Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) играют важную роль в восстановительной медицины и тканевой инженерии. Они могут мигрировать, дифференцироваться в различные типы клеток 1 и привить, что делает их идеальным кандидатов на аутологичных терапии 2,3. В последнее время, клинические испытания с использованием МСК для восстановления костей и хрящей, привитые против хозяина или болезни сердца были запущены 4. Эти МСК могут быть собраны из пуповинной или жировой ткани, но наиболее обнадеживающие результаты были получены из костного мозга стволовых клеток, полученных 5.
Гребень подвздошной кости позволяет собрать значительное количество костного мозга и, следовательно, служит основной сайт стремления 6. Тем не менее, качество аспирата уменьшается с увеличением объёма костного мозга сняты. В то время как первые 5 мл аспирата костного мозга содержат МСК высокого качества, вывод больших объемов приводит к размыванию аспирата с периферической крови FПЗУ насыщена сосудами кости 7. Из-за существующих мегакариоцитов и тромбоцитов, клетках костного мозга склонны к свертыванию, если не используются антикоагулянты. Но даже с антикоагулянтами, может возникнуть сгустки.
В костном мозге, МСК представляют собой лишь небольшую долю от общего пула клеток 8 и должны быть расширены в культуре в течение большей тканевой инженерии или терапевтических применений 4. Качество такой культуры во многом зависит от исходного пула клеток, т.е.., Разнообразие и высокий пусковой число 9. Низкое число МСК из изъятий может быть частично объяснено изменчивости доноров. С другой стороны, МСК от низкой образцов качества требуют более длительного времени в культуре и расширенный пассирования, чтобы достичь желаемого количества клеток. В любом случае, расширить пассирования является источником клеточного старения и может привести к потере потенциальной дифференциации 10. Таким образом, оптимизируется протоколы, которые могут максимально клеток уIELD и предотвратить нежелательные эффекты должны быть разработаны 11,12.
Когда мы начали работать с собачьими МСК, мы были удивлены увидеть, что около трех из четырех собак образцы костного мозга содержатся сгустки, в то время как, к счастью, со сгустками человека образцы (один из десяти) были менее частыми. С другой стороны, это не было неожиданностью, что мы наблюдали гораздо меньший выход МСК из запекшейся образцов. Для решения повторяющихся вопрос о сгустками образцов, мы разработали протокол, используя тромболитической урокиназы наркотиков, а ресэмплирования.
Тромболитические терапии может противодействовать ситуациях, угрожающих жизни, таких как окклюзии кровеносных сосудов, вызывая инфаркт, инсульт или эмболии из-за нежелательного свертывания. Они работают путем деградации тромбов с помощью ферментативного расщепления фибрина плазмином и ферментативного активаторов плазминогена. Несмотря на широкое использование для лечения больных, только очень немногие публикации существуют, которые использовали тромболитическими деятельностьдля лабораторных применений, чтобы спасти сгустками образцы, в основном сосредоточив внимание на лимфоциты. В 1987 году Нику и др. описано применение стрептокиназы для растворения сгустков крови, получаемые в функциональных лимфоцитов 13 и четыре года спустя, De Vis и др. продлить срок использования стрептокиназы, чтобы изолировать лейкозных клеток из крови и костного мозга для проточной цитометрии приложений 14. Более недавняя публикация предполагает использование Alteplase для диагностики рака 15. При использовании же ферментативной подход, наш протокол фокусируется на изоляции мультипотентной МСК форма костного мозга, чтобы обеспечить средства для исследователей в области стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: клетках костного мозга человека от гребня подвздошной кости были собраны из согласие доноров с одобрения комитета по этике кантона Люцерн. Собачьи клетках костного мозга от гребня подвздошной кости были собраны с consent.Human владельца собаки (ок. 20 мл) и собак (ок. 10 мл) клетках костного мозга были анти-коагулируют добавлением 15 мл 3,8% цитрата натрия сразу после отмены в операционной. Образцы были переданы в лабораторных условиях для обработки тот же день, изъяты.
1. Подготовка урокиназы (До 1-го использования)
- Развести урокиназа, используя стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) в соответствии с инструкциями изготовителя: Добавить 10 мл PBS с перегородкой всасывания колбу с помощью 10 мл шприц. Растворите сухое вещество, вращая, чтобы получить 50 000 единиц инъекций (U) на мл.
- Подготовка 500 мкл аликвоты (25000 U каждый), в сterile трубы. Магазин аликвоты -20 ° C и использовать его при необходимости, по крайней мере, 6 месяцев.
