Application Technique d'injection stéréotaxique pour étudier les effets génétiques sur les comportements des animaux

Summary

Injection stéréotaxique de lentivirus exprimant les ADNc ou shRNA peuvent moduler l'expression génique dans des zones spécifiques du cerveau de souris. Ici, nous présentons un protocole de combiner injections stéréotaxiques avec des tâches comportementales, comme le test Open Field (OFT) et le test de natation forcée (FST).

Abstract

Injection stéréotaxique est une technique utile pour fournir des lentivirus de titre élevé dans les zones ciblées du cerveau chez la souris. Les lentivirus peuvent soit surexpression ou l'expression des gènes knockdown dans une région relativement concentré, sans dommages importants aux tissus du cerveau. Après la récupération, la souris injectée peut être testée sur différentes tâches comportementales telles que le test Open Field (OFT) et le test de natation forcée (FST). L'OFT est conçu pour évaluer la locomotion et le phénotype anxieux chez la souris par la mesure de la quantité de temps que d'une souris passe au centre d'un roman plein champ. Une souris plus anxieux va passer beaucoup moins de temps dans le centre du champ roman par rapport aux témoins. La FST évalue le phénotype anti-dépressif en quantifiant la quantité de temps que les souris passent immobile lorsqu'il est placé dans un seau d'eau. Une souris avec un phénotype anti-dépressive va passer beaucoup moins de temps immobile par rapport aux animaux témoins. L'objectif de ce protocole est d'utiliser le stereotactic injection d'un lentivirus en conjonction avec des tests comportementaux pour évaluer comment les facteurs génétiques moduler les comportements animaux.

Introduction

La souris a été largement utilisé en neurobiologie, car il est facile à manipuler génétiquement. Techniques Gene knock-out permettent aux chercheurs d'étudier comment chaque facteur génétique façonne les comportements de souris. En outre, le système cre-loxP fournit un outil précieux pour tissulaire et la cellule type- KO de gène spécifique chez la souris, ce qui permet aux chercheurs d'étudier la fonction des gènes dans différents tissus. ¹ Toutefois, dans la pratique, les profils d'expression des promoteurs de la CRE sont difficiles à contrôler , et si loin de nombreux chauffeurs de cre établies ont pas atteint l'expression spécifique à la région. ^2,3

En variante, une injection stéréotaxique est une méthode qui cible des régions spécifiques du cerveau de la souris adulte. Par l'injection de virus génétiquement modifiés exprimant des shRNA ou ADNc, de la modulation de l'expression génique spécifique à la région peut être obtenue. Bien que la taille du cerveau de chaque souris varie, l'emplacement des régions spécifiques du cerveau peut être déterminé en utilisant coor stéréotaxiquenates réglée de points de repère sur le crâne du cerveau de la souris. Les monuments les plus couramment utilisés sont bregma, lambda, et la ligne interauriculaire. Utilisation de coordonnées obtenues à partir d'un atlas du cerveau, ⁴ l'emplacement exact de chaque région du cerveau peut être identifié par le antéro-postérieur (A / P), médiale-latérale (M / L), et dorso-ventral (D / V) des axes à partir de bregma / interaural intersection de la ligne. Typiquement les virus se injecté dans le cerveau de souris sont étiquetés avec soit la protéine fluorescente rouge ou vert (DP ou GFP), de sorte que les injections peuvent être confirmés par la microscopie à fluorescence.

Évaluations comportementales de souris sont particulièrement nécessaires pour la recherche fondamentale de troubles psychiatriques. Les symptômes de troubles psychiatriques chez les patients impliquent généralement des comportements anormaux. Certains de ces comportements humains sont évolutivement conservées et peuvent être directement imité et observé chez la souris. Par exemple, la dépression peut être modélisée chez la souris par la mesure de désespoir comportemental. Les gens souffrant de dépression OFTen se sentent comme si de rien ils ne seront jamais aider, un symptôme qui peut éventuellement conduire au suicide. Chez les rongeurs, ce qui peut être modélisée en utilisant le test de natation forcée (FST), qui mesure la quantité de temps par rapport à une souris de natation flottant dans une piscine d'eau (considéré comme l'abandon). Ce paradigme est validée par le sauvetage du phénotype avec des anti-dépresseurs. ^7,8,9 souris qui ont reçu des anti-dépresseurs vont passer beaucoup moins de temps immobile par rapport à des témoins non traités. Un autre test comportemental, le test Open Field (OFT) est conçu pour évaluer la locomotion chez la souris, et peut en outre être utilisé pour analyser le phénotype anxieux chez la souris. ^5,6 Ce test est basé sur la prémisse que les souris se sentent plus en sécurité quand ils sont proches au mur dans un roman plein champ. Souris de type sauvage finiront explorer le nouvel environnement, car ils sont des animaux curieux. Cependant, passer moins de temps dans le centre du champ indique l'anxiété chez la souris, que la souris ne sera pas en mesure de surmonter l'initial la peur provoquée par un nouvel environnement. L'angoisse de la souris, telle que quantifiée par la quantité de temps passé dans le centre d'un champ ouvert, peut être comparé à l'anxiété clinique chez l'homme, qui est présent dans de nombreux troubles psychiatriques.

