Abstract
Alkoholbruk störning (AUD) är en allvarlig hälsoutmaning. Trots en stor ärftlig komponent till AUD, har några gener entydigt inblandad i deras etiologi. Bananflugan, Drosophila melanogaster, är en kraftfull modell för att utforska molekylära-genetiska mekanismerna bakom alkoholrelaterade beteenden och har därför mycket lovande för att identifiera och förstå funktionen hos gener som påverkar AUD. Användningen av Drosophila modell för dessa typer av studier är beroende av tillgången på analyser som tillförlitligt mäter beteende svar på etanol. Denna rapport beskriver en analys som lämpar sig för att bedöma etanolkänslighet och snabb tolerans flugor. Etanol känslighet mätt i denna analys påverkas av volym och koncentration av etanol som användes, en mängd av tidigare rapporterade genetiska manipulationer, och även den tid flugorna är inrymda utan mat omedelbart före testning. I motsats, etanol sensitivity mätt i denna analys påverkas inte av styrka i flugan hantering, kön av flugorna, och komplettering av tillväxtmedium med antibiotika eller levande jäst. Tre olika metoder för kvantifiering etanol känslighet beskrivs, som alla leder till väsentligen oskiljbara etanolkänslighetsresultat. Den skalbara karaktär denna analys, i kombination med dess övergripande enkelhet att installera och relativt låg kostnad, gör den lämplig för små och stora skala genetisk analys av etanol känslighet och snabb tolerans i Drosophila.
Introduction
Alkoholbruk störning (AUD) är en enorm hälsoproblem i världen (över i 1). Även om mekanismerna som driver utvecklingen av AUD är komplexa, dessa störningar har stor genetisk komponent (t.ex. 2). Den stora ärftlighet på AUD och de bevarade beteendereaktioner till etanol över många arter (granskade i 3,4) har genererat starkt intresse av att använda genetiska modellorganismer för att undersöka medverkan av specifika gener i etanolrelaterade beteenden mot bättre förstå molekylära grunden för AUD. Bananflugan, Drosophila melanogaster, har vuxit fram som en ledande modellorganism för att utforska molekylära-genetiska mekanismerna för etanolrelaterat beteende (granskas i 3,4). Studier på flugor har belyst roller i flera signalvägar i beteende svar på etanol (granskas i 5). Intriguingly några av de gener och signalvägar som påverkar beteende responses till etanol i flugor har också varit inblandad i gnagare etanolrelaterade beteenden och / eller mänsklig AUD (t.ex. 6-14). Bevarandet av mekanismer driver etanolrelaterade beteenden över arter, tillsammans med sviten av genetiska verktyg som finns i Drosophila modellsystem, understryker nyttan av bananfluga modell för att undersöka genetiken bakom beteendemässiga reaktioner till etanol.
Känslighet 15,16 och tolerans (ses över 17) till etanol i människor är kopplad till utvecklingen av AUD. Båda dessa beteende svar på etanol kan modelleras i flugor via en mängd olika laboratorieanalyser (ses över 3,4). Samtliga flyga analyser som är kända för att författarna är baserade på antingen tidsberoende etanol-inducerad sedering / nedsatt koordination eller tidsberoende återhämtning från etanol sedering.