2. Подготовительные шаги (перед каждым костного мозга Лечение)
- Оттепель один аликвоту урокиназы (25000 U) в запекшейся аспирата костного мозга (аспирата объемы до 25 мл успешно лечили с помощью одного аликвоту 25000 U).
- Разогрейте на водяной бане или встряхивания инкубатор до 37 ° C.
3. Ферментативный Дайджест Сгусток
- Выполните все работы в ламинарном шкафу поток биобезопасности, чтобы избежать микробного загрязнения образцов костного мозга в процессе обработки. При работе с потенциально инфекционными человеческого материала, использование защитных перчаток, а также бережного обращения рекомендуется.
- Поместите 100 мкм клеточный фильтр сверху стерильную пробирку на 50 мл. Осторожно вылейте аспирации костного мозга через ячейки сетчатого фильтра, наклоняя фильтр или перемещение вокруг сгустка материала. Используйте стерильный наконечник пипетки длялучше поток через сетчатый фильтр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте разбавления сгустка, например, путем промывания сгусток с PBS. Urokinase действует косвенно и требует компоненты сыворотки (т.е.. Плазминогена) от биопсии для эффективного дайджеста. Продолжая процедуру с сгустка материала, фильтрат не может быть при комнатной температуре до дальнейшего использования на стадии 3.6. - Трансфер сгусток материала костного мозга в пустую ячейку культуры блюдо использованием стерильного пинцета. Сокращение мусора на мелкие кусочки приблизительно 2 мм 3 с использованием стерильным скальпелем.
- Передача небольшие кусочки тромба в 50 мл реакционной трубки с помощью стерильного пинцета. Убедитесь, что фарш сгусток имеет влажный внешний вид. Если это, кажется, быть сухой, использовать некоторые из фильтрата со стадии 3.1, чтобы увлажнить.
- Растирают сгусток с помощью пипетки вверх и вниз по 5 раз с помощью 5 мл микротитровальный пипетки. Добавить 1 аликвоты урокиназы в образце. Инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С либо в водяной бане или впожимая (мягко) инкубатор.
- Triturate с помощью пипетки вверх и вниз по 5 раз с помощью 5 мл пипетки. Выполните этот шаг в шкафу биобезопасности. Инкубировать в течение еще 30 мин при 37 ° С. После инкубации растирают снова в 5 раз с помощью 5 мл пипетки. Пойдите свежий фильтр 100 мкм клеток для объединения с фильтратом со стадии 3.2.
- Центрифуга клеточной суспензии при комнатной температуре в течение 10 мин при 500 х г. Удалите супернатант. Повторное приостановить осадок клеток в средствах массовой информации, как описано ниже или в соответствии со стандартной процедурой в вашей лаборатории для МСЦ расширения культуры.
4. Посев для расширения клеточной культуре и КОЕ Плиты
- Ресуспендируют клеток (состоящая из эритроцитов и мононуклеарных клеток) в 50 мл базальной среды: Альфа-MEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина и 2,5 мг / мл амфотерицина . Граф клеток разбавленный 1:10 в трипанового синего раствора с использованием Chambe Нейбауерар.
- Пластина клеток в культуре клеток колбах при плотности 5 х 10 7 клеток / см 2 и инкубировать в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С. Если возможно, используйте гипоксию (5% кислорода) условиях. Для контроля анализа КОЕ, пластина 10 9 клеток в клеточной культуральной чашке диаметром 10 см.
- После 3 дней культивирования, мезенхимальные стволовые клетки прикреплены к клеточной культуральной чашке, а другие клетки остаются в суспензии. Изменение среды с базальной среде, дополненной 5 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF). Для пробирного контроля КОЕ, лечить блюдо культуре клеток также.
- Продолжить клеточной культуры в общей сложности 2 недель, обмен средствам массовой три раза в неделю. Если клетки превышать 80% слияния, расщепляется трипсином. Для пробирного контроля КОЕ, обменять СМИ также, но не разделить клетки для течение двух недель.
5. Гимза для CFU Пробирной
- Подготовка 10 мл Гимза-решения на чашку: DILЮт раствор (7,6 г / л Гимза в глицерине: метанол) 1:10 в стерильной воде (всегда свежеприготовленной Рабочее разведение).
- Выньте материал из культуры клеток блюдо и мыть клетки с PBS. Будьте очень precautious при применении жидкости в чашку Петри и избежать смывания клетки.