La combinaison des injections stéréotaxiques de paradigmes comportementaux est une nouvelle façon de modifier l'expression d'un gène spécifique dans une zone ciblée du cerveau. L'effet de l'expression du gène modulé sur les comportements de la souris peut alors être déterminée. Contrairement à élimination directe de l'ensemble du cerveau, cette méthode est particulièrement utile, car elle ne vise que les zones spécifiques du cerveau. En outre, des injections stéréotaxiques sont généralement effectuées chez l'adulte de souris de type sauvage, par conséquent, l'expression du gène endogène a été maintenue tout au long des stades de développement. Cette méthode permet d'éviter l'effet de confondre si le gène est nécessaire pour la survie pendant le stade embryonnaire ou post-natale de développement. Une limitation majeure est que les souris expérimentales doivent aller through une chirurgie invasive, dont les crânes de souris doivent être ouvert. En outre, le degré de modulation de gène est déterminée par l'efficacité et le titre du virus. Le virus doit être injecté dans la région correcte en utilisant les coordonnées stéréotaxiques, qui exige des instruments spéciaux. Vérification du site d'injection correct ne peut être achevé post-mortem.

Cette méthode a été précédemment utilisé pour tester l'implication d'un gène spécifique dans diverses maladies neurologiques. Par exemple, virale ARNi médiée par ciblage du gène Th (qui permet la dopamine à synthétiser) a été injecté dans la compacta substance noire, et l'analyse du comportement locomoteur a été effectuée. ¹⁰ Une autre étude a utilisé injection stéréotaxique d'un silençage DISC1 lentivirus pour évaluer le comportement de la souris en ce qui concerne de la schizophrénie. Knockdown de DISC1 entraîné une augmentation de la locomotion en réponse à la nouveauté (parallèles symptômes positifs de la schizophrénie), et une plus grande immobilité dans leFST. ¹¹ De même, une étude complémentaire a révélé que 5-HT _1B surexpression conduit à un comportement exploratoire augmenté dans l'OFT, compatible avec un phénotype anti-anxiété en utilisant cette méthode. ¹² injections stéréotaxiques peuvent livrer virus de la CRE pour induire la recombinaison chez les souris cre-loxP . Cette méthode a été utilisée pour supprimer de manière sélective le récepteur Y2 dans l'amygdale et le noyau du lit de la strie terminale. Lors de l'analyse du comportement, ces souris ont été trouvés à un phénotype anti-dépressif lorsque le gène a été supprimée dans l'amygdale centrale, mais aucun phénotype lorsque le gène a été supprimée dans l'amygdale basolatérale ou le noyau du lit de la strie terminale. ¹³ Ainsi, cette technique fournit un outil unique d'étudier l'effet génétique sur les comportements des animaux.

Protocol

REMARQUE: Tous les protocoles impliquant des animaux ont été respectées en accord avec les lignes directrices de soins aux animaux de la Pennsylvania State University, IACUC # 44057

1. lentivirus production

NOTE: Le jour avant la transfection, LentiX-293 devrait être à 80% de confluence.