I en tidigare artikel från vår grupp på genetik etanolkänslighet och rAPID tolerans i Drosophila, var en beteendeanalys baserad på etanolånga-inducerad sedering av flugor som används 18. Testning i denna analys initierades genom att överföra levande vuxen flyger utan bedövning för att tömma mat flaskor, fånga flugor i rören med en cellulosaacetat plugg, lägga etanol till toppen (dvs icke-fly sidan) av cellulosaacetat pluggen, och tätning flaskan med flugor, cellulosaacetat plugg och etanol med en silikonpropp (se schema i figur S3, referens 18). Flera flaskor som representerar olika grupper av flugor bedömdes parallellt, öka genomströmningen av denna analys. Flaskor fick en anonym kod och praktiker var förblindade till behandlingsgrupp för att förhindra oavsiktlig partiskhet i bedömningen av sedering. I ett standardexperiment, flugor i ampuller tappades försiktigt vid 6 minuters intervall, och efter en 30 sek återhämtning, räknades antalet sederade flugor i varje ampull räknas och converted till procent aktiva flugor. Flugor absorberade etanolånga från cellulosaacetat pluggen på ett tidsberoende sätt, vilket orsakar progressiva ökningar av intern etanol 18 och sedering (jfr referens 18 och figur 1A och 1B i denna rapport). Sedering i denna analys var operativt definierad som flugor (i) står i frånvaro av promenader eller (ii) som ligger på rygg med eller utan flaxa med vingarna. Här är denna etanol sedering analys som beskrivs i detalj, är ytterligare driftsoptimering är relevant för att använda det gav, och analysen används för att adressera bidrag livsmedels tillskott alternativ på fluga sedering känslighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dag Före analys
- Samla flugor i färska livsmedel flaskor i grupper om 11 (samma kön) under kort (1-5 minuter) CO2.
- Tillåt flugor att återvinna O / N i livsmedels ampuller på ett miljömässigt reglerade utrymmet (typiskt 25 ° C, 60% relativ fuktighet, 12 timmar ljus / mörker-cykel).
- Förbered etanollösning (er) genom att späda ren (100%) etanol i renat (≥18 Mohm) vatten till slutlig koncentration (er) lämplig för den planerade experimentet. Låt lösningen (s) för att återgå till RT O / N.
Anm: Utspädning av etanol är exotermisk.
2. Dag analys
- För varje flaska av flugor som ska testas, förbereda (i) en ren, tom mat flaska; dvs. provning flaska, (ii) en ny cellulosaacetat pluggen, (iii) en silikonpropp och (iv) en ml etanol-lösning (se tabell 3).
- Förbered testrum genom att justera temperaturen till 20-25 ° C och relativ fuktighet till 55-65%.
- Har en annan arbetaretilldela en unik kod för varje grupp av flaskor och registrera koden för senare. Placera kodade injektionsflaskor med flugor i provningsrummet för att acklimatisera sig under några minuter.
- Märk tomma testflaskor för att matcha koder på flyga flaskor från 2,3.
- Konstruera en papperskopia testning logg genom att ange koderna i kolumner (en kolumn / injektionsflaska) i ett kalkylblad som liknar tabell 1.
- Använda testloggen som en guide, ordna kodade livsmedelsinjektionsflaskor med flugor och tomma testflaskor i matchande matriser i testrummet.
Obs: En rimlig maximalt antal flaskor att testa är 24 (dvs, 6 uppsättningar av fyra flaskor vardera). - Transfer flyger från mat flaskor i matchade / märkta tomt testflaskor och omedelbart sätter cellulosaacetat pluggar in i testflaskor tills cellulosaacetat pluggar är 2 cm under flaskan toppar.
- Härefter hantera varje rad med fyra flaskor som en uppsättning på förskjutna 1 min intervaller.
- För tiden 0 bedömningen, ta tag varje flaska individuellt wed tummen och pekfingret, knacka försiktigt på bordet tre gånger för att slå flugor till botten av flaskan, vänta 30 sekunder och sedan räkna antalet flugor som är orörliga / döda. Registrera antalet orörliga / döda flugor för varje flaska vid tiden 0 min i pappersprovning loggen.
- Start timer som räknar upp kontinuerligt vid tiden 0 och omedelbart börja tillsätta 1 ml etanol till cellulosaacetat pluggar i flaskorna för den första raden / uppsättning av fyra flaskor. Tillsätt 1 ml etanol till cellulosaacetat pluggar i rören vid 5 sek mellanrum i den ordning de kommer att testas. Lägg etanol till cellulosaacetat pluggar i en cirkelrörelse så att etanolen absorberas jämnt hela cellulosaacetat pluggar. När etanol har lagts till samtliga fyra testflaskor i uppsättningen, infoga en silikonplugg i varje flaska för att täta den.