- Исправить клетки в чистом метаноле в течение 5 минут при комнатной температуре. Отменить метанола. Добавьте Giemsa-раствор и инкубируют в течение 60 мин в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С.
- Промыть два раза с PBS. Воздух сухой плиты головой на бумажное полотенце. Граф колонии вручную. Это лучше всего достигается с помощью маркера ручку на задней пластине.
6. MSC Дифференциация
- Собачьи МСК дифференциация
ПРИМЕЧАНИЕ: Собаки МСК были дифференцированы в Хондрогенные, остеогенного и адипогенных линий путем стимуляции с соответствующим СМИ в течение четырех недель. - Для Того Adipogenic дифференциация, культура МСК в монослое на 4 х 10 5 в.п.заполняет / см 2 переменного две различные условия культивирования, как следует;
- Культура обслуживания адипогенез среде, содержащей DMEM + GlutaMAX, 3% FBS, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина, 2,5 мкг / мл амфотерицина В и 170 мМ инсулина.
- Культура адипогенеза индуцирующего средах с поддерживающей среде, содержащей 3% FBS, 5% сыворотки кролика, 1 мкМ дексаметазона, 500 мкМ 3-изобутил-1-метилксантина, 33 мкМ биотин, 5 мкМ розиглитазон и 17 мкМ пантотенат 16.
- Ревель липидных капель с помощью окрашивания масляным красным-O. Короче говоря, исправить клеток с 10% формальдегида, промывают PBS и окрашивают 0,35% масла красного O в изопропаноле.
- Для Остеогенной дифференциации культуры МСК в монослое на 7 х 10 3 клеток / см 2 и стимулирования в следующем:
- Расширенный DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% FBS, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина, 2,5 мкг / мл амфотерицина В, 501; M L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата, 10 мМ бета-глицерофосфат и 100 нМ дексаметазона.
- Определить минерализации месторождения от Von Косса пятно (5% AgNO 3). Вкратце, клетки фиксируют 10% -ным формальдегидом, промывают PBS и пятна с 5% AgNO 3 в дистиллированной воде.
- Хондрогенные дифференциация
- Нарезать кубиками (3 мм с каждой стороны) из губки в форме медицинского устройства, составляется от лиофилизированного коллагена типа I, и используется в качестве каркасного материала, чтобы поддерживать клетки 17.
- Семенной МСК на верхней части кубиков в концентрации 4 × 10 6 клеток / мл (~ 70000 клеток / куб).
- Перед добавлением информации, позволяют клеткам прилипать к кубиков в течение 30 мин.
- Поддержание MSC-коллагена конструкции в хондрогенной сред, состоящих из DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина, 2,5 мкг / мл амфотерицина В, 40 нг / мл дексаметазона, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты 2-фосфата,50 мкг / мл L-пролина, 1x Инсулин-трансферрина-Селен Х и 10 нг / мл трансформирующий фактор роста-β1.
- Используйте альциановым синий окрашивание визуализировать накопление протеогликанов в конструкциями разделах. Короче говоря, пачкают разделы O / N с 0,4% альциановым синий, растворенного в 0,01% H гуанидингидрохлорида 2 SO 4 и 0,5 М. Далее, мыть срезы промывали в течение 30 мин в 40% ДМСО и 0,05 MgCl 2. Клетки контрастно с ядерным быстрыми эритроцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тот факт, что 74% собак образцов костного мозга (п = 54), содержащиеся сгустки, когда они прибыли в нашей лаборатории (рис 1а) наряду с снижение урожайности MSC из этих образцов, заставил нас поверить, что значительное число МСК был пойман в ловушку в пределах сгустков , В самом деле, простой DAPI-пятно секционного сгустка материала подтверждает наличие ядерных клеток с высокой плотностью (Фиг.1В). В конечном итоге это приводит к низкой численности МСК, доступных для расширения культуры, которые вызвали нас к разработке протокола с помощью урокиназы. Обычно тромбы исчезают почти полностью при применении наш протокол. Тем не менее, в процессе разработки метода мы обратились вопрос сгустка переварить систематически путем взвешивания до и после дайджеста. Эти эксперименты показали, что непереваренные остатки были 15% (собаки) или 9% (человеческий) от первоначального веса тромба (фиг.2А).