1. Rincer les cellules avec du DMEM juste avant la transfection et incuber dans 10 ml de DMEM / 10% de FBS avec de la pénicilline (100 UI / ml) et streptomycine (100 ug / ml) pendant 5 min à température ambiante.
2. Diluer l'ADN et de polyéthylèneimine (PEI) (1 mg / ml) dans 1: 3 (1 ug d'ADN: 3 ul de PEI) dans 1 ml de DMEM et vortex pendant 1 min. Le volume ajouté est de l'ADN dépend de la concentration de l'ADN. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
   1. Par exemple, utiliser 20 ug d'ADN plasmidique, composé de 10 ug du vecteur plasmidique, 5 ug de psPax2 ¹⁴ plasmide, 5 ug de virus de la stomatite vésiculaire (VSV) avec 60 pi de PEI par boîte.
3. Ajouter 1 / 10ème du volume de milieu de culture DMEM total de (c.-à-1 ml pour 10 ml de milieu de culture dans une boîte de 100 mm). Ajouter 1 ml de l'ADN-PEI mélange goutte à goutte dans le plat et agiter le plat autour jusqu'à ce que le milieu de culture est bien mélangé avec l'ADN.
4. Incuber pendant 6 heures à température ambiante et retirer le surnageant. Ajouter 5 ml de milieu de culture.
5. 48 h après la transfection, recueillir le surnageant viral et de spin à 627 x g pendant 5 min à 4 ° C dans un tube de 50 ml. Filtrer 30 ml de surnageant viral à travers un filtre à seringue de 0,45 um dans un tube d'ultracentrifugeuse.
6. Ajouter de l'eau stérile pour équilibrer les tubes, et couvrir tubes avec petit morceau de parafilm. tubes de tourner à 11 249 g pendant 120 min à 4 ° C. Retirer le liquide avec l'aide d'un bout de l'aspirateur.
7. Ajouter 100 pi de PBS froid le tube. Secouer doucement le tube à 4 ° CO / N.
8. Pour remettre en suspension le virus, pipette til PBS ajouté dans l'étape 1.8 sur les granulés 10 fois, en faisant attention à ne pas toucher le culot avec la pointe. Le culot ne sera pas remis en suspension jusqu'à ce qu'elle soit complète.
9. Aliquoter le virus à 10-20 pi par tube, flash-gel dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.

2. Injection stéréotaxique

2.1) Préparation des Instruments

1. Passer une paire de ciseaux, une pince à extrémités émoussées, un porte-aiguille, scalpel, des cotons-tiges, et un tissu dans un emballage scellé avec un indicateur de stérilisation, et autoclave avant l'intervention chirurgicale. En outre, obtenir 10% d'iode de povidone, l'alcool éthylique à 70%, sutures absorbables, un coussin chauffant, des larmes artificielles, un verre stérilisateur à billes, perceuse, une mèche, 2 seringues jetables, une seringue d'injection, rasoir électrique, analgésique (kétoprofène), anesthésique (Avertin), des gants et un appareil stéréotaxique avec pompe d'injection.
2. Préparer une solution de 1,25% avertin frais ce jour-là, filtre dans une hotte stérile en utilisant un 0,2 &# 181; m filtre seringue stérile, et la placer dans un flacon de sérum stérile. Mélanger 2,5 g d'alcool 2,2,2-tribromoéthyle dans 5 ml d'alcool tert-amylique, puis dissoudre dans 200 ml d'eau. Gardez le pH inférieur à 5. ¹⁵

2.2) Préparation de la souris

1. Administrer avertin basé sur le poids de la souris (375 mg / kg). ¹⁵ Injecter la souris avec le avertin via un (IP) injection intrapéritonéale, puis remettez-le dans sa cage jusqu'à pleinement anesthésiés.
2. Donnez un analgésique par injection IP (ketaprofen, 5 mg / kg), et le lieu des larmes artificielles sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement.
3. Assurez-vous que la souris est complètement endormie en pinçant leur pied. Si la souris répond à la pincée de pied, puis donner plus anesthésique (à des doses de 50 pi). Raser la tête de la souris à l'aide d'un rasoir électrique. Raser la zone à opérer (typiquement de juste derrière les oreilles, à la partie supérieure du museau) et la région environnante.
4. Placez le i de la sourisNto l'appareil stéréotaxique. Verrouiller les dents de devant sur la pince antérieure, et abaisser la pince et le serrer de telle sorte que la mâchoire est entièrement sécurisé.
5. Insérez les barres d'oreilles dans le canal de l'oreille pour se stabiliser complètement la tête. Veillez à ne pas insérer les barres d'oreilles trop loin, ce qui pourrait endommager l'oreille interne. Une fois terminé, le corps de la souris devrait être en mesure d'être légèrement déplacé sans perturber la position de la tête.
6. Placez un coussin chauffant sous la souris afin de réguler la température du corps de la souris tout au long de la procédure.
7. Nettoyez soigneusement la zone chirurgicale. En utilisant un coton-tige, frottez 10% de povidone iode dans un mouvement circulaire, à partir du milieu du site chirurgical et se déplaçant vers l'extérieur. Ensuite, utilisez un coton-tige pour frotter l'alcool éthylique à 70% sur le site chirurgical de la même façon. Répéter deux fois.

