisent l'excitabilité du neurone enregistré. L'excitabilité de la population de différentes ARS peut être comparé (utilisant la fréquence classique et calculs ISI).
Une pipette de multibarrel chargé avec différentes substances odorantes et / ou des concentrations différentes de substances odorantes peut être utilisé pour stimuler les cellules par éjection sous pression. Cela permet de mesurer les réponses odorantes induite. Les substances odorantes et les concentrations doivent être choisies en fonction de la ou exprimé dans la cellule d'intérêt, par exemple Lyral est le ligand pour MOR23, l'acétophénone pour M71, l'eugénol pour mOREG. Dans l'expérience illustrée sur la figure 3, les neurones MOR23-IRES-tauEGFP enregistrées ont répondu à des concentrations différentes de Lyral, un ligand pour MOR23, dans le mode de blocage de courant (Figure 3A) ou dans le mode de blocage de tension (figure 3B). Dans tension enregistrements en mode de serrage, des caractéristiques différentes peuvent être surveillés pour quantifier la réponse (amplitude maximale, temps de montée, courant total suscité, etc.) Comme effectuée classiquement en électrophysiologie. Utilisation de l'amplitude maximale de la réponse induite odorant, dose-réponse peut être tracée et monté en utilisant l'équation de Hill. Ces résultats fournissent des informations sur les propriétés de codage de chaque OSN: seuil de détection, dynamiques temporelle, plage dynamique et le niveau de saturation. Des exemples de courbes dose-réponse sont présentés sur la figure 3C. Tous ces détails peuvent être comparées entre les ARS individuels pour mesurer hétérogénéité potentielle dans une population; ils peuvent également être comparés entre les ARS avec ou sans application d'un traitement pour mesurer modulation du potentiel et de la plasticité.
Figure 1: Des images représentatives d'une préparation saine (A) épithélium olfactif Intact extraite de la cavité nasale d'une souris transgénique SR1-IRES-tauGFP observée sous condition de champ lumineux au grossissement 40X.. OSN boutons dendritiques (têtes de flèche noire) sont enfermés dans un maillage de cellules de soutien (SC) et les glandes Bowman (BG). (B) boutons dendritiques du SR1 exprimant ARS observés sous condition de champ lumineux (flèche blanche et rouge têtes). (C) Le même domaine comme dans (B) sous une lumière fluorescente montrant boutons dendritiques de SR1 ARS exprimant. (D) Enregistrement pipette approche d'un OSN SR1 exprimant sous champ lumineux. La flèche rouge représente le même SR1 OSN (B - D). Barre d'échelle: 5 um.
Figure 2: représentatifs des résultats des propriétés membranaires obtenus avec le protocole:. Enregistrements de patch-clamp sur le bouton dendritique d'une SR1-IRES-tauGFP OSN (A) Tension fermée courants induits par l'augmentation étapes dépolarisants du potentiel de membrane -67 mV à +40 mV. (B) de l'activité spontanée enregistrée dans la configuration de pince de courant; potentiels d'action peuvent être observées lors de l'enregistrement époque 15 sec. (C) Les potentiels d'action déclenchés par un courant +7 pA excitateur; ce protocole fournit des informations sur l'excitabilité de la cellule.
Figure 3:. Des exemples représentatifs de odorantes induit des réponses à un neurone MOR23-IRES-tauEGFP Des concentrations croissantes de Lyral, un ligand du récepteur MOR23, induisent une augmentation des réponses à la fois en pince de courant (A) et à pince de tension (B). Le potentiel de membrane a été bloquée à -67 mV. (C) Des exemples de courbes dose-réponse individuelles acquises sur trois neurones M71 en réponse à l'augmentation des concentrations de l'acétophénone et munis de l'équation de Hill.
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Discussion
La capacité de ce protocole pour surveiller correctement les propriétés des ARS en bonne santé dépend fortement de la qualité de la préparation. Par conséquent, les étapes de dissection sont critiques. D'abord, il est essentiel de prêter attention à la qualité (pH, osmolarité), l'oxygénation et la température (glace-froid mais non congelé) du milieu de dissection. Deuxièmement, la manipulation de l'épithélium avec des outils de dissection doit être aussi limité que possible pour éviter des dommages. Enfin, il est essentiel d'obtenir une préparation aussi plat que possible afin d'accéder à la plus grande population de OSN que possible.
La qualité de dissection est fondamentale pour obtenir une préparation en bonne santé. Cependant, différentes approches peuvent être utilisés pour la dissection: ici, nous présentons une ventrale dorsale dissection mais certains utilisateurs peuvent préférer commencer la dorsale de dissection pour ouvrir la cavité nasale rapidement et avoir un accès rapide à l'évidement septale de l'épithélium olfactif. Chaque utilisateur peut donc adapter le protocole pour la stratégie la plus efficace pour parvenir à une préparation en bonne santé de la zone d'intérêt.
