Summary
As células humanas mieloma múltiplo (MM) requerem o microambiente favorável de células mesenquimais e componentes da matriz extracelular para a sobrevivência e proliferação. Nós estabelecemos um modelo vivo de embriões em frango com células de mieloma e mesenquimais humanas enxertados para estudar os efeitos de medicamentos contra o câncer no crescimento do tumor, invasão e angiogênese.
Abstract
O mieloma múltiplo (MM), uma doença maligna de células plasmáticas, permanece incurável e novas drogas são necessárias para melhorar o prognóstico dos pacientes. Devido à ausência do microambiente do osso e factores de crescimento auto / parácrina células MM humanos são difíceis de cultivar. Portanto, existe uma necessidade urgente de estabelecer adequada in vitro e em sistemas de cultura in vivo para estudar a acção de novas terapias em culas do MM humanos. Aqui é apresentado um modelo para crescer as células de mieloma múltiplo humano num ambiente 3D complexo in vitro e in vivo. Linhas celulares de MM OPM-2 e meio RPMI-8226 foram transfectadas para expressar o transgene GFP e foram cultivadas na presença de células mesenquimais humanas e de colagénio do tipo I como matriz esferóides tridimensionais. Além disso, os esferóides foram enxertados sobre a membrana corioalantóica (CAM) de embriões de galinha e o crescimento do tumor foi monitorizado por meio de microscopia de fluorescência estéreo. Ambos os modelos permitem o estudo do romance dru terapêuticogs em um ambiente 3D complexo e a quantificação da massa de células de tumor após a homogeneização dos enxertos em um GFP-ELISA específicos do transgene. Além disso, as respostas angiogénicas do hospedeiro e a invasão de células tumorais para o tecido hospedeiro subjacente pode ser monitorizado diariamente por um microscópio estéreo e analisadas por coloração imuno-histoquímica contra células humanas de tumor (Ki-67, CD138, vimentina) ou células hospedeiras murais cobrindo vasos sanguíneos (desmina / ASMA).
Em conclusão, o sistema onplant permite estudar o crescimento de células MM e angiogénese num ambiente 3D complexo e permite o rastreio de novos compostos terapêuticos que visam a sobrevivência e proliferação das células do MM.
Protocol
De acordo com o direito austríaco, e do Gabinete do Laboratório Animal Welfare dos EU Public Health Service embriões de aves não são considerados como animais vertebrados vivos até hatching.The NIH Office of Laboratory Animal Welfare providenciou orientações escritas neste domínio (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm e Publicação NIH Nº .: 06-4515).
1. celular Cultura e Lentivirus Transfection
- Cultura linhas celulares MM OPM-2, meio RPMI-8226 e as células estaminais mesenquimais humanas a partir de medula óssea em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro bovino fetal de vitelo e 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e glutamina 2 mM na presença de 5% de CO2 a 37 ° C.
- Transfectar 5 x 10 6 células HEK 293FT com mistura de ADN virai de embalagens (9 g) e 3 ug pLenti6 / V5 dest eGFP vector através da utilização de 30 ul de reagente de transfecção lipossómica e meio de transfecção (10 mL). Remover o meio de transfecção após 12 h eadicionam-se 10 ml de meio DMEM com 10% de soro de bezerro de bovino e 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA).
- Após 5 dias, recolher sobrenadantes de células HEK293FT após a centrifugação das células de natação (1000 xg, 5min). Determinar título viral por PCR em tempo real como descrito noutros locais 28.
- Transfectar 1 x 10 6 culas de MM com partículas lentivirais eGFP (1 x 10 5) partículas em uma placa de 24 poços em meio de crescimento completo. Após 3 dias, iniciar o processo de selecção por adição de 2 ug / ml de blasticidina para o meio de cultura. Para o lentivírus eGFP disponível comercialmente, utilizar 500 ug / ml de neomicina.
- Após 2 semanas de selecção, aglomerados de células que expressam eGFP MM irá aparecer; coletar células por centrifugação (1000 x g, 5 min) e expandi-los como OPM-2 eGFP e RPMI-8226 sublinhas eGFP para experimentos (seção 2 e 3).
