Introduction
間葉系幹細胞（MSC）は、再生医療及び組織工学における主要な役割を果たしている。彼らは彼らに自家療法の2,3のための理想的な候補をレンダリングしている、様々な細胞タイプ1に分化し、生着、移行することができます。最近、骨および軟骨修復のためのMSCを用いた臨床試験は、宿主病または心臓病、移植片対4を立ち上げた。これらのMSCは、臍帯または脂肪組織から採取することができるが、最も有望な結果は、骨髄由来の幹細胞5から得られた。
腸骨稜は、骨髄のかなりの量を収集することができ、したがって、吸引6の主な部位として働く。しかし、吸引の品質を回収骨髄の体積の増加に伴って減少する。骨髄穿刺液の最初の5mlを、高品質のMSCを含み、一方、より大量の撤退は、末梢血fの吸引物の希釈につながる高度に血管骨7を挿入します。抗凝固剤を使用しない場合は、そのため、本巨核球及び血小板の、骨髄吸引物は、凝固する傾向がある。しかし、たとえ抗凝固剤で、血栓が発生することがあります。
骨髄では、MSCは、全細胞プール8のごく一部を表し、ほとんどの組織工学または治療用途4培養中で増殖しなければならない。そのような文化が大きくすなわち 、初期の細胞プールに依存している。、多様性と高始動番号9の品質。引き出しからMSCの低い数字は、部分的にドナーの変動によって説明することができる。一方、低品質のサンプルからのMSCは、所望の細胞数に到達するために培養においてより長い時間を延長継代を必要とする。いずれの場合も、拡張継代は、細胞老化の源であり、10の潜在的分化の喪失につながる可能性がある。したがって、セルyを最大化することができるプロトコルを最適化ieldと有害な影響を防ぐには、11,12を開発しなければならない。
私たちは、犬のMSCとの仕事を始めたとき、私たちは幸いに凝固したヒトサンプル（10人に1）はあまり頻繁であったが約3〜4におけるイヌの骨髄サンプルは、血栓が含まれているのを見て驚いた。一方で、それは我々が凝固したサンプルからのMSCのはるかに低い収量を観察していることを、全く驚きませんでした。凝固したサンプルの定期的な問題を解決するために、我々は代わりにリサンプリングの血栓溶解薬ウロキナーゼを使用してプロトコルを開発しました。
血栓溶解療法は、心臓発作、脳卒中ため、または不要な凝固の塞栓症の原因となる血管の閉塞などの生命を脅かす状況に対抗することができます。彼らは、プラスミンおよび酵素プラスミノーゲン活性化因子によるフィブリンの酵素的切断を通して血栓の分解によって働く。患者の治療のための幅広い使用にもかかわらず、ごく少数の出版物は、その利用血栓溶解活性を存在実験室でのアプリケーションは、凝固したサンプルを救出するために、主にリンパ球に焦点を当てた。 1987年、肉じゃがら 。 13と4年後の機能的なリンパ球になり、血栓を溶解するためのストレプトキナーゼの使用を記載し、デ·ヴィスら 。フローサイトメトリーアプリケーション14のための血液および骨髄からの白血病細胞を単離するためのストレプトキナーゼの使用を拡張する。より最近の刊行物は、癌の診断15アルテプラーゼの使用を示唆している。同じ酵素アプローチを使用している間、私たちのプロトコルは、多能MSCの分離に焦点を当てて、幹細胞分野の研究者のためのツールを提供するために、骨髄を形成する。
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Protocol
注：腸骨稜からのヒト骨髄吸引は、ルツェルン州の倫理委員会の承認を得てドナー同意から採取した。犬の所有者のconsent.Human（約20ml）およびイヌ（約10ml）を骨髄穿刺液を直ちに中止後に3.8％クエン酸ナトリウムを15mlの添加により抗凝固して腸骨稜からイヌ骨髄吸引物を採取した手術室で。試料を回収と同日処理する実験室の環境に移した。
ウロキナーゼの調製（従来1回目使用すること）
- 製造業者の説明書に従って、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用してウロキナーゼを再：10 mlシリンジを用いてセプタム入口フラスコに10mlのPBSを加える。ミリリットル50,000射出ユニット（U）を得かき混ぜることによって乾燥物質を溶解する。
- Sに500μlのアリコート（25000 Uそれぞれ）を準備terileチューブ。ストアアリコート-20℃と、少なくとも6ヶ月間に必要なときにそれを使用しています。
2.取手順（従来すべての骨髄治療へ）
