Protocol
アッセイの前日に実行するための手順1.
- 新鮮な線虫の増殖培地へのL4段階のワームをピック（NGM）プレートはOP50 E.の芝生を播種20 CO / Nにおける大腸菌 、文化、それらを。各アッセイ条件は、10ワームが必要です。ワームのO / N損失を可能にするためにワームの過剰を選ぶ。
- 最初の日の成人のみアッセイ動物;多くの変異体は野生型よりも遅い速度で成長する。試験した全ての動物は最初の日の成人になるように発達の遅れを持っている株でピッキングのタイミングを調整します。
2.手順アッセイの日に実行する方法
- アッセイのための準備：
- 標準播種していない60×15ミリメートルNGMプレート上でアッセイを行う。蓋をオフにして、2時間37℃で使用する全てのプレートを乾燥させる。それぞれの実験試験のために、4乾燥したNGMプレートを使用します。これらは、0 MMと400 mMのエタノールアッセイプレートとそれに付随する順化プレートになります。
注意：NGMプレートの使用はここに重要です。プレートの組成の違いは、特にそれらのオスモル濃度は、強く行動にエタノールの用量応答に影響を与えることができる、これは、少なくとも部分的には、動物20によって蓄積されたエタノール量の変化に起因する。 NGM寒天は160ミリオスモルである。 - 乾燥させた後、アッセイに使用される非シードNGMプレートの各計量および体重を記録します。空のプレートの重量に基づいて、プレート内でのメディアの音量を決定します。ボリュームの寒天の重量の変換を近似するために、メディアは等量の水と同じ重さと仮定する。
注：私達の最も一貫した結果は、元の10ml容量が8.3〜8.9ミリリットルの間の乾燥後の体積を有することを十分に脱水したNGM培地で見出されている。 2時間の乾燥時間の代替は、プレートがインキュベータの違いを考慮して、この容量範囲に達するまで乾燥させることである。 - 4銅リング（1の内径を溶かす。6センチメートル）炎で鉗子でworms.Grasp各リングの異なる遺伝子型または治療群のための囲い、熱として作用するプレートの表面に（ブンゼンバーナーからの強い炎がうまく機能）約3秒。まだ「スキップ」からそれを防ぐために、鉗子でリングを保持している間すぐにプレートにリングを置きます。
- リングはリング上のいくつかの点で鉗子で軽く押し下げて、寒天の表面に対して平らに載ることを確認してください。リングを配置する場合、追加の3つのリングのための余地を残すように注意してください。
- すべての4つのカメラの視野内になるように互いにできるだけ近くにそれらを配置するように注意しながら、プレートの表面に3つの追加の銅リングを溶かす。
注：寒天で良好なシールを作るには、アッセイの間のリングでワームを保つために不可欠である。板の上に周りのスキップリングが寒天で正しいシールを作る可能性は低いとワームは穴を掘ることを可能にするとワームを可視化を妨げる寒天を、傷跡があります。 - 各アッセイプレート乾燥し、播種していないと何エタノールを受信しませんする必要があります添付「順化」のプレートを準備。これらのプレート上の4つの銅リングを置きます。
- リング自体の視野内に書き込まないように注意しながら、次のリングで使用するワーム株とそれぞれのリングに、プレートの下にラベルを付けます。それに付随する順化プレートとアッセイプレート上のラベルと一致。
- 最終濃度が0mMのまたは400mMのエタノール（体積に対する重量）となるように各アッセイプレートに追加する100％エタノールの量を計算する。各実験（n = 1 の場合 ）、1 0mMの一つの400mMエタノール板が存在する。順化プレートはエタノールを受信しません。プレートの表面のまわりでそれをピペットで、エタノールを追加します。プレートをシールするために実験用フィルムを使用し、それが2時間ベンチ上に平衡化させる。
- 1.5時間が経過すると、アッセイの順応ステップ、ステップ2.2を開始する。
- 標準播種していない60×15ミリメートルNGMプレート上でアッセイを行う。蓋をオフにして、2時間37℃で使用する全てのプレートを乾燥させる。それぞれの実験試験のために、4乾燥したNGMプレートを使用します。これらは、0 MMと400 mMのエタノールアッセイプレートとそれに付随する順化プレートになります。
- アッセイプレート：歩行運動アッセイを実施