- Ibland 1, 2, 3, 4 och 5 minuter, tillsätt 1 ml etanol till de andra, tredje, fjärde, femte och sjätte uppsättningar av fyra flaskor, respektive. Fortsätt att sätta in silikon proppar eftersätta etanol till varje uppsättning av fyra flaskor.
- Vid tiden 6 min, testa den första uppsättningen av fyra flaskor genom att gripa varje flaska med tummen och pekfingret, knacka försiktigt på bordet tre gånger för att slå flugor till botten av flaskan, vänta 30 sek och sedan räkna och registrera det totala antalet flugor som sederade. Score flyger som drogad om de (i) står på golvet i flaskan men inte gå eller (ii) ligger på rygg med eller utan flaxa med vingarna.
- Hantera varje flaska inom uppsättningen på 5 sek intervall med hjälp av schemat i tabell 2.
- Ibland 7, 8, 9, 10 och 11 minuter, testa andra, tredje, fjärde, femte och sjätte uppsättningar flaskor, respektive, som gjort för den första uppsättningen.
- Vid tiden 12 minuter, testa den första uppsättningen av fyra flaskor igen enligt beskrivningen i 2.12 och fortsätta testa de andra, tredje, fjärde, femte och sjätte uppsättningar flaskor vid 13, 14, 15, 16 och 17 min.
- Fortsätt testa flugor som beskrivs i 2.12 tills alla flugor är sedated.
- Ange det totala antalet flugor i varje flaska i pappersprovning logg. Censurera orörliga / döda flugor vid tiden 0 från det totala antalet flugor.
- Beräkna procent aktiva flugor vid varje bedömning tidspunkt och plotdata som% aktiva flugor (y-axel) mot tid (x-axeln). Kvantifiera etanol sedering genom att interpolera sedering Time 50 värden (ST50, tid till 50% sedering) från tredje ordningens polynom eller sigmoidal kurva passar eller beräkna area under kurvan.
- Sammanställa data från avkodade flaskor och utföra statistiska analyser (t.ex. envägs ANOVA med Bonferroni multipla jämförelsetest) som är lämpligt för den experimentella designen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rådata från denna etanol sedering analys är antalet flugor som är sederade som en funktion av etanolånga exponeringstid. Rådata omvandlas till procent aktiva flugor som en funktion av tiden (primärdata, fig 1A, B, D - F). Känslighet för etanol sedering från de primära uppgifterna kan kvantifieras som Sedering Time 50 (ST50), den tid som krävs för 50% av flugor att bli Sedated eller AEA under kurvan (AUC), via interpolation från kurvan passar. Tidigare redovisade 18 tredje ordningens polynom kurvor passar de primära uppgifterna väl som förväntat (genomsnittlig R2 = 0,934, n = 24, Figur 1A), även om sigmoidala kurvor passar de primära uppgifterna något bättre (genomsnittlig R2 = 0,997, n = 24; Figur 1B). Som ett alternativ till att bestämma ST50 värden från kurvan passar, kan etanol sedering känslighet från de primära uppgifterna också kvantifieras som områdeunder kurvan (AUC,% aktiva flugor x tid) (Figur 1C). Resultaten från dessa tre metoder för kvantifiering korrelerar mycket väl med varandra (Pearson r 2 ≥0.998, n = 24) och är i huvudsak oskiljbara (Figur 1C), även om enheterna är nödvändigtvis olika för ST50 (min) och AUC (% aktiv flugor x tid). Detaljer kring alla beräkningar, kalkylblad används mm finns från motsvarande författare. Observera att högre och lägre värden på ST50 (eller AUC) indikerar trubbiga och förbättrad känslighet för etanol sedering, respektive. För överensstämmelse med den tidigare rapporten 18, var ST50 värden som härrör från tredje ordningens polynom kurva passar användas i resten av denna study.Importantly, detekterar analysen effekterna av RNAi mot Cnx14D (figur 1D) och mutationer i scb (Figur 1E) , aru och hppy (figur 1F),