- 凝固した骨髄穿刺液あたりウロキナーゼの一アリコート（25000 U）を解凍し（25 mlまで吸引ボリュームが正常25000 Uの単一のアリコートを使用して治療されている）。
- 37℃の水浴または振盪インキュベーターを予熱。
血餅の3酵素消化物
- 処理中の骨髄試料の微生物汚染を避けるために、層流生物学的安全キャビネット内ですべての作業を行う。感染の可能性の人間の材料を使用する場合は、保護手袋の使用だけでなく、慎重な取り扱いをお勧めします。
- 無菌の50ミリリットルチューブの上に100μmのセルストレーナーを置きます。慎重にストレーナを傾けたり、凝固材料の周りに移動する、セルストレーナーを通して骨髄穿刺液を注ぐ。のための滅菌ピペットチップを使用して、フィルターメッシュを通してより良い流れ。
注：PBSで凝血塊を洗浄することにより、例えば 、血餅のすべての希釈は避けてください。ウロキナーゼは、間接的に作用し、効果的なダイジェストのための生検からの血清の成分（ すなわち 。、プラスミノーゲン）が必要です。凝固材料と手順を継続しながら、ろ液をステップ3.6においてさらに使用するまで室温で保つことができる。 - 滅菌ピンセットを使用して、空の細胞培養皿に骨髄クロット材料を転送します。滅菌メスを用いて約2ミリメートル3の小片に破片をカット。
- 滅菌ピンセットを用いた50ml反応管に血餅の小片を転送する。ミンチ血栓が濡れ外観を有することを確認してください。それが乾燥しているように見える場合は、湿らせるステップ3.1からのろ液の一部を使用。
- ピペッティング5ミリリットルマイクロピペットを用いて、5回によって凝血塊を粉砕する。サンプルにウロキナーゼの1分量を追加します。水浴中、またはのいずれかで37℃で30分間インキュベート揺れ（優しく）インキュベータ。
- 5ミリリットルピペットを用いて5回上下にピペッティングとによって粉砕物。バイオセーフティキャビネットに、この手順を実行します。 37℃でさらに30分間インキュベートする。インキュベーション後5mlのピペットを使用して再度5回粉砕する。ステップ3.2からの濾液とプールする新鮮さ100μmのセルストレーナー上を通過。
- 遠心分離機500×gで10分間、周囲温度で細胞懸濁液。上清を捨てる。以下に記載またはMSC増殖培養のためのあなたの研究室の標準的な手順に従って、メディアで細胞ペレットを再懸濁。
拡張細胞培養およびCFUプレート4.シード
- α-MEM、10％ウシ胎児血清（FBS）、100 U / mlペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシンおよび2.5mg / mlのアンホテリシンBを補充した：基礎培地50ml中の（赤血球および単核細胞からなる）細胞を再懸濁。ノイバウアーchambeを使用してトリパンブルー溶液で1:10に希釈した細胞を数えるR。
- 5×10 7細胞/ cm 2の密度で細胞培養フラスコ中の細胞をプレーティングし、37℃の加湿インキュベーター中でインキュベートする。利用可能な場合は、低酸素（5％酸素）の条件を使用しています。 CFUアッセイの制御のために、直径10cmの細胞培養皿に10 9細胞をプレー。
- 他の細胞は懸濁状態のままで、培養の3日後に、間葉系幹細胞は、細胞培養皿に付着している。 5 / mlの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を補充した基礎培地でメディアを変更。 CFUアッセイ制御のために、同様に細胞培養皿を扱う。
- メディア週3回の交換を、2週間の合計のための細胞培養を続けます。細胞が80％コンフルエントを超えた場合、トリプシン処理によって分割。 CFUアッセイ制御のために、同様にメディアを交換しますが、2週間のために細胞を分割しないでください。
CFUアッセイ5.ギムザ染色
- DIL：皿当たりギムザ-溶液10mlを準備UTE原液（グリセロール中で7.6グラム/リットルギムザ：メタノール）滅菌水で1:10（常に新鮮なワーキング希釈液を調製）。
- 細胞培養皿から培地を除去し、PBSで細胞を洗浄。ペトリ皿に液体を適用するときに非常に警戒して、細胞を洗浄をオフにしないようにしてください。
- RTで5分間純メタノールで細胞を固定してください。メタノールを捨てる。ギムザ溶液を添加し、37℃の加湿インキュベーター中で60分間インキュベートする。
- PBSで2回洗浄する。空気は、ペーパータオル上で第一の板状のヘッドを乾燥させる。手動でコロニーを数える。これが最善のプレートの背面にマーカーペンを使用して達成される。
6. MSCの分化
- 犬MSCの分化
