Summary
I den etterfølgende protokoll beskriver vi en meget enkel måte å isolere Neutrofil Ekstracellulære feller (garn) fra humant fullblod ved å bruke lett tilgjengelige reagenser. Vi viser hvordan de isolerte NET kan brukes i en in vitro adhesjonsassayet med kreftceller.
Abstract
Nøytrofile Ekstracellulære feller (NETS) har nylig blitt identifisert som en del av nøytrofile er antimikrobielle armamentarium. Bortsett fra deres rolle i bekjempelsen av infeksjoner, har nyere forskning vist at de kan være involvert i mange andre sykdomsprosesser, blant annet kreft progresjon. Isolere rensede NET er et avgjørende element for å tillate studiet av disse funksjonene.
I denne videoen viser vi en forenklet metode for celle gratis NET isolasjon fra humant fullblod ved hjelp av lett tilgjengelige reagenser. Isolerte NET kan deretter brukes til immunfluorescens farging, blotting eller ulike funksjonelle analyser. Dette muliggjør en vurdering av deres biologiske egenskaper i fravær av de potensielle konfunderende effekter av nøytrofile selv.
En densitetsgradient separasjonsteknikk er anvendt for å isolere neutrofiler fra frisk donor helblod. Isolerte nøytrofile blir så stimulert av phorbol 12-myriState 13-acetat (PMA) for å indusere NETosis. Aktiverte neutrofiler blir deretter kastes, og en celle-fri NET lager oppnås.
Vi viser hvordan isolert NET kan brukes i en adhesjonsassayet med A549 humane lungekreftceller. NET lager brukes til å belegge brønnene i en 96-brønners cellekulturplate O / N, og etter å sikre en tilstrekkelig NET monolag dannelse på bunnen av brønnene, CFSE merket A549 celler tilsettes. Festede celler kvantifiseres ved hjelp av et Nikon TE300 fluorescerende mikroskop. I noen brønner, er 1000U DNAse1 lagt 10 min før telling å degradere NET
Introduction
Nøytrofile ekstracellulære feller (garn) er nylig oppdaget nøytrofile-avledet elementer sammensatt av tråder av ekstracellulært DNA dekorert av hundrevis av proteiner og histoner. De er utskilt av nøytrofile granulocytter i sammenheng med infeksjon og betennelse følgende spesifikke stimuli, og de ble i utgangspunktet anerkjent for å være en del av nøytrofile forsvarsmekanismer mot infeksjoner. De ble først vist seg å fremme fangst av ulike mikrobielle inntrengere som bakterier, virus og sopp 1-3. Fangst av mikroben vil da føre til sin ødeleggelse både direkte av NET-assosierte proteiner 3,4 og indirekte gjennom lokal rekruttering av fagocyttceller 5,6. Rollen til NET imidlertid ikke synes å være begrenset til å være vert forsvar. Mer nylig, har de vist seg å spille en viktig rolle ved autoimmunsykdommer 7,8, trombose 9, graviditet-relaterte lidelser 10 og med kreft progresjon11,12. Følgelig synes det som om NET spiller en viktig rolle i et stort antall forskjellige fysiologiske prosesser. Imidlertid, gitt den nye arten av slike undersøkelser, er det fortsatt mye å bli klarlagt med hensyn til de mekanismer som NET utøver sine effekter. Heri presenterer vi en forenklet metode for isolering av NET i fravær av nøytrofile.
I følgende video, vi demonstrere en forenklet og enkel teknikk for å isolere NET fra humant fullblod. Cellefrie NET kan så brukes i en rekke in vitro eksperimenter inkludert farging, imuunofluorescence, blotting, så vel som en rekke analyser som adhesjon, proliferasjon og migrasjon. Andre protokoller eksisterer 13, 19, men de er som regel lange, komplekse, kostbare og ofte lavt utbytte 13. Denne forenklede protokoll benytter basiske reagenser, og reduserer antallet trinn som kreves for å isolere neutrofiler, og derfor minimalisere lengden av procedure samtidig maksimere utbyttet.