Under rutinmässig användning av denna analys, tappning av injektionsflaskor med cellulosaacetat-pluggar fuktade med 2 ml etanol orsakade cellulosaacetat pluggar att färdas mot bottnarna av en del flaskor i några enstaka experiment (ej visade), och därmed potentiellt ändra flugorna arnas fria utrymme och koncentrationen av etanolånga. Dessutom cirka 0,25 ml etanol nått botten (dvs flyga sida) av cellulosaacetatet pluggarna då de vättes med 2 ml etanol (figur 2A) som lyfter möjligheten som flyger i dessa analyser exponerades för etanol vätska utöver till etanol ånga. Minskning av volymen av etanol i cellulosaacetat pluggen från 2 ml till 1 ml eliminerat nedåt migrationen av cellulose acetate plugg vid analysen även efter kraftig avtappning (icke visade) och även eliminerad mätbara mängder etanol lösningen på bottnarna av cellulosaacetat pluggarna (Figur 2A). Sedering av flugor var känslig för den mängd etanol som används även med volymer på mindre än 1 ml (Figur 1A - C). Använda 1 ml etanol därför hjälper till att bibehålla ett konstant öppet utrymme för flugor under analysen och säkerställer att vätske etanol inte intas. Flugor är därför förmodligen exponerad för etanol enbart som en ånga i denna analys. En ml 85% etanol (dvs ånga från en ml 85% (vol / vol) etanol) var och 1-5 dagar gamla w [A] flugor användes i alla efterföljande studier som rapporteras här om inget annat anges.
I försök med 24 flaskor, är flugor knackade försiktigt vid 6 minuters intervall för att låta försöksledaren att bedöma (dvs. gå igenom) alla flaskor på en rimlig, skriven schedule. ST50s från studier med kontroll flugor som använder färre flaskor och 5 minuters intervall var jämförbara med ST50s från studier med 6 minuters intervall (data visas ej). Flugor bedöms för sedering 30 sek efter tappning för att tillåta försöks tid att peka på en uppsättning av fyra ampuller i sekvens före bestämning av sedering status flugor i varje ampull. För att avgöra om skillnaderna i gäng vigör eller återvinning tid efter knacka slagetanol sedering känslighet, ST50 värden i manliga och kvinnliga kontroll flugor mättes samtidigt som knackade normalt (Regular) eller mycket kraftigt (Hard) och efter en standard 30 sek eller längre 60 sek återhämtning. Tapping vigör (Figur 2B) och återhämtning (figur 2C) hade ingen mätbar effekt på ST50 värden i kontroll män eller kvinnor.
Antibiotika kan användas för att undertrycka bakterietillväxt in fly livsmedelsmedium. För att bestämma om komplettering av livsmedelsmediet med antibiotika påverkar etanol sedering känslighet,ST50 värdena mättes i flugor som föds upp för en generation i närvaro eller frånvaro av tre antibiotika (ampicillin, 100 ug / ml, tetracyklin, 20 | ig / ml, kloramfenikol, 125 | ig / ml). Uppfödnings flugor på dessa tre antibiotika hade ingen effekt på etanol sedering känslighet (figur 2D).
Flugor överförs till tomma livsmedelsflaskor-och därför berövas mat och vatten för ~ 5 min-omedelbart före utsätts för etanolånga i sedering analysen. För att avgöra om den tid flugor hålls i tomma livsmedels flaskor innan initiering av analys effekter etanol sedering känslighet, var flugor svalt under 6 timmar (minst 70 gånger av normal) och sedan ST50 värden uppmättes. Svält i 6 timmar minskat betydligt ST50s i både manliga och kvinnliga kontroll flugor (Figur 2E). Även om effekten av svält på ST50 var relativt liten (9-14% i dessa experiment), den tid flyger spend i tomma flaskor innan de utsätts för etanolånga i analysen bör hållas likformigt över grupper inom ett experiment och även mellan experiment.