Характерной особенностью костного мозга происходит МСК являетсяность придерживаться чашки для культивирования клеток. Исследователи используют эту особенность, чтобы выбрать для MSC. Как следствие, колониеобразующих анализа позволяет оценить качество клеток бассейном в простой, количественного и надежным способом. В нашей лаборатории, образуя анализ колония, описанный здесь, применяется обычно для всех образцов костного мозга, обработанных (также без запекшаяся из них). Это позволило нам использовать анализ в качестве основного критерия для определения эффективность урокиназы дайджеста. Для прямого сравнения, клетки из образцов со сгустками фильтратов (т.е., как если бы сгустками образцы только фильтруют, но не обрабатывают ферментативно) и расщепляли сгустки высевали на отдельных 10 см чашки с последующей инкубацией в течение двух недель. При визуализации колониеобразующих единиц (КОЕ) с Гимза (как показано на фиг.2В), мы наблюдали в 3,8 раза больше КОЕ от урокиназы реакций у собак, чем образцы из соответствующих исходных фильтратов (фиг.2с). ALTHух менее заметными, а затем образцы человека аналогичную тенденцию с 1,6 раза больше, КОЕ из обработанных образцов, подтверждающие пригодность протокола. В самом деле, пластины переваренной сгустка, показанные в правой строке на фиг.2В соответствовать типичной результате видно на объединенной пробы. Тем не менее, изменение донор может легко привести к номерам КОЕ от половины до вдвое, что изображено.
Принимая колонии-размер, как показатель качества клеток бассейна, более среды (2-5 мм) и большой (> 5 мм) колонии появились на пластины посеяны от сгустков по сравнению с КОЕ из фильтратов (рис 2С). Как правило, это означает, что МСК нормально расти после урокиназы лечения. Кроме того, в совокупности, сравнение образцов переваренных собак (n = 21) в образцах без сгустка (N = 7) дали сравнимые количества общих МСК для обработанных образцов, хотя большой вариации между образца следили по к гетерогенной популяции доноров (Рисунок2D).
В качестве последнего функционального теста пригодности, то индуцированные дифференцировку МСК, полученных из переваренных образцов костного мозга. Применение в аутологичных стволовых клеток терапии основаны на MSC дифференциации в хрящевой, костной или жировой ткани или MSC паракринных сигнализации 18. Клетки могут быть направляется к заданной траектории дифференциации путем выбора соответствующих условий культивирования для адипогенной дифференциации 19, остеогенной дифференцировки 20 или хондрогенной линии 17. Таким образом, мы сравнили МСК из сгустка костного мозга МСК, полученных из unclotted образца костного мозга. После четырех недель в культуре, можно было отличить МСК во всех трех указанных выше линий. Это гистологически протестированы с фон Косса (для остеогенной линии), Нефть Red O (Adipogenic) и Alcian Синий (хондрогенные) окрашивание, не показывая различия в степени дифференцировки между группами ( 
Рисунок 1. Костные сгустки мозга. Процент собак и человек образцы костного мозга в частично свернувшейся состояние после прибытия (А). Кроме того, мы обнаружили, что дает MSC из свернутой образцов сильно снижается из-за большого количества клеток, захваченных в сгустков. Большое количество ядерных клеток присутствуют в сгустки о чем свидетельствует DAPI-окрашивания в cryosection из сгустка мозга собачьей кости (B). Масштабная линейка представляет 200 мкм. 
Рисунок 2. Выделение МСК из сгустков костного мозга расщепляли урокиназы. () Как правило, сгустки костного мозга практически исчезают на урокиназы дайджеста.По разработке метода, мы оценили веса сгусток для собак (п = 5, значит, ± SD ** р ≤0.01) и образцы человека (п = 3, означает ± SD, нс = не имеет значения р = 0,10), которые были сильно снижается при урокиназа дайджест. (B) просто КОЕ анализ может служить в качестве информативного инструмента для оценки качества препарата MSC. Для оценки эффективности дайджеста, анализ КОЕ проводили в течение фильтратов и расщепляли сгустков из аспирата костного мозга в отдельности. После двух недель в культуре, 10 управления пластины см окрашивали Гимза и КОЕ подсчитывают. Анализ подтвердил, что большое количество КОЕ может быть освобожден от сгустка урокиназой переварить и оставаться функциональным. Это также подтверждается высокой частотой больших колоний (класс Раздел:.> 5 мм в черном, 2-5 мм в темно-серый и <2 мм светло-серый Усы представляют SD от общего КОЕ (п = 5 для собаки , п = 3 для человека, ** р ≤0.01, нс = не имеет значения, р = 0,17). (С) Изображениес от Гимза окрашенных плит подтвердить результаты, показанные. Планшеты, показанные для сброженного сгустка соответствуют типичный результат для переваренной образца костного мозга - однако, номера могут в значительной степени из-за изменчивости доноров. (D) В сумме, применяя урокиназа переварить протокол (N = 21) результаты в сопоставимых полных выходов MSC после расширения культуры, естественно, сгусток бесплатные образцы (N = 7, средняя ± SD). Статистический анализ для всего фиг.2 проводили с использованием Стьюдента т -test. 