- 慎重に順化板上の銅リングの中心に各実験群の10ワームを転送する。ワームのピックで軽くこすることによって、この時点で寒天上に表示されている任意の食品を削除します。同株は、臨床試験で同じ順序でプレート上に置かれないように、実験群は、実験的試験を横切るプレート上に置かれる順序を変化させる。
注：目標は、順応プレート上の食品がアッセイプレートに移された場合、ワームは、食品の周りに集約され、運動に対する薬物の効果が隠されるため、食品の最小限の量でプレートに動物を転送することである。 - これはワームが穴を掘ることができますし、アッセイを妨害するように、ピックと寒天の表面を壊さないように注意してください。室温で30分間ワームをインキュベートする。
- 各プレートのイニシエーションの間に適切な間隔があることを確認します。経験豊富な実験者は、<1.5分で4輪用の40の動物、10 /リングを移動させることができますが、2分までの任意の間隔が許容される。標準的なアッセイは、10〜12分であり、0 MMおよび400 mMのエタノールの両方の曝露の30-32分で記録映画を持っています。
- 第二のムービーが開始しなければならない前に、最初のムービーファイルの保存を可能にするために、約2分30秒離れて400 mMの露光用の0 mMの曝露と順化板に順化プレートを開始します。
- 30分間の順応期間の後、アッセイプレートに順応プレートからワームを転送する。それらは各プレートの補完の間のタイミングを追跡する、順応プレートに添加したのと同じ順序でアッセイプレートにワーム（0 mM以下の400mMエタノール）を転送する。気化エタノールの損失を最小限にするために実験用フィルムでプレートを密封する。
- U薄い刃の平坦化ワームにすくい運動は、平坦化されたピックの上にワームを収集するために選ぶSE。それはピックにワームを接着するのに役立ちますように、一般的にワームを搬送する際に用いられる細菌、を使用せずにアッセイプレートに播種していない順化プレートからワームの転送を実行します。
注意：プレートの最初のウォームをプレートに加え、最後のワームよりも長いエタノールにさらされるので、動物がこの段階で転送される速度が非常に重要であり、以前の時点でいくつかの時間依存効果を示し得る。これは株は最初の実験の反復全体のプレート上に配置されて回転させるための主な理由である。
- 慎重に順化板上の銅リングの中心に各実験群の10ワームを転送する。ワームのピックで軽くこすることによって、この時点で寒天上に表示されている任意の食品を削除します。同株は、臨床試験で同じ順序でプレート上に置かれないように、実験群は、実験的試験を横切るプレート上に置かれる順序を変化させる。
- 歩行アッセイを実行します。ビデオ撮影
- そのような2048x2048 7.4と0.5倍の顕微鏡対物レンズ、0.8倍の倍率とカメラとして、視野（約42x42 mm 2の正方形）のすべての4輪の同時イメージングを可能にし、顕微鏡/カメラの組み合わせを使用して、81、m個の画素CCD。
- 強度閾値ステップで物体認識を助ける視野を横切っての照明にも使用する（下記参照）。 3「X3」バックライトはうまく動作します。
- イメージメディア側を上に配置プレート上のワームの光源を送信した伝統的な顕微鏡と比較してバックライトを使用する際に失われたコントラストを生成し（蓋ダウン）、。
- 移動するワームのタイムラプスムービーをキャプチャする画像解析ソフトウェアを準備します。 2分（120フレーム）ムービーとして、1秒毎に12ビットグレースケール画像をキャプチャするためのソフトウェアを設定します。まだ十分な画像解像度を維持しつつ、出力ファイルのサイズを低減するために、1024×1024ピクセルの画像をキャプチャする2×2ビニングモードを使用する。
- 映画を記録します。最後のワームがそのプレート上に配置した10分後に最初のプレート（0 mMのエタノール）の120フレームの動画撮影を開始します。ムービーファイルを保存します。
- 第二のプレート（400 mMのエタノール）を記録します。このプロセスを繰り返します最後にワーム30分後に始まる両プレートは、各露光のために30〜32分の時間点を捕捉する第一プレート（0 mMのエタノール）上に置いた。
注：分析すべき次のプレートの記録を開始する前に、各キャプチャセッション後の画像ファイルを保存するのに十分な時間を確保してください。 - アーカイブされた映画の未来プルーフ用の8ビット256グレースケールのTIFFファイルに各ムービーのコピーを変換し、これらの映画が開かれ、そのようなImageJの28など、他のパブリックドメインのオープンソースイメージングソフトウェアプログラムによって分析されることを可能にする。