Følgende metode kombinerer forskjellige teknikker for nøytrofil isolasjon som tidligere er beskrevet i litteraturen for å oppnå en enkel protokoll som gir en meget ren prøve av levende nøytrofiler. Som foreslått i litteraturen, er venøst blod ble samlet i EDTA-rør og brukt i løpet av 10 min for å unngå nøytrofil aktivering 14. Vi bruker Lymphocyte Separation Media (LSM) tetthetsgradient-sentrifugering for å isolere granulocytter og røde blodceller fra heparinisert helblod, en metode tilpasset fra Ficoll tetthetssentrifuge teknikken opprinnelig beskrevet av Boyum et al 15. LSM er en modifikasjon av Boyum formulering som erstatter natrium- diatrizoat for natrium metrizoate og har vært brukt med hell i mange studier for å isolere neutrofiler 16-18.
Etter differensial tetthet sentrifugering, er monocytter og lymfocytter forkastet; røde blodceller blir deretter sedimentertved hjelp av en 6% dekstran-løsning 14 og de gjenværende røde blodceller lyseres for å oppnå en populasjon av rene neutrofiler, som blir verifisert med Trypan blått og metylen blå farging.
Mange midler er blitt brukt til å indusere NETosis både in vitro og in vivo, med lipopolysakkarid (LPS), og forbolmyristatacetat (PMA) og interleukiner (IL-8) 3,5,6. I den følgende protokoll, blir isolerte nøytrofiler stimulert med 500 nM PMA i 4 timer, noe som har vist seg å være en tilstrekkelig konsentrasjon til å tillate konsistent og pålitelig NET dannelse uten å fremme apoptose 19,20.
Etter isolering, viser vi hvordan cellefrie NET hentet fra denne protokollen kan brukes i en adhesjonsassayet. DNAse1 brukes til å fordøye og nedbryte NET som tidligere beskrevet, og tjener således som en kontroll 2,3,11. Andre alternativer inkluderer bruk av Neutrofil elastase inhibitor (nei) for å hemme NET forming avon, som er et akseptabelt alternativ når målet er å inhibere dannelsen NET fremfor bevirke deres nedbrytning 11. Selv om nei har en rekke varierte funksjoner, har det tidligere blitt vist at NET deponering kan bli hemmet av Nei gjennom blokkering av kromatin decondensation, kjernekraft degranulation og nøytrofile døden 12
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle forsøkene ble utført i samsvar med lokale institusjonelle etiske retningslinjer.
1. Blood Tegning
- Gjennom antecubital venipucture, samle 14 rør av blod fra en frisk frivillig inn i grønn topp (hepariniserte) rør og invertere hvert rør før han bosatte seg på isen. Samle blod innen 10 - 15 min av eksperiment for å sikre optimal nøytrofile yield.
2. Neutrofil Isolasjon fra Whole Blood
- Vask hver grønn topp rør av blod med 5 ml PBS uten Ca og Mg å fortynne blodet. I hver av 4 x 50 ml koniske rør, tilsett 15 ml Lymphocyte Separation Media (LSM) ved romtemperatur. Ved anvendelse av en 18 G nål er montert på en 60 ml sprøyte, nøye lag fortynnet blod på LSM, og skaper en skarp LSM-blod-grensesnitt.
MERK: Unngå å blande av lagene så mye som mulig. - Sentrifuger ved 800 xg i 30 min ved 21 ° C uten pause.
MERK: Sudden pauser kanføre til blanding av de forskjellige lag. - Observere erytrocytter og nøytrofile sediment på bunnen. Aspirer og kast de beste 2 lag (plasma og LSM) å sørge for å kvitte seg med grensesnittet mellom disse lagene som inneholder lymfocytter og mononukleære celler, slik at bare den nederste røde laget.
- Til hvert rør tilsettes 20 ml fosfatbuffer saltvann (PBS) og 20 ml 6% dekstran-løsning. Snu hvert rør for å blande seg med lag av erytrocytter og nøytrofiler, og tillate å sitte ved RT i 30 min.