Рисунок 3. Сравнение потенциала дифференциации переваренной против изначально unclotted образцов. Собаки МСК, выделенные из запекшейся обработанной урокиназы (верхний ряд) и unclotted костного мозга (нижний ряд) костного мозга были дифференцированы в остеогенной фенотипа и окрашивали фон Косса (бар =200 мкм), Adipogenic фенотип окрашенных Нефть Red O (бар = 100 мкм; на вставках больше Увеличение жировых вакуолей), в то время как хондрогенез была обнаружена альциановым голубой окраски (бар = 100 мкм; counterstaining ядерной быстрый красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Регулярно мы пробы костного мозга в то время как пациент проходит операцию (в нашем случае в основном хирургии позвоночника), с тем преимуществом, что только немного дополнительной работы будет осуществляться персоналом в операционном зале. Даже при том, что образцы смешивают с цитратом натрия сразу после выхода, много образцов были частично со сгустками, когда они прибыли в лабораторию для обработки. На данном этапе, ресэмплинг заменить сгустками образцов будет отдельный дополнительное вмешательство потребовало вновь местной или общей анестезией 6. Это требует готовности как персонала клиники и донором внести свой вклад и потребляет много ресурсов 21.
Здесь мы предлагаем протокол, который использует рекомбинантный человеческий урокиназу на сгустками образцов костного мозга, чтобы изолировать мультипотентные МСК. Мы смогли продемонстрировать, что лечение урокиназы не повредить клетки и дифференциации потенциал сохраняется. Протоколявляется коротким, так как это продлевает обработки образцов только приблизительно 1 ½ часа по сравнению с unclotted образцов при этом обеспечивая сопоставимые бассейны клеток. На сегодняшний день, этот протокол был успешно применен на сгустки костного мозга от разных людей и собак с использованием урокиназу из нескольких лотов и показал надежную и воспроизводимую успех. Помимо этого, урокиназа действует опосредованно через активацию образца, внутренняя плазминогена. Это означает, что реакция урокиназы требует плазменный среды. Поэтому нецелесообразно вводить меры сгустка промывки или так с например, PBS. Это ослабит среду сыворотки и привести к значительному замедлению ферментативной реакции.
Решение об использовании урокиназы для нашего метода, а не другой тромболитическая препарат был тривиально: мы разработали протокол, основанный на тромболитической препарата легко доступны в нашей больничной аптеке. Для других исследовательских групп может быть поэтому проще в использовании тканей-TYPе активатора плазминогена (т., отличается лекарственный продукт, как альтеплаза, Reteplase или тенектеплазы), если урокиназы не доступен. Тем не менее, потенциально важных различий между препаратами существует: в отличие от активаторов плазминогена тканевого типа, урокиназа может вызвать активацию и пролиферацию клеток при связывании с урокиназы типа активатора плазминогена (рецептора) уАПР 22. После связывания внутриклеточных сигнальных каскадов активируются, которые приводят к миграции и пролиферации клеток. В физиологическом ситуации это подкрепляется секреции матричных металлопротеиназ активированных клеток. Тем не менее, в нашей системе, урокиназа разбавляют и постепенно удалены после расширения культуры, не показывая пагубные последствия. Тем не менее, по отношению к предполагаемому использованию отдельных МСК, пригодность любого из тромболитических препаратов должна быть определена индивидуально.
Как правило, высокие дозы для быстрой и полной сгустка дайджеста рекомендуется Миnimize нежелательного выбор во время обработки сгустка. Стоит отметить, что многие предыдущие исследования использовали бактериальный стрептокиназу для переваривания крови и костного мозга сгустки 13,14. Тем не менее, этот препарат может вызвать нежелательные активацию и реакцию иммунной системы, которая может быть основным недостатком, особенно когда применение клеток пациентам предназначен.
Поэтому мы считаем, что наш протокол не только поможет исследователям и медикам, чтобы сэкономить время и сократить расходы. Использование урокиназу - утвержденный ферментный препарат без известных антигенных - может даже стать ценным инструментом для многих трансляционных исследовательских лабораторий, направленных на терапевтическое использование MSC препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