注：ここで説明する画像解析ソフトウェアは、独自のファイル形式を使用しています。
- イメージプロ（ImagePro）ソフトウェアを使用して映画の分析。
- キャプチャされたら、画像-Proソフトウェアまたはその同等Plusを使用して映画を分析する。
注：他のオブジェクトトラッキングソフトウェアの様々な利用可能で正常に複数C.を追跡するために使用されたこと1時間29などで虫オブジェクト識別ステップは同様の原理に基づいているソフトウェアは、合理的に、ここで説明したものに代替できた。記載されている方法は、画像プロプラスソフトウェアのバージョン6.0から6.3と7.0であって、イメージ·プロプラスソフトウェアの新しいバージョンでは、マイナーな違いがある場合がございます。 - 2分（120フレーム）のセグメントに映画を分析します。まず、背景を平坦とウォームオブジェクトのコントラストを向上させるために画像にフィルタを適用する。次のようにフィルタを選択：メニュー>プロセス>フィルタ>強化>フラット化：パラメータ：背景=ダーク。 WIDTH = 20 Pixのを備えています。
- フィルタリングステップの後に映画を再保存が、常にそのフィルタリングされていない形でオリジナルのムービーを保持します。
- 配置され、銅リングとオーバーラップするような大きさの関心（ROI）の円形領域とは別に、各環における動物の運動を分析します。コマンド...メニュー>メジャー>トラックオブジェクトとワームを特定し、追跡する。これはトラッキングDが表示されますATA表ウィンドウ。追跡オプションボタンは、特定のトラックが除外されるように、任意の実験的なアーティファクトを制限することができます。
- 自動追尾]タブで、次のパラメータを使用します。トラックパラメータ：速度制限（検索半径）= 400ミクロン/フレーム、加速限界=オート、最小の総トラック長を=400μmで、優勢なモーションタイプ=混沌。トラックパラメータ内のオブジェクトは：部分トラック= YES、最小長= 21フレーム、トラッキング予測深さ= 1フレームを許可します。
- 追跡プロセスを開始するには、自動的にすべてのトラックを探すカウント/サイズオプション]ダイアログボックスと追跡ダイアログボックスを開き、ボタンをクリックして機能する。分析用のワームオブジェクトを強調するために、軽量化背景ピクセルを無視するワームピクセルのグレースケール強度を使用して重要なしきい値ステップを提供してカウント/サイズ]ダイアログボックス、内の強度範囲の選択のためのマニュアルのオプションを選択します。
- 強度閾値SLIを調整しますDERをすべて暗いオブジェクトを強調包括的な範囲を作成するには（下限値を設定する上限、1を設定するには、1）。 0-4,095の規模0-1,500の範囲は、より細かいチューニングのための良い出発点である。
- そのような銅リング、プレート上の任意の破片のような単一のワームオブジェクトより大きく、小さいオブジェクトを除外するためにサイズのフィルタを適用します。カウント/サイズオプション]ダイアログボックスの2尺度との姿勢の様々な個々のワームのためにサイズをカバーこれを行うには、サイズのパラメータ選択>計測メニュー項目を設定します。 （エリア範囲：28,000-120,000μm2で、境界範囲：600-2,500ミクロン）。
- 変異株を分析するプレート上の他の動物よりも有意に小さい、または大きい場合、設定を変更する必要がないように、最初の動物を追跡する前に、株の異なるサイズに対応するために、物体認識のためのフィルタ設定の範囲を広げる半ば分析。
- 追跡ダイアログボックスで[続行]をクリックしてトラッキング処理を完了します。視覚自動フィルタの設定に基づいて、それを排除する正当な理由がない限り、すべてのワームが表現されていることを確実にするために映画の中の各ワームの進行に出力トラックを比較する。手動でサイズのフィルタ基準を満たして確認された非ワームのオブジェクトの存在によって生産されたトラックを削除します。