Laboratorie fluga mat kan kompletteras med levande jäst (t.ex. 18,20,23,24) för att främja produktion av avkomma. Till exempel, mat flaskor kompletterad med levande jäst (Saccharomyces cerevisiae) producerade vuxna tidigare än de med värmeavdödade jäst eller ingen levande jäst (jämför d10-d11, vita staplar, figur 3A), även om det totala antalet avkommor som produceras under 20 dagar var omöjlig att skilja i injektionsflaskor kompletterat med levande och värmeavdödade jäst (figur 3A). För att tillgodose möjligheten att levande jäst producerar meningsfulla mängder etanol på fluga mat, var effekterna av levande jäst på (i) etanol i livsmedelsmediet, (ii) etanol i flugor, och (iii) etanol sedering känslighet i flugor mäts. Mat medium kompletterat med levande jäst innehöll subdande mängder etanol jämfört med livsmedel kompletterat med värmeavdödade eller ingen jäst (figur 3B). Ändå kontroll flugor odlas på medium kompletterat med levande, dödades eller ingen jäst hade åtskillnad låga koncentrationer av intern etanol (figur 3C). Dessutom etanol sedering känslighet var omöjliga att skilja på kontroll flugor som odlas på medium kompletterat med värmeavdödade eller levande jäst (Figur 3D).
Figur 1. (AC) Sedering analysdataanalys alternativ. Kontroll w [A] honor (w 1118 isogen, Bloomington Indiana Drosophila Stock Center aktie # 5905) exponerades för ånga från de angivna volymerna av 85% (vol / vol) etanol. (A) Sedering tidskursdata passar med tredje order polynom. (B)Sedering tidskursdata passar med sigmoidala kurvor. (C) Etanol sedering känslighet kvantifieras som (vänster Y-axel) ST50 värden interpolerade från tredje ordningens polynom och sigmoidala kurvor eller (höger Y-axel) området under kurvan (AUC,% aktiva flugor x tid). Etanol volym, men inte analysmetod, påverkades etanolkänslighet (två-vägs ANOVA; effekten av volym, p <0,0001; effekten av analysmetod, ns, n = 8 / grupp; AUC data som överförs 1/100 att ta hänsyn till skillnaden i Storleken på den värden). (DF) representant tidskursdata från. (D) Redovisning av Cnx14D RNAi i nervsystemet (elav-Gal4 / v5597) trubbiga etanolkänslighet i förhållande till kontroller (v5597 / + och elav-Gal4 / + ). (E och F) Mutation av s cb (scb Vol2) och aru (aru 8,128) förbättrad etanol sedering känslighet och mutation av hppy (hppyKG5537) trubbiga etanol sedering känslighet jämfört med kontroller. Data i EF har tidigare redovisats som ST50 värden 18.
Figur 2. Bedömning av driftsparametrar i sedering analysen. (A) Mängd etanol i de nedersta två mm av cellulosaacetat pluggar. Volymen av etanol till topparna av cellulosaacetat pluggar haft en betydande effekt på volymen av etanol som flyttade in i de nedre 2 mm av cellulosaacetat pluggar under en mock 60 min experiment (envägs ANOVA, p <0,0001; * Bonferroni multipla jämförelsetest, 2 ml vs 0 och 1 ml, p <0,05 n = 4). Etanol kvantifierades som en förändring i massa cellulosaacetat pluggar. (B) Varken vigör för att trycka flaskorna under provning (Regular, Hard) eller kön av flugorna testade drabbade ST50s (två-way ANOVA; Effekten av att knacka, ns; effekten av kön, ns; n = 12) (C) Varken återhämtningstid efter knacka eller kön hade betydande effekter på ST50s (tvåvägs ANOVA;. effekten av återhämtningstiden, ns, effekten av kön, ns, n = 6) (D) Införande av antibiotika. (ATC, ampicillin, tetracyklin och kloramfenikol) i tillväxtmediet hade ingen övergripande effekt på ST50s, men det fanns en effekt av kön på ST50 (tvåvägs ANOVA, effekten av ATC, ns, effekten av kön, p = 0,001; interaktion , ns,. n = 6) (E) Effekt av svält på etanol sedering känslighet. ST50s var signifikant lägre i flugor berövats mat och vatten under 6 timmar (Starved) jämfört med normalt utfodras (Fed) flugor; ST50s i hanar och honor var oskiljbara övergripande (tvåvägs ANOVA, effekten av svält, p <0,0001, effekten av kön, ns, n = 12; * Bonferroni flera jämförelsetester, effekten av svält hos män och kvinnor, p <0,05) .