2. 3D-Multiple Myeloma Modelo Esferóide
- Solução de colágeno tipo I Frio e 10 x DMEM oN gelo.
- Misture 10/01 Volume de 10 x meio DMEM em matriz de colágeno; adicionar NaOH (0,2 N) para neutralizar a solução de colagénio ácida a um valor de pH de 7,4; loja de colágeno / solução médio no gelo.
- Misture linhas celulares MM transgênicos (OPM-2 eGFP ou RPMI-8226 eGFP; 250.000 por esferóide,) com células humanas mesenquimais (50.000 células / esferóide, ou seja, queda de 30 mL).
- Centrifugar mistura de células em tubos de 15 ml (1.000 xg, 5min), adicione a mistura de colagénio preparado frio (1 mL) ao sedimento de células e misturar bem (1000 uL com ponta).
- Imediatamente pipeta 30 ul da mistura de colagénio / célula (com ponta 100 ul) numa placa de 24 poços em filme de parafina estéril e permitir mistura célula / colagénio para polimerizar durante 30 minutos a 37 ° C (ver Figura 1A).
- MM esferóides de sobreposição com meio de cultura contendo 1 mL de 1, 10 e 100 nM bortezomib (ver Figura 1B).
- Após 72 horas de incubação a 37 ° C, esferóides de documentos porestereomicroscopia de fluorescência (ver Figura 1C).
- Transferir cada esferóide pelo uso de fórceps com maxilas lisas de largura num tubo de reacção para a medição de GFP (ver Figura 1D).
3. 3D do mieloma múltiplo Xenoenxerto Modelo no CAM
- Incubar ovos de galinha em uma incubadora de ovos de aves especial a 37 ° C e 70% de humidade durante três dias.
- Em seguida, abertas e ovos embriões de transferência para esterilizados com etanol, quadrada, de 10 cm de pesagem de plástico de cultura de células com barcos placa da tampa e incubar "ex ovo" para mais de seis dias, de modo que o CAM é capaz de desenvolver (ver Figura 2A).
- Solução de colagénio de tipo I Frio e 10 x DMEM em gelo, mistura 1/10 de volume de 10 x em meio DMEM matriz de colagénio, adiciona-se NaOH (0,2 N) para neutralizar a solução de colagénio ácida a um valor de pH de 7,4; loja de colágeno / solução médio no gelo.
- Misture linhas celulares de MM transgénico (OPM-eGFP ou 2RPMI-8226 eGFP; 250.000 por esferóide,) com células mesenquimais humanas (50.000 células / esferóide).
- Centrifugar as células em tubos de 15 ml (1.000 xg, 5 minutos, para cada composto de teste um frasco), adicionar 1 mL de mistura de colagénio preparada a frio com o fármaco (a concentração de trabalho pretendida) à pelete de células e misturar bem (1000 uL com ponta).
- Coloque colagénio gotas (30 ul cada) em parafilme em um patê 6 bem durante 30 min para permitir que a polimerização da matriz extracelular, a 37 ° C.
- Transferência "onplants" do passo 3.6 com a utilização de uma pinça para a superfície da CAM não tratada (2 cm de distância do embrião) de embriões de galinha de 9 dias de idade (4 onplants para cada embrião de frango, ver Figura 2B)
- Após 5 dias de crescimento in vivo em uma incubadora de ovos a 37 ° C e 70% de humidade, xenoenxertos de documentos por estereomicroscopia de fluorescência (ver figura 2C). Euthanize embriões de galinha por hipotermia a 4 ° C no frigorífico durante 5 h.
- Remover xenografts com tecido CAM subjacente por uma tesoura oftálmica e forceps com grandes mandíbulas planas. Use-os para a medição da GFP (seção 4, veja a Figura 2D) ou para análise imuno-histoquímica dos vasos sanguíneos e / ou invadindo células tumorais (Seção 5).