- 各フレーム間の各ワームの速度を計算するためのソフトウェアを使用します（距離はフレーム間の1秒あたりのオブジェクトの重心のために旅し）とにおけるワームの人口のためにすべてのトラック全体で各トラックの平均速度と平均速度を表示銅リング。この最終的な平均は実験的な臨床試験の面ではn = 1であると考えています。統計分析とデータアーカイブのためのスプレッドシートプログラムにデータをエクスポートします。
- データは、プレート上の第一のリングのために記録された後、次のリングにROIを移動させパラメータを変更することなく、追尾処理を繰り返す。
- ：を通して移動の相対速度を算出する
- 相対速度（％）=未処理（400 mM）の速度/（0 mM）の速度×100。
注：別の遺伝子操作は、多くの場合、動物の基礎歩行速度を変える。動物の歩行速度に対するエタノールの効果を決定するために、異なる遺伝子型または条件にわたってこれらの効果を比較することができるようにするために、相対速度を算出する。
- キャプチャされたら、画像-Proソフトウェアまたはその同等Plusを使用して映画を分析する。
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Representative Results
いくつかの異なる遺伝子型とその対になったコントロールからの代表的なデータ（ 図1）は、8,24 を提示されている。データは、具体的にアッセイした動物において、そのハイライトの違いを選択した。曝露の10分での効果の程度は、 図1B-Gの左軸に示されている株の初期感度と考えられている。 10分での対照よりも大きな相対速度を有する変異株は、エタノール（ 図1F、G）に耐性であると考えられ、一方（ 図1Dエタノールに対して過敏であると考えられる制御よりも小さい相対速度を有する変異株E）。図1の右の軸は10-と30分の期間の間の速度の回復の程度を示している。これは急性の機能的な耐性の発生（AFT）の速度の測定値を表しており、相対的なSPEから減算10分での相対速度として計算されます30分でED。対照動物は、AFT（ 図1Cの開発の低い速度を有すると考えられているよりも大きな回復値は、対照動物（ 図1D、F）と下回復値を有する株と比較してAFTの開発のより速い速度を有すると考えられる有する株、E）。 SBP1（ep79）（ 図1G）についての測定AFTが負の回復基調にあるが（N2の回復と比較するため、P = 0.08）大きな分散のために、野生型と統計的に差はなかったことに注意してください。 浴槽-1は、TUBBYホモログをコードしている、BBS-1は、ヒトBBS1にホモログをコードし、 唇-7は、トリアシルグリセロールリパーゼをコードし; 脂肪-1は、オメガ3脂肪酸アシルデサチュラーゼをコードし; 脂肪-3は、デルタ-6脂肪酸デサチュラーゼをコードし、SBP-1がにホモログをコードしているタンパク質（SREBPs）を結合するヒトステロール調節エレメント。
のいくつかの重要な特徴があります。注意すべきデータをまず、N2（野生型）の制御データは、実験全体で異なる。これは、そのような実験室での絶対水分量または乾燥した培地の塩濃度および温度などを制御することが困難である環境要因になる可能性が高い。典型的に、400 mMの外因性エタノールは、未処理の対照の約30％のN2の速度を押下する。しかし、うつ病の絶対的な程度は、実験から実験まで変化する。さらに、N 2中で30分かけて歩行速度の約12％の回復が通常予想されるが、ここで再び番号が異なります。重要なことには、感度とAFT展示日々の変化量の絶対レベルは、遺伝子型または症状との間の比較は、一般的に異ならない一方。すなわち、野生型および変異体は、常に互いに対して同様の効果を有するであろう、ある変異体は、野生型とAFT相対的な減少を引き起こす場合、その減少は、野生型によって実証AFTの量に合わせて拡張されます。このハイライト比較されている菌株または条件に同時に同じプレート上で対になった制御を行うことの重要性。
第二に、初期感度とAFT表現型は、遺伝的に分離可能である。初期感度と急性機能的寛容が一緒にまたは別々に変化することができることに注意してください。例としては、初期感度とAFTが独立して異なるれる表現型の様々な含まれている。表現型のいずれかの変化は、他の表現型の変化を予測しておらず、第2の表現型（増加またはエタノールに対する応答の減少のいずれか）の変化の方向を予測しない。