2.3) La première incision

1. Une fois que la souris est préparée, ouvrir le sac de matériel stérile. Changer de gants avant touching les instruments. Sortez le tapis stérile et placer les instruments sur la toile. Si tout instrument touche une surface non stérile, utilisez la vitre stérilisateur à billes pendant 15 secondes pour le stériliser.
2. Prenez le scalpel dans les forceps dominantes de la main et extrémités franches dans la main non dominante. Utilisez la pince à extrémités émoussées à adhérence doucement la peau de la souris, et faire une incision au bistouri. Commencez l'incision d'environ 1,5 cm au-dessus des oreilles (vers le nez) et étendre à environ 0,5 cm au-dessous des oreilles. Elargir l'incision verticale au milieu de la tête de la souris pour exposer bregma (Figure 1).
3. Une fois bregma est visualisé, prendre un bout de coton stérile pour éliminer en douceur toute trace de sang recouvrant la surface du crâne. Utilisez deux conseils de coton pour pousser la peau vers le côté de la tête.

2.4) Installation du matériel

1. Après tout sang est retiré de la surface du crâne, et est clairement visualisé bregma, préparer la seringue (concentration de 10 ⁸ TU / ml, volume de 1 pi). Dans la hotte, à remplir la seringue avec le virus à injecter. Assurez-vous que pas de bulles sont à l'intérieur. Placez la seringue dans l'appareil stéréotaxique, veillant à ce qu'il soit entièrement garanti.
2. Abaisser lentement la seringue jusqu'à ce qu'il se trouve juste au-dessus de la surface du crâne, de sorte que la pointe de l'aiguille de la seringue stérile est fixé à l'intersection de la ligne et bregma interauriculaire. Réglez ce point zéro, et déterminer les coordonnées de ce point.
3. En fonction de la zone du cerveau d'intérêt, les coordonnées stéréotaxiques varier. Déterminer ces coordonnées en utilisant un atlas du cerveau ^4. Une fois les coordonnées sont déterminées, déplacer l'aiguille de la seringue pour correspondre à ces coordonnées. Cibler les gyrus denté utilisant les coordonnées: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Abaissez l'aiguille à droite au-dessus du crâne de visualiser où le trou doit être percé.
4. Soulever légèrement la seringue, prenez la perceuse et placer le bi de foraget juste au-dessus du site de forage cible à environ un angle de 45 ° sur le crâne. Commencer le forage, et de garder le forage jusqu'à ce que le crâne cède. Lorsque le crâne cède la place, une baisse de la résistance peut être détectée. Veillez à ne pas percer dans le cerveau, de manière à prévenir les dommages corticale.
5. Prenez un bout de coton stérile et essuyer le sang du trou.
6. Abaissez la seringue de sorte que la pointe se trouve à droite sur la surface du cerveau (pas le crâne). Réglez le D / V de coordonnées (profondeur) à 0. Lower la seringue à la profondeur désirée, sur la base des coordonnées de l'atlas du cerveau. Pour atteindre le gyrus denté, réglez D / V à -1,79 mm.
7. Lancer l'injection à un débit de 0,2 ul / min. Lire à faire en sorte que la seringue ne glisse pas inférieure à la profondeur désirée. Si cela se produit, soulevez doucement la seringue à la profondeur désirée nouveau.
8. Après l'injection est terminée, attendre environ 2 min pour assurer que tout virus résiduel a été absorbé. Soulevez lentement la seringue et d'utiliser un coton-tige pour enlever toute liquid à partir du site d'injection.
9. Répétez l'opération pour l'autre hémisphère.

2.5) suture

1. Retirer le fil de suture et une aiguille stériles de son emballage et l'adhérence de l'aiguille en utilisant les supports d'aiguille. Face à la pointe pointue de l'aiguille loin de la porte-aiguille. Tenez les pince à extrémités émoussées dans la main non-dominante, et l'utiliser pour saisir la peau de la souris. Commencez avec la main dominante.
2. Poussez doucement le fil de suture à travers la peau et utiliser les pince à extrémités émoussées pour saisir la peau de l'autre côté de l'incision. Tirez sur le support de suture à travers jusqu'à environ 0,75 pouce reste.
3. Lâcher de l'aiguille, et d'utiliser les pince à extrémités émoussées pour envelopper le fil de suture autour du porte-aiguille une fois, puis, prenez le reste suture 0,75 pouces avec le support d'aiguille, et tirez le fil de suture à travers, de sorte que le porte-aiguille et l'aiguille finir sur le côté de la tête opposée à celle sur laquelle ils sont à l'origine. Cela devrait former un noeud.
4. Répétez cette étapetrois fois, en alternant le côté de la tête du porte-aiguille se termine sur à chaque fois.
5. Couper le fil de suture et répétez les étapes 2.5.1-2.5.3 jusqu'à l'incision est fermée.