Une fois la préparation est sous le microscope, un suivi permanent de la santé de la préparation est nécessaire. En effet, une préparation malsaine conduit à une faible probabilité de parvenir à un gigaseal. Une faible efficacité dans l'obtention gigaseals peut être améliorée en changeant la zone d'intérêt sur la préparation en vue de trouver ARS sains. Une solution plus drastique consiste à remplacer totalement la préparation par un nouveau. Une fois que le joint est atteint, une faible probabilité d'atteindre l'état "ouvert" peut avoir lieu. Cela peut être dû à la qualité de la solution interne. La solution interne doit être préparé juste avant l'expérience. L'utilisation de vortex et sonication sont critiques car la solubilité de la nystatine est assez faible. Pour améliorer la probabilité d'ouverture, la solution interne doit être de nouveau agité par tourbillonnement pendant 10 s, puis soniqué pendant 30 à 60 sec. Cette usuallié améliore l'efficacité de l'ouverture de cellule.
Pour stimuler l'OSN enregistré avec odorants, le protocole présenté utilise une pipette stimulant 7 baril. Ce type de pipette implique une limitation du nombre de substances odorantes et / ou de concentration de substances odorantes testés sur des cellules enregistrées de chacune sept. Cette limitation est relativement non significative dans le cas d'une courbe dose-réponse, car il peut couvrir jusqu'à sept unités logarithmiques de concentration. Toutefois, dans le cas des expériences de criblage, dans lequel différentes substances odorantes sont testés, une pipette de sept canon peut montrer les limites. Dans expériences de criblage, l'objectif est de trouver un ligand pour ARS marquées exprimant un orphelin OU. En utilisant ce protocole nécessitera l'utilisation de mélanges odorants. Chaque mélange susciter une réponse sera ensuite divisé en odorants individuels. Cela a été fait à l'écran odorants amine sur TAAR exprimant ARS 16. Dans ces expériences, les neurones fluorescents exprimé TAAR et le ligand est unknown. En utilisant le protocole, les auteurs pourraient dépister plusieurs dizaines de substances odorantes amine dans des mélanges. Les mélanges susciter une réponse ont ensuite été ventilés à odorants simples afin de trouver le ligand plus efficace.
La distance entre le site d'enregistrement et la pipette de stimulation doit être choisie judicieusement en vue de minimiser la stimulation mécanique de la cellule 20. Si la pression est trop élevée (supérieure à 30 psi dans nos conditions d'enregistrement) et / ou la distance trop petite (inférieure à 20 um), la réponse mécanique dans certains ARS peut même masquer la réponse odorant. La pression et la distance entre la pipette et de gonflement au site d'enregistrement sont également essentiels pour contrôler l'échange de solution pendant la stimulation. La concentration atteignant le neurone a été précédemment évalué à être aussi proche que possible de la concentration présente dans la pipette à travers une série de tests 13. Ces tests ont utilisé une solution colorée avec du colorant bleu pour mesurer l'apparition et le décalage de til stimulation. Utilisation de pression de 20 psi et 30 um loin et l'intensité maximale de l'impulsion a été atteinte à l'intérieur de 300 msec. Le décalage de la relance a également été soigneusement évalués: depuis la préparation est sous flux continu de solution perfusée, le stimulus a été lavé à l'intérieur de 0,8 à 0,9 sec 13.
L'odeur propriétés des ARS de codage ont été historiquement mesuré soit à travers des enregistrements extracellulaires in vivo ou par des expériences sur des cellules isolées. Chez les mammifères, les enregistrements extracellulaires ont été réalisées dans un premier temps in vivo chez des rats 21. Dans enregistrements extracellulaires, le ou exprimé dans la cellule enregistrée est inconnu limitant ainsi le taux de réussite de trouver une cellule répondant à la substance odorante testé. Ce protocole permet l'enregistrement et la caractérisation de récepteurs définis dans les neurones dans l'environnement cellulaire de l'épithélium. Les propriétés des récepteurs peuvent donc être analysées à différents niveaux: le ligand spécifique/ OU interactions au cours de la première étape de la voie de transduction; par conséquent, l'agoniste / interactions antagonistes de divers ligands testés; les propriétés des mélanges intégration des RUP définies et le rôle de la voie de transduction de la spécificité de ARS; l'influence sur le codage olfactif des interactions de cellule à cellule (tels que GAP jonction) dans l'épithélium; et finalement la modulation de la voie de transduction en utilisant des agents pharmacologiques.