注：犬MSCは、4週間の適切なメディアでの刺激により軟骨、骨形成および脂肪生成系統に分化した。 - のために 脂肪細胞分化、4×10 5 CEでの単層における培養のMSC次のように二つの異なる培養条件を交互LLS / cm 2で、
- DMEM +グルタ、3％FBS、100単位/ mlのペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシン、2.5 / mlのアンホテリシンBおよび170 mMのインスリンを含有する脂肪生成維持培地で培養。
- 3％FBS、5％ウサギ血清、1μMデキサメタゾン、500μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン、33μMビオチン、5μMロシグリタゾンおよび17μMパントテン酸16を補足した維持培地と脂肪生成誘導メディア文化。
- オイルレッドOで染色することにより脂肪滴を楽しむ。簡単に述べると、10％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、PBSで洗浄し、イソプロパノール中0.35％オイルレッドOで染色。
- 7×10 3細胞/ cm 2と以下に刺激で単層中の骨形成分化培養MSCの場合：
- アドバンストDMEM（GIBCO）+グルタ、5％FBS、100単位/ mlのペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシン、2.5 / mlのアンホテリシンB、501; M L-アスコルビン酸-2-リン酸、10mMのSS-グリセロリン酸および100nMデキサメタゾン。
- フォン·コッサ染色（5％のAgNO 3）で鉱化預金を特定します。簡単に説明すると、蒸留水5％のAgNO 3を含むPBS汚れで洗浄し、10％ホルムアルデヒドで細胞を固定する。
- 軟骨細胞分化
- スポンジ状の医療機器からカットキューブ（側面あたり3 mm）は、凍結乾燥されたI型コラーゲンから構成され、セル17を支持する足場材料として用いる。
- 4×10 6細胞/ ml（〜7万細胞/立方体）の濃度の立方体の上にシードのMSC。
- 培地の添加の前に、細胞を30分間キューブに付着させる。
- DMEM / F12 +グルタ、2.5％FBS、100単位/ mlのペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシン、2.5 / mlのアンホテリシンB、40 / mlのデキサメタゾン、50μg/ mlのアスコルビン酸からなる軟骨形成培地中のMSC-コラーゲン構築物を維持する酸2リン酸、を50μg/ mlのL-プロリン、1×インスリン - トランスフェリン - セレンX、および増殖因子β1を形質転換を10ng / mlである。
- 構文セクションにプロテオグリカンの蓄積を可視化するためにアルシアンブルー染色を使用してください。簡単に言えば、0.01％のH 2 SO 4および0.5M塩酸グアニジンに溶解した0.4％アルシアンブルーのセクションO / Nを染色する。次に、洗浄のセクションでは、40％DMSOおよび0.05MのMgCl 2中で30分間洗浄した。細胞を核ファーストレッドで対比染色した。
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Representative Results
と一緒に、彼らは私たちの研究室（ 図1A）に到着したとき、犬の骨髄サンプルの74パーセント（N = 54）は血栓を含んでいたことの事実は、私たちはMSCの相当数が、血栓内に捕捉されたと信じていた、これらのサンプルからMSC利回りの低下。実際に、切片凝固材料の単純なDAPI染色は、高密度（ 図1B）中の有核細胞の存在を確認する。これは最終的にウロキナーゼを使用してプロトコルを開発するために私たちをトリガー拡張文化に利用可能なMSCの低い数字、につながる。一般的に私たちのプロトコルを適用した場合、ほぼ完全に消失凝固する。ただし、メソッドの開発中に、我々はダイジェストの前後に計量することによって体系的にダイジェスト血餅の問題に取り組んだ。これらの実験は、未消化の残りは、初期血餅重量（ 図2A）の15％（イヌ）または9％（ヒト）であることが明らかになった。