Figur 3. Effekt av levande jäst på tillväxt, etanolhalt och sedering känslighet. (A) Adult avkomma från flaskor innehållande livsmedel medium kompletterat med ingen jäst (Nej Y), värme dödade jäst (Killed Y) eller levande jäst (Live Y). Vita barer, vuxen avkomma växande under dagarna 10-11; grå staplar, dagar 12-20. Sammantaget hade jäst behandling en signifikant effekt på avkomman produktion (envägs ANOVA, alla (10-20) dagar, p <0,0001, dagarna 10-11, p <0,0001, dagarna 12-20, p = 0,0002; n = 5 ). Totalt antal avkommor produceras under alla (10-20) dagar var större från injektionsflaskor med Dödade Y och Live Y än Nej J (Bonferroni multipla jämförelsetest, p <0,05). Under dagarna 10-11, ampuller med Live Y producerade mer avkomma än Dödade Y och injektionsflaskor med Dödade Y producerade mer avkomma än No Y (vita staplar, Bonferroni flera jämförelsetester, p <0,05). Under dagarna 12-20, Flaskor with Dödade Y producerade mer avkomma än flaskor med No Y eller Live Y (grå staplar, Bonferroni multipla jämförelsetest, p <0,05). (B) Etanol i livsmedelsmediet var signifikant högre i ampuller kompletterat med Live Y jämfört med injektionsflaskor med No Y och dödade Y (envägs ANOVA, p <0,0001, n = 5; Bonferroni multipla jämförelsetest, p <0,05) (C) Intern etanol i w [A] var kvinnliga flugor inte påverkats nämnvärt av tillskott med jäst (en. -vägs- ANOVA, ns, n = 5-10). Etanol innehåll i B och C bestämdes såsom beskrivits 18 (D) ST50 värden påverkades inte signifikant av komplettering av tillväxtmediet med jäst i manlig eller kvinnlig w [A] (tvåvägs ANOVA;. Effekten av jäst, ns, effekt kön, ns, n = 12).
| ampull → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| kod → | ||||||||
| totalt # → | ||||||||
| 0 min | ||||||||
| 6 min | ||||||||
| 12 min | ||||||||
| 18 min | ||||||||
| 24 min | ||||||||
| 30 min | ||||||||
| 36 min | ||||||||
| 42 min | ||||||||
| 48 min | ||||||||
| 54 min | ||||||||
| 60 min |
Tabell 1: Typisk testning logg. Se protokollet steg 2.5.
| Vial | Tap | Bedöm |
| 1 | 6 min 0 sek | 6 min 30 sek |
| 2 | 6 min 5 sek | 6 min 35 sek |
| 3 | 6 min 10 sek | 6 min 40 sek |
| 4 | 6 min 15 sek | 6 min 45 sek |
Tabell 2:. Typisk avlyssning och testning schema Se protokollsteg 2.13.