MERK: Dette vil tillate røde blodceller (RBC) i sedimenter på bunnen. - Etter 30 min, overføre nøytrofile rik supernatanten i nye rør og forkaste RBC pellets. Sentrifuger supernatanter ved 450 xg ved 4 ° C i 5 min. Etter sentrifugering, kast supernatanten. Pelleten vil inneholde det meste nøytrofile granulocytter og få RBC.
- Tilbered en lyserende løsning ved å tilsette 0,5 ml lyseringsbuffer til 4,5 ml sterilt vann. Lyse rester RBC med tHan fremstilt 5 ml lyseringsløsning, å overføre alle resuspenderte pelletene til en tube. Tillat lyse ved romtemperatur i mørke i 10 min.
- Sentrifuger ved 450 xg ved 4 ° C i 5 min. Kast supernatanten og pelleten vaskes med 5 ml PBS uten Ca og Mg, og sentrifuger på nytt ved 450 xg ved 4 ° C for å kvitte seg med en hvilken som helst gjenværende lyseløsning. Det oppnås ved dette punktet pellet inneholder nøytrofile. Resuspender pelleten i 30 ml kald 3% RPMI og satt på is.
MERK: 3% RPMI er laget ved å supplere RPMI-medium med 3% føtalt bovint serum (FBS) - Bekrefte renheten til prøven ved hjelp av metylen blå farging. > 95% av cellene bør være granulocytter med fler Lobar kjerner. Bruk Trypan blå flekker å verifisere> 95% levedyktighet av celler og telle den endelige nøytrofile yield. Fortynn neutrofiler i iskald 3% RPMI for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 5 x 10 6 neutrofiler / ml.
3. Net Generation
- Stimulere nøytrofile med 500 nM av PMA (per 30 ml av nøytrofil-løsning) og inkuberes på en 150 x 25 mm flat vevskulturskål med 20 mm raster i 4 timer ved 37 ° C 5% CO2. Dette vil tillate NETosis.
- Etter 4 timer av stimulering, forsiktig aspirer og kast media, forlater laget av garn og nøytrofile festet nederst. Ikke forstyrre dette laget.
- Ved hjelp av en totalt 15 ml kald PBS uten Ca og Mg pr fatet vaskes bunnen av hver tallerken ved å pipettere 15 ml PBS på bunnen av skålen for å løfte av all vedheftende materiale fra bunnen.
- Samle oppløsning oppnådd fra vasking av hver tallerken (trinn 3.3) i et 15 ml konisk rør og sentrifuger i 10 minutter ved 450 x g ved 4 ° C. Neutrofiler og eventuelle gjenværende celler vil pellet på bunnen, slik at en celle-fri NET-rik supernatant.
- Skille supernatanten i 1,5 ml mikro-sentrifugerør og spinn i 10 minutter ved 18.000 x g ved 4 ° C. Dette vil tillate alle DNA til pellet.
MERK: sentrifugering i større tubes er enklere og mindre tidkrevende dersom slike høye hastigheter er oppnåelig på vanlig sentrifuge, ellers vil trenge å dele supernatanter i mindre rør for å kunne bruke høyhastighetsmikrosentrifuge. - Fjern supernatant og resuspender alle pellets som oppnås sammen i iskald PBS til en konsentrasjon svarende til 2 x 10 7 neutrofiler per 100 ul PBS. Dette vil gi den cellefrie NET lager som kan brukes til etterfølgende eksperimenter.
- Mål-DNA-konsentrasjon i prøven oppnådd ved anvendelse av spektrofotometri eller alternativ DNA kvantifisering verktøyet. En tilstrekkelig konsentrasjon i prøven bør ligge i området mellom 140 til 180 ng / mL.
4. NET-Cancer Cell Statisk Adhesion analysen
- Tilsett 100 ul av den tidligere erholdte NET lager per brønn i en 96-brønners flatbunnet plate og tillater å belegge brønnene O / N ved 4 ° C i mørket.
- Mellom 12 og 20 timer senere, kontrollere dannelsen av en ensartet monolag av cellenfrie garn på bunnen av brønnene under mikroskop (figur 1). På dette punktet, forsiktig aspirer alle ikke-klebende materialet ut av brønnene, og pass på ikke å forstyrre NET monolaget på bunnen.