図1.初期エタノール感度および急性機能トレランス（AFT）の開発の速度を分離可能な行動反応である。のために（A）サマリーテーブルエタノールとAFTの現像速度の初期感度のレベルという遺伝子の変異の影響の方向は、どちらも（各場合において、N2）は、野生型対照と比較している。（B-G）、急性運動応答400 mMの外因性エタノールに10〜12分で、連続エタノール曝露の30〜32分で測定される。相対速度（未処理速度の％）が左の軸上に示されている。速度の回復度は右側の軸に示されており、その20分間隔の間にAFTの速度の測定値を表している。以下のように比較試験の数である：B、C、E： のn = 6。 G：N = 7; D：N = 9; F：N = 11。統計的に有意な比較（対応のあるt検定）が示されています。*、P <0.05; **、P <0.01。8,24この図に示されたデータは、8,24から変更されている。 Pリースこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
C.で利用可能なシンプルな神経生物学と遺伝的ツール虫は、ワームの行動に対するエタノールの影響の分子基盤を研究するために優れたモデルにする。ここでは、エタノール8,10,20,24,25に対する急性行動応答のいくつかの分子および環境メディエーターを同定するために使用されたアッセイを記載する。この方法は、二つの異なるエタノール応答挙動の表現型、初期感度と一緒に哺乳動物における応答のレベルの複合表現型をモデル化する急性機能寛容、の開発の分化と同時検査を可能にします。同じアッセイを容易それによって他の薬物の行動的影響の評価における複数の株の同時試験を利用して、他の薬理学的薬剤を研究するために適合させることができる。
10-12分間の時間窓らに歪みの初期感度を測定するために有用な時刻を提供hanol。露出の最初の10分の間で400 mMのエタノールの効果の分析は露出の第二分に始まる速度効果を示すが、効果の定常状態は、エタノール曝露20の第七分までに達成されていません。による移動速度にこの時間依存性効果のために、特定の株は、プレート上に配置される順序は、ワームのすべてを配置し、2分未満を要すると仮定すると（前の8又は9分までの任意の速度測定のために重要であるエタノールプレート上）。これらの初期の時点でいくつかのワームは、それらが以前のプレート上に配置したというだけの理由エタノールによって、より影響を受けます。エタノールの安定した初期効果は七分によって達成されるにもかかわらず、それが原因エタノールのこの時間依存効果に株は、プレート上に置かれている順序は、菌株間で系統的な影響を最小限に抑えるための反復トライアルにわたって変化することが推奨されており、プラットにワームを移動するために必要な時間E。
特定のパラメータを繰り返し銅リングまたは他のワームと衝突虫からのバイアスを最小化する物体追跡ステップで選択した。オブジェクトサイズのフィルタステップは、2つのタッチワームを含む、単一のワームより大きい追跡から任意のオブジェクトを排除するべきである。ワームは、他のワームや銅リングに触れた場合には、トラックが終了していないし、それが接触したままで、それは、もはや有効なオブジェクトとして認識されるべきである。ワームは、他の物体との接触を失うと、それは新しいオブジェクトになり、新たなトラックを開始する。ワームによるトラック未満の長さで20秒である場合、それは自動的に21フレームの最小トラック長を定義することによって排除される。このフィルタは、反転した後、素早く反転の短い発作がバイアス動物の個体群の全体的な平均速度を得るように、再びそのオブジェクトに触れ、今後、別のオブジェクト（ワームまたはリング）へ前進するワームのインスタンスを防ぐことができます。これらの設定を使用して、私tは全体の平均に長さ20秒（未満99秒）よりも大きくなる複数のトラックに貢献するための単一のワームは可能と珍しいことではありません。各ワームのみ（120秒の合計のうちの）最小トラック長61秒を行うことで、単一のトラックに寄与するように設定を変更することができるが、経験的観察は、このトラックのかなりの数を排除し、それが遅いことが判明したと判断し他のワームと衝突のワームはそれほど頻繁に過剰に表現されます。代わりに、新しいトラックはムービーの最初のフレームの後に開始するように禁止することができたが、その後2分間の期間に早期に衝突するワームは、分析から削除され、有用なデータが失われてしまう。最終的に、銅リング当たり10虫の使用は平均とあまりにも多くのワームの衝突の問題に貢献する多数の代表的なトラックを有するとの間の良好な妥協を表す。