4. Quantificação de Proteína eGFP por ELISA
- Transferir cada esferóide MM ou xenoenxerto excisada em 0,5 ml de tampão RIPA contendo inibidores de protease / ml 200 ug.
- Homogeneizar esferóide / xenoenxerto com um homogeneizador de tecidos em gelo.
- Execute três congelamento / descongelamento ciclos em nitrogênio líquido e 37 ° C banho de água.
- Centrifugar homogeneizado a 4 ° C durante 20 min (12.000 g) e os sobrenadantes da loja.
- Diluir as amostras de 1:20 em tampão de ensaio (200 ul) de o kit de ELISA. Medir-níveis GFP GFP por um kit de ELISA comercial utilizando anticorpos anti-GFP biotinilados, de acordo com o protocolo do fabricante.
5. Immunohistochemical Análise de vasos sanguíneos e invadindo células tumorais
- Fix xenoenxertos excisado com área CAM em paraformaldeído a 4% O / N a 4 ° C.
- Coloque xenoenxertos fixos em cassetes de embebimento e transferi-los para uma estação de incorporação de tecido com uma série crescente álcool graduado (50%, 70%, 80%, etanol a 95%, xileno e parafina; cada passo 60 min).
- Xenoenxertos de secção (5 ^ m) através da utilização de um micrótomo rotativo de bancada. Coza secções de parafina em lâminas de vidro O / N a 56 ° C.
- Desparafinar secções por uma série de álcoois graduados diminuindo a água duplamente destilada (xilol, 95%, 80%, 70%, etanol a 50%, água bidestilada; cada passo 10 min).
- Executar a recuperação de antigénio em um banho de água (95 ° C, 20 min) com uma solução de recuperação de antigénio (citrate- tampão, pH 7,0, volume 100 ul).
- Bloquear a actividade da peroxidase endógena com 100 ul de 3% de H 2 O 2 / metanol durante 30 min.
- Seções bloco em PBS contendo10% de soro fetal de vitelo durante 45 min (volume 100 ul).
- Mancha durante 1 h com 100 uL de anticorpo primário (1 ug / ml) diluído em PBS contendo 1% de soro de vitelo fetal, à TA.
- Após lavagem três vezes em PBS, incubar durante 1 hora com o anticorpo secundário biotinilado (0,1? G / ml) em PBS contendo 1% de soro de vitelo fetal, à TA.
- Após lavagem três vezes em PBS realizar a reacção de cor por a solução de avidina / (DAB) de substrato-biotina complexo (ABC) e o diaminobenzidina de acordo com as instruções do fabricante.
- 5.11. Parar a reacção por transferência de secções de água duplamente destilada, de contraste com hematoxilina e montar secções com um meio de montagem sintético.
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Representative Results
Na análise in vitro de compostos alvo em 3D mieloma múltiplo ensaios esferóides
Devido à limitação da cultura de culas do MM in vitro humanos primários estabelecemos novos modelos in vitro de cultura 3D para linhas celulares MM humanos que utilizam uma matriz extracelular e crescimento de células mesenquimais humanas primárias de suporte a partir de medula óssea (Figura 1A, B). Linhas celulares MM transgênico EGFP permitir a visualização e quantificação da massa tumoral MM após o crescimento 3D em esferóides. Ambas as linhas celulares de MM OPM-2 eGFP e meio RPMI-8226 eGFP foram cultivadas durante 3 dias na presença de concentrações crescentes (1- 100 nM) de bortezomib e tumores foram visualizadas por a expressão da GFP em um microscópio de fluorescência estéreo (Figura 1C) . De massa de células de tumor foi quantificada após homogeneização de esferóides e medição conteúdo eGFP por um ELISA-GFP (Figura 1D).