| Namn på Material / Utrustning | Företag | Katalognummer | Kommentarer / Beskrivning |
| livsmedels ampuller | VWR | 89092-772 | smal |
| Flugs | Genesee / FLYGANDEuff.com | 49-102 | smal |
| silikonpropp | Fisher Scientific | 09-704-1l | # 4 |
| etanol | Farmakologiska, Aaper | 111000200 | 200 bevis |
Tabell 3: Material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkla analyser som reproducerbart kvantifiera menings fenotyper är av stort värde för analys av beteendet. Det arbete som beskrivs här tar upp flera praktiska aspekter av en analys för att mäta etanol sedering känslighet och snabb tolerans i Drosophila. Även om inte fokus i detta arbete, är beteende analyser underlättas genom att upprätthålla miljön och genetiska bakgrunden konstant för försökspersoner i en studie. Vidare bör jämförelser vanligen göras mellan grupper av flugor som fötts upp och testade sida vid sida. För detta ändamål, alla flugor inom enskilda experiment i detta arbete hade samma genetiska bakgrund och föddes upp sida vid sida på enhetliga miljöförhållanden (25 ° C, 60% relativ luftfuktighet, 12 timmar ljus / mörker-cykel) med standard mat medium (10 % sackaros, 3,3% majsmjöl, 2% jäst och 1% agar) med undantag av de experiment där maten mediet uttryckligen manipulerade.
ETHanol sedering analysen beskriven här kräver mycket få material (plastkärl, cellulosaacetat pluggar, silikonpropp och etanol), som alla är billiga och lätt tillgängliga från kommersiella källor (Tabell 3). Denna etanol sedering analys liknar och till stor del bygger på tidigare rapporterade metoder (t.ex. 6,20,25-27, utför granskas i 3,28). Även om alla dessa analyser har användbarhet för mätning av etanol sedering känslighet, fördelar med analysen beskriven här är bland annat: (i) flugor inte är utsatta för vätske etanol under analysen, (ii) den reducerade möjligheten som flyger kan bli intrasslad i bomull eller annat material i testflaskan under analysen, (iii) möjligheten att testa många grupper av flugor parallellt, och (iv) tre alternativ för objektiv kvantifiering av etanol känslighet från primära datamängder. Tillsammans utgör dessa fördelar eliminerar i stort sett möjligheten som flyger dricka etanol, that etanol kunde väta de yttre ytorna av flugor och därigenom hämmar deras övergripande motoriska förmågor, och att resultatet för flugor i analysen kunde förväxlas med svårigheter i samband med snärjande material i testmiljö. Dessutom dessa fördelar öka den totala genomströmningen och reproducerbarheten av analysen. Dessutom är etanolkänslighet mäts i denna analys påverkas inte av uttryck av endogen vitt eller transgena markör mini-vit 18, vilket gör den lämplig för studier med transgener och genetisk bakgrund som vanligen används i Drosophila genetiska analyser.
Flera nyckelparametrar bör kontrolleras för att få tillförlitliga resultat från etanol sedering analyser. Förutom att kontrollera tillväxten miljön och genetisk bakgrund av stammar som testas (se ovan), volym och koncentration av etanol är naturligtvis oerhört viktigt för kvantifiering av etanol Sensitivity. Notera att utspädningen av etanol i vatten är exoterm. Följaktligen bör utspädda etanollösningar tillåtas jämvikt till RT före initieringen av sedering analyser. En ytterligare parameter som bör göras enhetlig för de grupper som testas är den tid som flugor är inrymt i tomma livsmedelsflaskor före start av sedering analysen. Två ytterligare parametrar bör också kontrolleras. Antalet flugor per flaska bör helst vara (a) på samma sätt i alla flaskor och grupper, (b)
en siffra som lätt kan räknas snabbt och (c) ett nummer tillräckligt stort för att möjliggöra relativt jämna sedering tids kurser. Eleven flyger / flaska fungerar bra i vårt laboratorium och är ett förslag utgångspunkt. En sista parameter att beakta är ålder flugorna som används i sedering analyser. Även har fick inga reproducerbara effekter av ålder på etanol sedering känslighet i 1-10 dagar gamla flugor (data visas ej), användning av unga åldersmatchade djur verkarmotiverade med tanke på den stora litteraturen om åldersrelaterade beteendeförändringar hos flugor 29,30.