Dans les enregistrements de cellules dissociées, comme mentionné précédemment, le processus de dissociation supprime le mucus et les interactions de cellule à cellule au sein de l'épithélium olfactif. Cela peut induire des changements dans les propriétés de codage des ARS. des expériences d'imagerie de calcium sur des cellules isolées ont été fréquemment rapportés. Par exemple, les courbes de M71 exprimant ARS en réponse à acétophénone dose-réponse ont été signalés 7. Ces courbes dose-réponse sont plus raides que les courbes dose-réponse obtenues en utilisant le protocole4 présentée ici. Ces différences peuvent être dues à des interactions de cellule à cellule dans la préparation intact et également à l'élimination du mucus dans les cellules isolées. Le mucus est connu pour contenir de nombreuses protéines et enzymes impliqués dans les événements de perireceptor fondamentaux pour la transduction olfactive 22,23. Dans le protocole indiqué ici, la préservation de la structure de l'épithélium olfactif et la présence putatif du mucus contribue à préserver les caractéristiques natives de codage odorant dans ARS. Les concentrations utilisées dans le protocole sont indiqués en mol / L et sont habituellement dans les 10 -7 -10 -3 gamme. Ces concentrations sont plus élevées que les concentrations utilisées dans les enregistrements de l'air phases (soit en potentiel de champ local ou enregistrements extracellulaires). Ces différences peuvent être dues à i) de la phase liquide des enregistrements (et donc de la stimulation) et ii) le lavage lent du mucus par perfusion au cours de l'enregistrement. En fait, le lavage de la CUMnous et la section des axones des ARS lors de la dissection peut soutenir que la préparation présenté potentiellement être qualifiée de "pseudo-intacte» plutôt que d'une préparation "entièrement intacte". Cette préparation représente, Cependant, l'enregistrement des conditions aussi proches que possible in vivo et pourtant suscitant enregistrements de patch-clamp. Comme toute préparation in vitro à partir d'un organisme d'un mammifère, la survie reste limitée dans le temps. Cette limite peut être dû à l'érosion de la muqueuse, la section des axones d'ARS, ainsi que l'absence de circulation sanguine à l'intérieur de la préparation.
Le protocole présenté ici permet d'enregistrer les propriétés membranaires des neurones sensoriels olfactifs. Cette technique peut avoir de multiples applications telles que l'analyse des propriétés des membranes d'ARS, des enquêtes pharmacologiques des ARS, la modulation des propriétés odorantes de codage ARS, et deorphanization des RUP. Les événements enregistrés lors de l'imagerie de calcium sont slow et de longue durée. Patch-clamp enregistrements dans le présent protocole plomb à des données sur les événements rapides dans la voie de transduction olfactive au niveau de la membrane.
Les enregistrements présentés ici sont effectuées dans la configuration patch-clamp. Dans cette configuration, les propriétés de la membrane de la cellule enregistrés peuvent être analysés, que ce soit le mécanisme de voie de transduction olfactif ou les courants de voltage-dépendants impliqués. Des expériences utilisant ce protocole peuvent fournir des données sur la modulation de la substance odorante propriétés de codage ARS. Les agents pharmacologiques peuvent être utilisés pour étudier la transduction olfactif dans des conditions différentes: par exemple, MDL12330A Un bloqueur de l'adénylate cyclase III (ACIII) 24,25 peut être appliquée à la solution de perfusion pour étudier le rôle de ACIII dans une réponse odorant. En outre, ce protocole peut être utilisé pour étudier comment olfactive propriétés de codage sont modulés dans des conditions différentes telles que l'environnement olfactif <sup> 18 ou sous l'influence des hormones impliquées dans des comportements alimentaires 26. Enfin, ce protocole peut aussi conduire à des données sur l'interaction OU / ligand et de déchiffrer agonistes / antagonistes activités sur les RUP définies ou même dans les récepteurs choisis au hasard 27.
Enfin, avec les limitations dues à la 7 baril pipette stimulant, ce protocole peut également être utilisé pour deorphanizing RUP. Comme mentionné précédemment, dans ce cas, plusieurs mélanges odorants peuvent être testés. Mélanges susciter une réponse devraient ensuite être divisés en substances odorantes individuelles testées sur d'autres cellules.
En ciblant les ARS exprimant RUP définis, ce protocole fournit des données sur les interactions puissantes RUP, des ligands / RUP, les propriétés de la voie de transduction et de comparer les propriétés des populations définies de ARS dans des conditions différentes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
- Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
- Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
- Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
- Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
- Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
- Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
- Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
- Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
- Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
- Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
- Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
- Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
- Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
- Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
- Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
- Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).