骨髄由来MSCの典型的な特徴はAです細胞培養皿に付着するビリティ。研究者は、MSCのために選択するには、この特性を利用する。結果として、コロニー形成アッセイは、単純な定量的かつ信頼できる方法で細胞プールの品質を評価することを可能にする。我々の研究室では、本明細書に記載のコロニー形成アッセイは、処理されるすべての骨髄サンプル（非凝固したもの）に日常的に適用されている。これは、私たちはウロキナーゼダイジェストの有効性を判断するための主な基準としてアッセイを使用することを許可された。直接の比較を可能にするために、凝固したサンプルの濾液からの細胞（ すなわち 、凝固したサンプルは、単に濾過したかのように酵素的に処理されていない）と血栓を消化は二週間インキュベートした別個の10cm皿上に播種した。 （ 図2（b）に示すように）、ギムザ染色でコロニー形成単位（CFU）を可視化する際に、我々は、対応する最初の濾液（ 図2C）からよりも、イヌのサンプルウロキナーゼ反応から3.8倍のCFUを観察した。 ALTHウワーッ目立た、ヒトのサンプルは、プロトコルの適合性を確認した、処理されたサンプルから1.6倍以上のCFUと同様の傾向を追った。実際、 図2（b）の右側の列に示されている消化血餅のプレートは、プールしたサンプルで見られ典型的な結果に対応しています。しかし、ドナーの変動が簡単に描かれているものの二倍に半分からCFU番号になることがあります。
コロニーがプレート上に現れた多くのメディア（2-5 mm）とし、大規模な細胞プールの品質の指標としてコロニーサイズ、（> 5 mm）を取ることはろ液（ 図2C）からCFUに比べ血栓から播種した。これは一般的にMSCがウロキナーゼ治療後に正常に成長することを示しています。また、血栓ないサンプルに集約、消化された犬の標本の比較（N = 21）で（N = 7）大きなサンプル間の変動は、異種ドナー集団に起因して観察されたが、処理されたサンプルの総MSCの比較可能な数値が得られた（ 図2D）。
適合の最終機能試験として、我々は、消化された骨髄試料に由来MSCの分化を誘導した。自己幹細胞療法におけるアプリケーションは、軟骨、骨または脂肪組織または18シグナリング MSCのパラクリンへのMSCの分化に基づいている。細胞は、脂肪生成分化19、骨形成分化20または軟骨形成系統17のための適切な培養条件を選択することによって、分化の所望の経路に向けて案内することができる。したがって、我々は、骨髄クロットからunclotted骨髄試料由来のMSCのMSCを比較した。培養中の4週間後に、3つすべての上記の系統へのMSCを区別することが可能であった。これは組織学的に、 フォン·コッサ （骨形成系列の場合）でテストされました オイルレッドO（脂肪生成）とグループ間の分化の等級に差を示さないアルシアンブルー（軟骨形成）染色、（ 
図1.骨髄クロット。到着（A）の際に、部分的に凝固した状態におけるイヌとヒト骨髄サンプルの割合。さらに、我々は凝固したサンプルからのMSCの利回りが強く起因する血栓内に捕捉された細胞の高い数に減少したことがわかった。有核細胞の数が多いイヌ骨髄クロット（B）からの凍結切片をDAPI染色によって示されるように血栓内に存在する。スケールバーは200μmでを表します。 
ウロキナーゼで消化し た骨髄クロットからMSCの図2.離 。 （A）一般的に、骨髄クロットは、ウロキナーゼダイジェスト時、ほぼ完全に消失する。メソッド開発時には、私たちは強くすると減少したことを（NS =有意ではないP = 0.10、平均±SD、n = 3）の犬のために血栓の重みを評価した（n = 5、平均値±SD、** P≤0.01）及びヒト試料ウロキナーゼダイジェスト。 （B）単純なCFUアッセイは、MSCの調製物の品質を評価するための有益なツールとして役立つことができる。ダイジェストの有効性を評価するために、CFUアッセイ濾液を行い、別途骨髄吸引物から血栓を消化した。培養2週間後、10cmの対照プレートをギムザで染色し、CFUを計数した。アッセイは、CFUの数が多いが、ウロキナーゼダイジェスト機能を維持することによって血餅から放出させることができることを確認した。これは、大きなコロニー（クラス分割の高頻度によって確認されています。黒> 5ミリメートル、濃い灰色2-5 MMとライトグレーの<2ミリメートルエラーバーは、犬のためのn = 5（合計CFUのSDを表す、n = 3の人間のために、**のp≤0.01、ナノ秒=有意ではない、のp = 0.17）。（C）写真ギムザ染色されたプレートからのsが示された結果を確認する。しかし、数字によるドナーの変動に大きく変化することができます - 消化された血栓のために示さプレートは消化骨髄サンプルのための典型的な結果に対応しています。 （D）合計で、ウロキナーゼは自然に血栓無料サンプル（N = 7は、平均±SD）にする拡張培養後の同程度の総MSC利回りのプロトコル（N = 21）の結果を消化適用する。全体図2のための統計分析は、スチューデントのt -テストを用いて行った。 