Andra parametrar verkar inte lika kritisk i sedering analyser, åtminstone när man testar styr flugor använder intervallen parametrar som beskrivs här. Sex, styrka knacka, återhämtningstid från knacka, och tillskott av flyg mat med antibiotika (ampicillin, tetracyklin och kloramfenikol) eller levande jäst ändrar inte etanolkänslighet mätt som beskrivs här. Likaså kvantifiering etanolkänslighet genom interpolering från tredje ordningens polynom kurvor, interpolation från sigmoidala kurvor, eller bestämning av AUC från tidsförloppet uppgifter primära sedering leder till väsentligt oskiljbara tolkningar. Även om ingen effekt av sex observerades genomgående i de studier som beskrivs här, har effekterna av kön på etanol känslighet i flera Drosophila genetisk bakgrund rapporterats 31. Sålunda är det möjligt att könseffekterna varhelt enkelt maskeras av genetisk variation i w [A] bakgrunden som används här. Alternativt är det möjligt att mäta köns effekter på beteendemässiga reaktioner i Drosophila kräver ännu oidentifierade analys eller tillväxtbetingelser. I varje fall är rekommendationen att göra alla parametrar så enhetliga som möjligt i sedering analyser, bland annat kön i några grupper som uttryckligen jämförs.
Med tanke på att levande jäst producerar betydande mängder etanol i fluga mat, det var något förvånande att tillskott av mat med levande jäst inte ökade interna etanol i flugor. En möjlig förklaring är att etanolen inte produceras jämnt över ytan på maten och flugor kan därför selektivt i sig mat med ingen eller relativt låga koncentrationer av etanol. Ytterligare studier kommer att krävas för att ta itu med denna och andra möjliga förklaringar till detta fynd.
Ett stort antal modifieringar till analys described här är möjliga beroende på målen för försöket utförs. Till exempel, det antal flaskor testas i ett experiment, antalet flugor testas i varje flaska, koncentrationen och volymen av etanol som används, hur länge etanolexponering, tidsintervallet mellan sedering bedömningar, ålder och kön flugorna testade , och kriterierna för sedering kan alla modifieras för att passa behoven hos en enskild laboratorium. Rekommendationen är att börja med en eller två grupper av fyra flaskor när initialt lära analysen och sedan skala upp till att använda det antal flaskor som ger genomströmningen krävs för projektet. Bör observeras oväntat korta eller långa ST50s, det skulle vara bra att se till att test flugor utsattes för korta (1-5 min) anestesitider, fick återhämta sig från anestesi O / N, mindre än 10 dagar gamla, var inte fysiskt skadad under hantering, inte vätas av etanollösning, och hade inte rörelseapparaten nedskrivningar.
Den analys mäter etanol sedering känsligheten bara, och därför inte är utformade eller anpassade för att bedöma andra beteendemässiga reaktioner till etanol. Liksom alla kända etanolbeteende paradigm i flugor, kräver denna analys flugor att ha i stort sett normala rörelseapparaten förmågor och därför genotyper med nedsatt rörelseförmåga ska inte testas. En annan begränsning med analysen är att koncentrationen av etanolånga i flaskan förmodligen kontinuerligt stiger såsom drogen förflyktigas från cellulosaacetat pluggen. Även flugorna interna etanol stiger successivt med tiden i alla flyga etanolbeteendeanalyser, verkar det möjligt att leverera en fast koncentration av etanolånga till flugor skulle kunna förbättra överensstämmelsen mellan resultaten från denna analys. En metod för att leverera en fast koncentration av etanolångor har ännu inte identifierats som skulle tillåta analysen som skall användas vid den skala som beskrivs här.
Etanol sederinganalys som beskrivs här är väl lämpad för genetisk analys av etanol känslighet och snabb tolerans 18. Tillväxt miljö, genetisk bakgrund, koncentrationen och volymen av etanol, den tid flugor spenderar i tomma livsmedels flaskor, samt antal och ålder flugor som används bör alla kontrolleras. Förutsatt dessa parametrar kontrolleras tillräckligt, bör sedering analysen vara lämpliga för både bakåt och framåt genetiska metoder som undersöker den molekylära grunden för beteendemässiga reaktioner till etanol i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