- Tilsett 100 ul av 1% bovint serumalbumin (BSA) blokkeringsløsning til hver brønn og la stå i 1 time ved RT.
- Løsne A549 cancerceller fra en T-75-kolbe ved bruk av 2 ml av 0,25% trypsin-løsning. Nok en enebolig, tilsett 10 ml A549 media til trypsinert celler og sentrifuger ved 450 xg ved 4 ° C i 5 min. Fjern supernatant og resuspender cellene i medier for å oppnå en konsentrasjon på 2 x 10 4 kreftceller per 100 ul media.
MERK: A549 celler ble dyrket separat. I korthet ble cellene dyrket og opprettholdt i DMEM-F12-medium inneholdende 10% FBS og 1% Penicillin Streptomycin og inkubert ved 37 ° C 5% CO2. Når 70-80% celle samløpet ble nådd, ble de frittliggende bruker 0,25% Trypsin-EDTA og resuspendert i samme mediabeskrevet ovenfor. - Flekkcancerceller ved hjelp av CFSE ved å tilsette en ul av CFSE per ml av mediet og la for å farge ved RT i 10 min. Etter farging, sentrifuger ned ved 450 xg ved 4 ° C i 5 min og deretter kaste supernatant og resuspender cellene i innledende volum av mediet for å oppnå en konsentrasjon på 2 x 10 4 kreftceller per 100 ul media.
- Etter en time av NET blokkerer, forsiktig aspirer blokkering løsning og tilsett 2 x10 fire kreftceller i media, noe som tilsvarer 100 gl, per godt over NET monolayer og la til å følge i 90 minutter ved 37 ° C 5% CO 2. Forsiktig Aspirer cellene og tilsett 100 ul PBS til hver brønn for å vaske alle ikke-adherente celler.
- I noen brønner, legge 1000U av DNAse1 per brønn i 10 min før vask for å degradere Nets. Dette vil tjene som negativ kontroll. I andre brønner, tilsett 100 ul sterilt vann per brønn i 10 minutter, noe som vil tjene som bærerkontroll (VC).
MERK: 3 gjentak per condition er vanligvis utført for å øke prøvestørrelse. - Aspirer og forkaste alle løsningen i brønnene slik at bare garn og heftende kreftceller i bunnen. Tilsett 100 pl av 4% formaldehyd-løsning per brønn for å løse adherente kreftceller til garn og lese assay under fluorescensmikroskop (figur 1). Plot og analysere resultatene (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket oppnåelse av en statisk adhesjonsassayet med garn krever tilstrekkelig belegging av brønner med et monolag av nøter før tilsetningen av kreftceller (figur 1). Alle etterfølgende trinn må gjøres med forsiktighet for ikke å forstyrre det laget. Når et tilstrekkelig lag av nett er dannet, er det forventet å vise signifikant kreftceller adhesjon til NET som vist i figur 2A og 2C. Denne virkning oppheves ved tilsetning av DNAse1, noe som forringer NET som vist i figurene 2B og 2D. Omvendt, bør det ikke være noen signifikant reduksjon i A549 adhesjon til garn i nærvær av kjøretøyet kontroll (figur 3). For å få en god estimering av gjennomsnittlig kreft celle adhesjon per høy effekt felt (HPF), anbefales det å telle minst fire tilfeldige HPFS per brønn. Felt som ikke er godt belagt i garn på grunn av tekniske problemer bør ikke tas i betraktning for lanting som disse kan forfalske resultater.