ネイティブにunclottedサンプルに対して消化の分化能の図3.の比較。ウロキナーゼ（一番上の行）とunclotted骨髄（下の行）で処理された凝固骨髄から単離されたイヌMSCは、骨形成表現型に分化し、 フォン·コッサ （バー=によって染色した200μm）と、脂肪生成表現型は次式で染色した オイルレッドO（バー=100μmで、脂肪空胞のインセットの大きな倍率で）、軟骨形成は、アルシアンブルー染色（バー=100μmで、対比核ファーストレッド）によって明らかにされた。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
患者は少しだけ追加作業が手術室に人員によって行わなければならない利点と、（我々の場合、主に手術を背骨）手術を受けている間に定期的に、我々は、骨髄をサンプリングする。サンプルはすぐに撤退した後、クエン酸ナトリウムと混合されるにもかかわらず、彼らは、処理のために研究室に到着したとき、多くのサンプルが部分的に凝固しただった。この段階では、凝固した標本を交換するリサンプリングは、別々の追加の介入が再びローカルまたは全身麻酔6必要となります。これが貢献する臨床スタッフとドナーの両方の意欲を必要とし、資源21を大量に消費する。
ここでは、多能性MSCを分離するために凝固した骨髄サンプルに組換えヒトウロキナーゼを使用するプロトコルを提供する。我々は、ウロキナーゼ処理は細胞を傷つけず、分化能が保持されていることを実証できた。プロトコル同等の細胞プールを得ながらunclottedサンプルと比較して、わずか約1 1/2時間によってサンプル処理を延ばすので、短い。現在までに、このプロトコルは正常にいくつかのロットからウロキナーゼを使用して、異なる個人およびイヌから骨髄クロットに適用された、堅牢で再現性の成功を示している。これとは別に、ウロキナーゼは、サンプル固有プラスミノーゲンの活性化を介して間接的に作用。これはウロキナーゼ反応はプラズマ環境が必要であることを意味します。それは、 例えば、PBSで血栓すすぎまたは同様の手順をご紹介することがunadvisableです。これは、血清環境を希釈し、酵素反応の有意なスローダウンにつながる。
私たちのメソッドのウロキナーゼを使用するという決定はなく、別の血栓溶解薬は些細だった：私たちは私たちの病院の薬局で容易に入手できる血栓溶解薬に基づくプロトコルを開発しました。他の研究グループのためには、そのための組織TYPを使用する方が簡単な場合がありEプラスミノーゲン活性化因子（ すなわち 、アルテプラーゼ、レテプラーゼまたはテネクテプラーゼのような別の薬剤製品）ウロキナーゼは利用できない場合。しかしながら、これらの薬物間の潜在的に重要な違いが存在する：ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（uPAR）22に結合されたとき、組織型プラスミノーゲン活性化因子とは異なり、ウロキナーゼは細胞の活性化および増殖を誘発することができる。結合すると、細胞内シグナル伝達カスケードは、細胞の移動および増殖へのリード線を活性化する。生理学的状況において、これは、さらに、活性化細胞によるマトリックスメタロプロテイナーゼの分泌によって支持されている。しかし、我々のシステムでは、ウロキナーゼが希釈され、徐々に有害な効果を示すことなく、増殖培養の際に除去。それでも、単離されたMSCの意図された使用に関して、血栓溶解薬のいずれかの適合性を個別に決定する必要がある。
一般的に、迅速かつ完全な血栓ダイジェストのための高投与量は、MIすることをお勧めします血栓処理中に不要な選択をnimize。注目すべきは、多くの以前の研究では、血液や骨髄クロット13,14を消化するための細菌ストレプトキナーゼを使用していました。しかし、この薬剤は、望ましくない活性化及び患者への細胞の適用が意図され、特に大きな欠点であり得る免疫系の応答を誘発することができる。
したがって、我々は、我々のプロトコルが唯一の時間を節約し、コストを削減するために、研究者や医療の専門家を助けにはならないと考えている。ウロキナーゼを使用する - 承認された酵素薬を知らずに抗原性 - でも、MSC製剤の治療的使用を目的とした多くのトランスレーショナルリサーチラボのための貴重なツールを提供することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
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