2.6) de soins post-opératoires

1. Retirez délicatement les barres d'oreilles de la souris, et retirer sa mâchoire de la pince antérieure.
2. Garder la souris sur le coussin chauffant jusqu'à ce qu'il se réveille et se déplace sur son propre. Surveiller la souris quotidienne, et de garder et œil sur les signes de douleur, comme ne pas se nettoyer, manger ou boire. Donnez analgésique supplémentaire lorsque cela est jugé nécessaire.

3. Ouvrez Field Test

3.1) Set Up

1. Obtenir un carré vide, l'arène en plastique avec des dimensions de 50 cm x 50 cm, avec 50 cm de hauts murs (mais peuvent être légèrement plus grand). Nettoyer la scène avec de l'alcool éthylique à 70% avant le début de l'expérience. Assurez-vous que l'alcool éthylique a complètement sec avant de placer une souris dans l'arène.
2. Placez l'arène sur lede-chaussée, et essayer d'assurer l'éclairage est réglé pour minimiser les ombres et les reflets.
3. Si vous utilisez un logiciel de suivi, positionner la caméra directement au-dessus du champ ouvert, environ 1,5 pieds au-dessus du champ ouvert (assez loin pour englober l'ensemble complet arène, mais assez proche pour avoir une vision claire de la souris).
4. Mettre en place une zone dans le centre de la boîte (environ une superficie de 30 cm x 30 cm). ¹⁶ Pour régler une zone, cliquez sur l'onglet zone 1 dans le panneau latéral.
   1. Sélectionnez un contour de forme dans le panneau supérieur, et de définir le périmètre de la zone centrale. Sélectionnez la zone ajouter, et cliquez sur l'intérieur de la zone centrale. En utilisant les invites de programme, le nom de la zone (ce qui sera dénommé «centre» pour cette procédure). Si le test de comportement sera marqué par la main, assurez-vous que le fond du champ est divisé en 10 cm x 10 cm carrés, marqué en utilisant du ruban.
5. Mettre en place le logiciel de sorte que les paramètres sont corrects, et la souris est facilement visible sur l'écran. Accomplir cela en ajustant les paramètres de détection sur la machine pour être compatible avec l'arène de test (éclairage) et la couleur de la souris.
   NOTE: Lorsque les paramètres sont corrects, le système doit suivre uniquement la souris, et non les ombres ou les urines / matières fécales. Les paramètres logiciels spécifiques dépendent de l'éclairage de la scène, et la couleur de la souris.

3.2) acclimatation et d'essai

1. Déplacez la souris expérimentales dans le comportement chambre 1 h avant le test afin de les acclimater à leur environnement. Laissez les souris dans leur cage pour l'acclimatation.
2. Allumez l'appareil photo à la bande de la tâche comportementale et placez la souris vers l'avant centre de l'arène pour que la souris est face au mur.
3. Réglez la minuterie pour 5 min, et pas loin de l'arène. Si possible, quitter la salle afin de ne pas influencer accidentellement la souris.
4. Une fois 5 min sont en place, retirer la souris et placez-les dans leur cage.
5. Utilisez de l'alcool éthylique à 70% pour nettoyer à fond sur le terrain avant de passer à la prochaine souris. Assurez-vous que l'alcool éthylique a entièrement séché.