Figur 1. NET med ett lag. Lysmikroskopi bilder av de 96 brønnene plate brønner belagt med garn som viser (A) uniform monolayer av NET i hele vel i motsetning til (B) middelmådig belegg av brønnen med en avbrutt lag av Nets. Skala barer representerer 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. A549 Cancer Cell Adhesjon til garn i Vitro. (A) A549 kreftceller (piler) holder seg til monolayer av garn i vitro. (B) Additipå over DNAse1 avtar signifikant nivået av kreft celleadhesjon; (C) viser et representativt bilde av kreft celleadhesjon på NET under fluorescerende lys under fluorescerende mikroskop (Nikon TE300) før (C) og etter (D) tilsetning av DNAse1. Skala barer representerer 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Resultater for In Vitro Adhesion analysen. GraphPad programmet ble brukt til å plotte og analysere resultatene fra A549 kreftcelle adhesjonsassayet til Nets. I nærvær av DNAse, adhesjon var 13,90% sammenlignet med ubehandlede garn. I nærvær av bærerkontroll (VC), adhesjon var 77,26% sammenlignet med ubehandlede garn. Dataene er presentert som gjennomsnitt +/-SEM. Signifikans ble bestemt ved bruk Kruskall Wallis test med ** p <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Neutrofil Ekstracellulær Trap isolasjon protokollen demonstrert i denne videoen kombinerer ulike teknikker som brukes i litteraturen for nøytrofile isolasjon og NET formasjon. Det forenkler en ganske kompleks og variabel prosess og tilbyr en svært pålitelig og replikerbart måte å isolere rensede cellefrie nøter med færre trinn enn andre protokoller. Videre er lett tilgjengelige reagenser sysselsatte legge til protokoller enkelhet og betydelig redusere kostnadene. Anvendelsen av NET mot en statisk adhesjonsassayet tjener til å demonstrere fleksibilitet by av denne isolert teknikk, som NET konsentrasjon lett kan manipuleres for å passe et bestemt mål (17). Følgelig kan NET isolert av den demonstrerte teknikken brukes til ulike typer analyser inkludert dynamisk vedheft analyser, migrasjonsanalyser, spredning analyser immunfluorescens og konfokal bildebehandling, elektronmikroskopi, flowcytometri samt tradisjonell Western blotting. Det finnes en rekke tiltak i denne protokoll som er kritiske for sin suksess. For det første kan neutrofiler utilsiktet aktivert under prosessen med isolasjon som fører til apoptose. Det er derfor viktig å utføre alle isolasjons trinnene under sterile forhold under avtrekkshette, unngå aggressiv blanding av rør, holde alle prøvene på is etter at RBC lysis skritt, og unngå lange ventetider mellom trinnene. For det andre, dersom målet for analysen er å belegge brønner for det formål å vurdere adhesjonen, er det viktig å respektere det foreslåtte NET konsentrasjon per brønn, så vel som den foreslåtte endelige DNA-konsentrasjon i "NET stock" da dette vil sikre en jevn og konsekvent monolag av Nets. Lavere konsentrasjon kan gi bare usammenhengende belegg av brønnen og derfor mindre pålitelige resultater. Endelig er det også viktig å håndtere NET monolag meget nøye mens analysen utføres for å forhindre avbrudd. Dette kan gjøres lettere ved å justereintensiteten av suge- og pipettering på sidene av brønnene.
Begrensninger av denne teknikken er det faktum at det krever fortsatt en betydelig mengde av tid for å frembringe NET, hovedsakelig forårsaket av den 4 timers PMA stimulering trinn. I tillegg er en betydelig mengde blod er nødvendig for å isolere et tilstrekkelig antall neutrofiler som kreves for et eksperiment. Det er definitivt tap av en betydelig mengde av garn på det første sentrifugeringstrinn (trinn 3.4.) Avfall nøytrofiler. Modifikasjoner for å minimere netto tap på dette punktet kunne øke den endelige netto yield. Dessuten må isolerte NET brukes innen 12-24 timer av sin isolasjon, noe som krever nøye eksperiment planlegging og tidsstyring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20 mm grid (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
References
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).
- McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
- Khandpur, R., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss. Front Immunol. 3, 362 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. , (2013).
- Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell Mol Life Sci. , (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), (2010).
- Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).
- Boyum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).
- Calado, R. T., et al. Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).
- Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. Characterization and regulation of bv8 in human blood cells. Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).
- Wu, Y. J., et al. In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).
- Saffarzadeh, M., et al. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