Na análise in vivo de compostos alvo em xenoenxertos de mieloma múltiplo em embriões de galinha
Três embriões de galinha dias de idade foram cultivadas ex ovo durante 6 dias e no dia 9 utilizadas para enxerto de células mM (Figura 2A). EGFP células de mieloma transgénicos (OPM eGFP-2) em conjunto com as células mesenquimais da medula óssea humana foram incorporados em colagénio do tipo I como componente da matriz extracelular. O bortezomib substância alvo foi aplicada topicamente em 1 nMol (Figura 2B). Para cada animal de 4 "onplants" foram enxertados sobre a membrana corioalantóica (CAM) de embriões de galinha. Após 5 dias, MM xenoenxertos de tumores formados que podem ser visualizadas pela expressão de eGFP. Comparado com os controlos, o bortezomib inibiu o crescimento de culas de MM em xenoenxertos. Enxertos apresentaram menor MM verde massa de células tumorais (Figura 2C). Xenotransplantes MM solteiro a partir de three diferentes animais (n = 12) foram excisados, homogeneizados e em seguida, medida por ELISA GFP. Em comparação direta com controles xenoenxertos tratados bortezomib-teve uma significativa redução da massa de células de mieloma (Figura 2D).
Análise in vivo das respostas angiogénicas e invasão de xenoenxertos de mieloma em embriões de galinha
Respostas angiogénicos ao redor onplants pode ser observado em lupa estereoscópica. A vascularização de enxertos foi significativamente reduzida nos xenoenxertos tratados com a droga (de 1 nmol Plitidepsin, Figura 3). Respostas angiogénicas foram quantificados por contagem de vasos sanguíneos em onplant germinadas tal como descrito para o ensaio de esponja de gelatina por Ribatti et al. 21.
Para a análise de invasão, xenoenxertos foram excisados com a área adjacente CAM. Os xenoenxertos foram fixados, embebidos em parafina e cortes preparados (Figura 4 (figura 4).
Figura 1. 3D mieloma múltiplo Spheroids. (A) Geração de OPM-2 eGFP e RPMI-8226 esferóides eGFP com células primárias humanas mesenquimais da medula óssea e colágeno tipo I como componente da matriz extracelular. (B) Spheroids foram incubadas com meio de cultura e respectiva concentração de bortezomib (1- esferóides 100 nM). (C) MM foram cultivadas durante 3 dias e fotografada por um microscópio estéreo-fluorescência. As barras indicam a 500? M. (D) SPH Individualeroids foram homogeneizados em tampão de lise e, posteriormente, medido num ELISA de GFP. GFP concentrações de esferóides individuais foram calculados (n = 5, média ± SEM). Estrelas indicam valores de p <0,05; Co. = controle; BZB = bortezomib. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. mieloma múltiplo Xenoenxerto Modelo. (A) No dia 9 do desenvolvimento foram utilizados embriões ex-ovo de galinha para enxerto experiências. (B) OPM-2 eGFP e meio RPMI-8226 eGFP foram misturados com as células mesenquimais da medula óssea humanas primárias, colagénio do tipo I como componente da matriz extracelular e com 1 nM de bortezomib. Depois de esferóides de solidificação (n = 4) foram enxertados sobre a membrana corioalantóica de embrião de galinhas. (C) após 5 dias MM enxertos na CAM podem ser visualizadas com a expressão de eGFP. Xenotransplantes podem ser fotografadas diariamente por um microscópio estéreo de fluorescência. As barras indicam a 500? M. (D) xenoenxertos MM individuais foram excisadas com o tecido de CAM subjacente, homogeneizado em tampão de lise e medido num ELISA de GFP. GFP concentrações de tumores individuais foram calculados (n = 12, média ± SEM). Estrelas indicam valores de p <0,05; BZB = bortezomib. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise de angiogénese mieloma. MM xenoenxertos (OPM-2 eGFP) foram documentados cinco dias após o transplante na CAM de embriões de galinha. Em comparação com o controlo enxertos, tratament com plitidepsin (1 nmol, n = 10) resultaram em tumores superficialmente crescentes que foram menos vascularizada por tecido CAM. Os vasos sanguíneos que crescem para os onplants (vermelhas) foram contadas como descrito no modelo gráfico de tipos de vasos sanguíneos. As barras indicam um milímetro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Análise da invasão de células de mieloma. Análise imuno-histoquímica de xenotransplantes MM (OPM-2 eGFP) com tecido hospedeiro CAM subjacente (tratados com bortezomib em comparação com controlos). Proliferação de células MM humanos manchar positiva para Ki-67, CD138 e Vimentina e invadir como aglomerados de células tecido hospedeiro. Vasos sanguíneos frango estão manchadas com marcadores de células mural Asma (navios de maior porte e artérias) e desmina (capilares). Magnificatiem 200x, asteriscos indicam vasos sanguíneos da CAM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para refractário MM requer menos demorado e caro sistemas in-vivo para avaliar a sensibilidade de culas de MM humano para drogas. Até à data, poucos sistemas in vivo estão disponíveis para a avaliação pré-clínica de novas terapias anti-mieloma. Todos eles têm as suas limitações para o rastreio em larga escala de bibliotecas de compostos 29.