3.3) Scoring

1. Considérez la souris comme étant au centre du terrain lorsque les quatre pattes sont à l'intérieur du milieu de 30 cm x 30 cm.
2. Quantifier la quantité de fois que la souris passe au centre. Alternativement, de déterminer cette fois en utilisant un logiciel de suivi (comme Noldus ethovison).
   1. Pour ce faire, allez dans l'onglet d'analyse, et cliquez sur «mouvement» dans les profils d'analyse. Supprimer les catégories actuellement sélectionnées, puis sélectionnez "dans la zone" sous l'onglet emplacement. Sélectionnez la zone centrale. Ensuite, sélectionnez "sortie d'analyse" (sous l'onglet de résultats) pour afficher les résultats. Un tableau énumérant le temps passé immobile pour chaque essai devrait apparaître.
3. Sinon, le score de l'OFT à la main. Le champ ouvert devrait avoir 25 à 10 cm x 10 cm carrés décrites sur le fond de l'OPEchamp de n (comme indiqué dans l'étape 3.1.3). Quantifier la quantité de fois que la souris passe au centre, en plus du nombre d'entrées dans le centre de l'arène. ¹⁶
   NOTE: Le centre de 30 cm x 30 cm zone est considérée comme le centre du champ ouvert. Une souris est considéré comme vivant dans la région centrale si les quatre pieds sont à l'intérieur de la zone 30 cm x 30.

4. test de natation forcée

REMARQUE: Prévoir un minimum de cinq jours entre tâches comportementales.

4.1) Set Up

1. Obtenir un 2 L seau claire, et remplir avec 22 ° C de l'eau. Placez le seau sur une table, et essayer d'assurer l'éclairage est réglé pour minimiser les ombres et les reflets.
2. Si l'on utilise un logiciel de suivi, positionner la caméra juste au-dessus du godet.
3. Mettre en place un logiciel pour que la souris est facilement visible à l'écran.

4.2) acclimatation et d'essai

1. Déplacez souris expérimentales dans le ro comportementaleom 1 h avant le test pour acclimater les environs. Laissez les souris dans leur cage pour l'acclimatation.
2. Allumez l'appareil photo à la bande de la tâche comportementale. Doucement, placez la souris dans le milieu du seau d'eau. Veillez à ne pas laisser tomber la souris dans. Abaissez lentement la souris, de sorte que ses pieds avant touchent l'eau en premier. Prenez soin d'éviter de submerger leur tête.
3. Réglez la minuterie pour 6 min, et pas loin de la zone de comportement.
4. Une fois 6 min sont en place, retirer la souris dans le seau, et essuyez l'excès d'eau avant de placer la souris de retour dans leur cage.

4.3) Scoring

1. Si vous utilisez un logiciel de suivi, mis pour cent immobilité à 11%, tel que suggéré par Noldus (cela devrait être le réglage par défaut), pour quantifier le temps flottant vs piscine.
2. Pour quantifier en utilisant le système de suivi, allez dans l'onglet d'analyse, puis cliquez sur le mouvement sous des profils d'analyse. Supprimer les catégories actuellement définies, puis sélectionnez l'état de mobilité, surle panneau latéral gauche (sous le comportement individuel). Ensemble immobilité à 11%.
3. Sélectionnez la piste de visualisation, sous l'onglet Résultats. Sélectionnez sortie d'analyse (sous l'onglet de résultats) pour afficher les résultats. Un tableau énumérant le temps passé immobile pour chaque essai devrait apparaître.
4. Si le ballon de la main, mesurer le temps de la souris passe la natation ou l'escalade, et la quantité de fois que la souris passe immobile. En outre, de mesurer la latence à la première immobile temps. Voir Figure 2 dans la section Résultats.

Representative Results

Injection stéréotaxique précise repose largement sur la définition des coordonnées correctes. La pointe de l'aiguille utilisée pour injecter le virus devrait être fixé directement sur ​​l'intersection de bregma et la ligne interauriculaire (Figure 1). Il est utile d'utiliser une loupe binoculaire pour déterminer si oui ou non l'aiguille est correctement placé. Lorsque l'on regarde au microscope, l'aiguille doit être positionnée de sorte que si le virus a été injecté, il se poser directement sur l'intersection de la ligne et bregma interauriculaire. Autrement dit, l'ouverture de l'aiguille de la seringue doit être placé directement au-dessus de l'intersection. Dans cette étude, un lentivirus exprimant shRNA contre RBM8a, un facteur essentiel dans le complexe de jonction exon, a été injecté dans le corps godronné. Le lentivirus exprime également RFP pour étiqueter les neurones infectés. La figure 2 montre que le virus a été injecté dans la région correcte comme indiqué par le signal rouge (Figure 3).