この行動のアッセイは、いくつかの重要なを持っていワームでエタノール応答挙動の研究のための利点。同じプレート上のいくつかの遺伝子型の同時試験は "囲い"銅の使用によって可能となるこの技術革新は、いくつかの明確な利点を有する。まず、このアッセイにおいて、制御条件または菌株は、必ず実験条件や歪みと同時に、同一のプレート上で試験され、そして同時に試験動物のみが直接比較される。行動アッセイは、しばしば、環境の影響を受けて、行動応答の日々の変動は、アッセイのノイズを増加させ、信号を検出する能力を低下させることができるので、これは特に重要である。同一の条件下で実験群を並べて比較は、実質的に、このアプローチの主要な利点である日々の環境変化の影響を減少させる。第二に、銅囲いの使用は、移動アッセイは、Aで実行することができ、視野、動物が含まれ食品のbsence。食べ物を奪われると、ワームはすぐに移動し、細菌の検索に分散する傾向があり、リングなしで、ワームは、アッセイの過程での視野を離れる。また、ワームは、銅によって反発し、視覚化するためにそれらが容易、リングの真ん中に近い滞在する傾向がある。ワームは、これらのアッセイ条件下で迅速に移動するという事実は、実質的にエタノールのうつ効果を検出するための解像度を増加させ、ワームは、ゆっくり移動すると、速度が早く、それらを検出する能力の床に達する。銅はワームに対して毒性であることに注意してください。リングは、このプロトコルでアッセイ（数時間以上）リングの動物のインキュベーションを延長エタノールに急性応答に影響を与えるように表示されませんしながら、お勧めしません。第三に、この実験的なデザインで、単一のアッセイは、最大4つの異なる実験群の行動反応を評価することができます。したがって、統計的に意味のあるデータを蓄積するのに要する時間が減少する。 additiで単一のデジタルムービーが形成されているので、上、これは、一次データの長期保存のためのメモリ容量要件を減少させる。最後に、各実験において、各実験群の10個体の動物の挙動を調べた。これらの10の個人の速度が単一のアッセイのための合成速度を生成するために平均、なるようにn = 1で試している。多くの動物の行動のこの平均はさらに、これらの敏感な行動アッセイの変動性を減少させ、さらにエタノール応答行動に微妙な影響を検出するために解像度を増加させる。
すべての変異動物の行動解析に適用され、そのうちのいくつか、ここで説明する方法、に制限があります。このアプローチの一つの重要な制限は、それらの測定された速度値番目まで減少するので、非常に有意により協調不能または麻痺の近くに、基底速度が低下している変異体ワームは、エタノールの作用に対する耐性の偽陽性として識別され得ることであるATは、特定のイメージングセットアップのための正確な検出の閾値以下である。最も物体追跡ソフトウェアプログラムは、フレーム間で移動した距離を測定するための位置として重心（質量中心）を使用するように、その頭部がまだ重心の位置ずれとそのシフトを生成することができる移動定常ワームが検出される運動として。したがって、ワームは、真運動を測定するために身体の姿勢の微妙なシフトによって引き起こされるよりも速く移動する必要がある。エタノールにさらされるワームが麻痺していないが、それはエタノール曝露は、この技術的な床効果を下回る速度の彼らの率を低下させる可能性があり、すでに運動で赤字を持っているワームを持つので、彼らは、非常にまとまりのないです。身体位置の大きな変化は、重心の位置に微妙なシフトから分離可能となるようにフレーム間の時間を増加させると、フレーム間の時間が1秒よりもはるかに長くなる場合には、oには、より困難になり、この問題を解決しない同ワームはトラックではなく近いが接触していないワーム間をジャンプトラックに貢献されることを保証するためにソフトウェアを追跡bject。
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Acknowledgments
R01AA016837（JCB）とP20AA017828（AGDとJCB）：これらの研究は、国立衛生研究所、国立アルコール依存症とアルコール乱用研究所からの補助金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
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