Os melhores modelos atuais para células MM humanos são altamente ratos imunodeficientes 7,13,30 e embriões de peru 29. Tanto o ratinho SCID e modelos de xenoenxerto de embrião de aviário pode ser utilizado para estudar a biologia do MM e para testar novos compostos terapêuticos. No entanto, os sistemas de murino tem várias limitações, incluindo o genótipo inato, procedimentos tecnicamente exigentes, longos períodos de observação e custos elevados.
Neste estudo, um esferóide romance 3D e modelo de xenoenxerto de aviário é apresentado para o estudo da biologia celular MM humano que envolve a presença de mes humanosenchymal células-tronco e da matriz extracelular como componentes de apoio. Culas do MM dependem fortemente da sua respectiva microambiente, ou seja, a presença de factores de crescimento derivados de estroma, citoquinas e componentes da matriz extracelular para sobreviver e proliferar 31-33. Além disso, a droga pode ser ineficiente ou exibir atividade alterada quando as células de mieloma são protegidos por seu microambiente locais 31,34.
Em comparação com modelos murinos, o 3D descritas in vitro e em sistemas de modelos in vivo não são caros, rápido e fácil de manusear. Além disso, o transplante de MM 3D esferóides de embriões de galinha permite a análise da angiogénese induzida por mieloma. Uma limitação deste sistema é o curto período de tempo do crescimento celular e, assim, MM, análise de metástases para ossos de aves não é possível. Uma outra limitação dos nossos modelos é que nós trabalhamos com a aplicação tópica de drogas no CAM que pode não refletir a aplicações sistemáticas e volume de negócios de drogas / alteração de enzimas hepáticas. EmAdicionalmente, uma taxa de sobrevivência de cerca de 50% até ao enxerto foi observada devido a condições de crescimento ex ovo de embriões de galinha. Quanto marcadores endoteliais para análise IHC, a maioria dos marcadores utilizados na secção de humano e de rato para corar as células endoteliais não são específicos para os vasos sanguíneos na galinha. Portanto, recomendamos coloração para os marcadores de células mural desmina / ASMA ou a injeção de lectinas em embriões de galinha 35. Nem todas as linhas celulares de mieloma humano disponíveis irá crescer invasiva no tecido do hospedeiro frango e exibir crescimento superficial. Isso resultará em tecido destruído após o corte secções do micrótomo. Além disso, deve ser tomado cuidado especial (antibióticos selecção) que células transfectadas não perder a expressão do transgene GFP dentro do tempo, devido a rearranjos genéticos permanentes ou processos de metilação do DNA.
Em conclusão, o nosso modelo de xenotransplante de células de embrião de galinha MM humanos com o apoio do estroma fornece um modelo in-vivo reproduzível e previsível para stucrescimento humano dy célula MM e angiogénese. Este modelo descrito MM pode facilitar mais rápido in vivo processos de triagem de drogas anti-MM, ajudando a reduzir o tempo de desenvolvimento e custos de novos medicamentos. Com novas medidas a melhorar, tais como material de substituição óssea, ECM matriz complexa e citocinas do sistema pode ser melhorado para testar terapias também contra amostras do paciente. Este é um pré-requisito para a medicina personalizada do câncer e teste de sensibilidade às drogas em pacientes individuais MM refratários.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
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