_content "> Pour parvenir à une signification dans des tâches comportementales, la taille de l'échantillon devrait vont de 12 à 15 souris par groupe. tâches comportementales peuvent être effectuées deux semaines après les injections stéréotaxiques. Dans l'OFT, un phénotype anxieux est présent si les souris passent beaucoup moins de temps dans le centre du champ ouvert par rapport au groupe témoin. Les résultats indiquent que le knock-down de RBM8a dans le gyrus denté de souris adultes conduit à des comportements d'anxiété (p <0,05, figure 4). Dans le FST, il n'y avait pas de différence observable dans immobilité entre le contrôle et les souris expérimentales, suggérant que RBM8a effet de choc dans le gyrus denté ne modifie pas le comportement anti-dépressif (Figure 5). L'analyse statistique a consisté à effectuer un test t de variance de deux échantillons inégale bilatéral.

Figure 1: Intersection de Bregma et l'InterLigne sonore. Pour les injections stéréotaxiques, l'aiguille de la seringue doit être aligné avec l'intersection de bregma et la ligne interauriculaire. Ce point est fixé à zéro.

Figure 2: Schéma Illustrating le scénario pour l'expérience entière.

Figure 3: Représentant tranche de cerveau illustrant injection réussie de virus dans le gyrus denté La barre d'échelle = 100 um..

Figure 4: la quantité de temps que les souris contrôles et expérimentaux dépensés dans le centre d'un roman Open Field souris expérimentales passent sign.icantly moins de temps dans le centre de l'arène, indiquant un phénotype anxieux (N = 9-11, *, T ₁₈ = -2,72, p <0,05, moyenne SEM)

Figure 5:. La quantité de temps que le contrôle et la souris expérimentales sont Immobile dans le FST souris expérimentales ne diffèrent pas de contrôles dans le temps passé immobile (N = 9-11, ₁₈ T = 1,25, p> 0,05, moyenne SEM)

Discussion

Injections stéréotaxiques succès reposent sur trois facteurs: en gardant la souris vivante, le réglage du point zéro correct pour coordonnées (pointe de l'aiguille sur l'intersection de bregma et la ligne interauriculaire), et le réglage de la bonne profondeur au point zéro (pointe de l'aiguille juste toucher l'extérieur du tissu cérébral). La viabilité des souris est important. la survie de la chirurgie peut être facilitée en faisant en sorte que la souris est correctement anesthésié et reçoit analgésique adéquat. La douleur est connu pour être une cause majeure de mauvaise récupération après la chirurgie. Veiller à ce que la souris est totalement anesthésié au long de la chirurgie (il ne doit pas répondre à pincées de pied), et de donner la bonne dose d'analgésique (basé sur le poids de la souris), devrait contribuer à la survie. ¹⁷ En outre, la souris doivent être tenus en un coussin chauffant au long du processus de la chirurgie jusqu'à ce qu'il se réveille de l'anesthésie. Les souris ne peut pas réguler leur température corporelle quand ils sont anesthésiés. Leur humeur du corpsature va baisser de façon significative au cours du processus de la chirurgie. Même si la durée de la chirurgie stéréotaxique est relativement courte, l'hypothermie pourrait gravement porté atteinte à la survie de la souris. Une bonne technique de suture est également contribué à la réalisation d'une opération réussie. Souris va essayer de chercher à leur sutures, il est donc crucial de faire en sorte que les sutures sont suffisamment serré pour empêcher l'enlèvement, mais pas trop serré pour mettre trop de tension sur la plaie. Quatre nœuds dans chaque point doivent veiller à ce que la souris ne peut pas supprimer la suture. Suture appropriée est importante comme une plaie ouverte va augmenter la sensibilité aux infections, ce qui affecterait négativement les expériences comportementales.

L'OFT est un paradigme comportemental conçu pour évaluer la locomotion et le phénotype anxieux chez la souris. Lors du test de comportement de la souris, il est important d'être très prudent lorsque vous manipulez les souris et la mise en place de l'arène. Dans l'OFT, le paradigme est conçu pour coupler l'appréhension de la souris when placé dans un nouvel environnement, avec sa curiosité naturelle et le désir d'explorer la nouveauté. Une souris de type sauvage sera d'abord hésité à entrer dans le centre du champ ouvert, où il est plus vulnérable, mais finira par le faire, en raison de sa curiosité innée. Dans une souris anxieuse, l'appréhension de la traversée d'un espace plus vulnérables (le centre du champ) sera supérieure à leur curiosité naturelle et le désir d'explorer, ce qui entraînera beaucoup moins de temps passé dans le centre. Pour vous assurer que le paradigme fonctionne correctement, il est important de minimiser le stress associé à des facteurs autres que le champ ouvert. Le stress peut être minimisée en permettant la souris pour acclimater à la salle de comportement (si l'environnement extérieur est pas une variable de confusion possible), et nettoyer le terrain entre les souris, afin de garantir que toutes les odeurs associées à la souris précédente ont été retirés ^18. Ces mesures devraient aider à éliminer les différences qui sont causées par mal handlisouris Ng. Dans cette étude, les souris knock-down RBM8a passé beaucoup moins de temps dans le centre d'un roman plein champ, par rapport aux témoins. Ceci est révélateur d'un phénotype anxieux, puisque les souris sont plus réticents à entrer dans le milieu du roman plein champ, où ils sont plus vulnérables, par rapport aux témoins.

La FST cherche à étudier le phénotype anti-dépressif chez la souris. Lorsqu'il est placé dans un seau d'eau, les souris qui passent beaucoup moins de temps par rapport piscine flottante sont considérés comme ayant un phénotype anti-dépressif. Immobilité dans le test de la nage forcée est interprété comme désespoir comportemental (par exemple, abandonner). Ce paradigme est validé par un traitement anti-dépresseur. ^7,8,9 souris qui reçoivent des médicaments anti-dépresseurs passent beaucoup moins de temps flottant par rapport aux témoins, ce qui est indicatif d'un phénotype anti-dépressive. Dans cette étude, les souris knock-down RBM8a ne différait pas significativement de souris de contrôle du temps passé immobile. This indique que RBM8a effet de choc dans le gyrus denté de souris adultes ne provoque pas un phénotype dépressif, ou anti-dépressive. Dans notre étude précédente, la surexpression RBM8a dans le gyrus denté de souris adultes diminue de manière significative le temps immobile par rapport aux témoins, ce qui indique un effet anti-dépressif. ¹⁶

Les injections stéréotaxiques utilisées pour la représentation dans le présent document ont été ciblés pour le gyrus denté. Le corps godronné a été choisi comme site cible, étant donné que le gène d'intérêt, il est fortement exprimé dans la souris adulte. En outre, le corps godronné a été associée à la dépression et l'anxiété. Par exemple, une étude a utilisé des souris POMC-ChR2 pour activer sélectivement les cellules granulaires soit dans la dorsale ou gyrus denté ventrales. L'activation de la fois la dorsale et ventrale gyrus denté mené à l'exploration accrue d'un nouvel environnement, indiquant un rôle potentiel du gyrus denté de l'anxiété. ¹⁹ Une autre étudeconstaté que les souris avec facultés affaiblies neurogenèse avait augmenté immobilité dans la FST, indiquant un phénotype dépressif. ²⁰ En outre, l'activation de Ap o ₁ dans le cerveau antérieur conduit à un effet anti-dépressif dans la FST, l'alimentation nouveauté supprimée, et test de consommation de saccharose. Lorsque VEGF était assommé dans le gyrus denté de Ap o _1, ce phénotype anti-dépressif a été perdu. ²¹ Ces données suggèrent que le gyrus denté a un rôle dans la physiopathologie de l'anxiété et la dépression, et a indiqué que le gyrus denté peuvent être un bon endroit pour cibler pour notre modulation génétique et expériences comportementales. Un lentivirus a été utilisée spécifiquement, de sorte que toutes les cellules dans le corps godronné seraient infectées, par opposition à des cellules ne se divisant (rétrovirales).

Une combinaison de ces trois modèles expérimentaux (en plus d'autres tâches comportementales) est une façon nouvelle d'évaluer phénotypes comportementaux chez la souris, car un virus peut être injecté dans un specific zone du cerveau à des moments spécifiques de développement. En utilisant des injections stéréotaxiques d'un lentivirus jumelé avec des tâches comportementales ne prend que quelques mois à compléter et permet aux chercheurs de recueillir des données préliminaires sur les effets comportementaux de l'expression des gènes dans une zone spécifique du cerveau. En revanche, les souris knock-out conditionnelles prennent souvent des années à générer. En outre, le type de cellule préférence de virus peut être utilisé pour cibler des cellules de plus. Par exemple, les retrovirus ne peuvent infecter les cellules en division (telles que les cellules souches neurales dans le gyrus denté) tandis qu'un lentivirus infecte tous les types cellulaires. ^22,23 Ainsi, avec co-injection, ces protocoles expérimentaux largement utilisés et individuellement validés fournissent un mini mais de manière globale pour tester le rôle d'un gène spécifique dans une zone du cerveau ciblée, sur les comportements de souris.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder