Introduction
Begrebet forskellige afstamninger eller delmængder af CD4 + T-hjælper (Th) celler har eksisteret siden den sidste del af det 20. århundrede 1. Anerkendelse af sammenhørende antigen i nærvær af costimulerende signaler resulterer i flere runder af cellulær proliferation og den endelige differentiering til effektor Th celler. Den type Th-celle dannet under denne proces er afhængig af cytokin miljø stede under aktivering 2. Oprindeligt blev naive Th-celler menes at polarisere i 2 særskilte slægter efter T-celle receptor (TCR) aktivering, samstimulerende CD28-ligering, og cytokin signalering. Type 1-hjælperceller (Th1) er kendetegnet ved deres effektor produktion af IFNy cytokin samt deres krav om IL-12-signalering under differentieringsprocessen 3,4. Til sidst blev det opdaget, at differentierede Th1-celler har en genetisk profil, der er mest markant karakteriseret By ekspressionen af T box familien transskriptionsfaktor Tbx21 (T-bet), der anses for master regulator af Th1 genetiske program 5. Endvidere kan IL-12 samt IFNy fremme T-bet-ekspression 6,7. I immunresponset, Th1-celler er vigtig for værtsforsvar mod intracellulære patogener samt stærke promotorer af autoimmun inflammation. I modsætning, type 2-hjælperceller (Th2) kræver IL-4 for deres udvikling og effektor cytokiner, herunder IL-4, IL-5 og IL-13, er vigtige for at drive B-celle responser og er patogene i allergi 8, 9. Svarende til Th1-celler blev Th2-celler sig at udtrykke deres egen herre transkriptionel regulator, betegnet GATA-3 10,11. Interessant tilstedeværelsen af polariserende cytokiner og frembringelsen af en specifik Th afstamning er antagonistisk til udviklingen af andre 2,12, hvilket tyder på, at kun en bestemt Th delmængde kan blive dominerende i en immun respons.
Da identifikation af Th1- og Th2-slægter er yderligere arbejde vist, endnu mere unikt undergrupper af T-hjælperceller, herunder follikulær hjælper (TFH), IL-9-producerende (Th9) og IL-22-producerende (Th22) (for nylig revideret i 13). Med henblik på in vitro-differentiering eksperimenter vil denne protokol kun fokusere på yderligere to Th delmængder, betegnet regulatoriske T-celler (Treg) og IL-17-producerende CD4 + T-celler (Th17). CD25 + regulatoriske T-celler kan forekomme naturligt (nTreg) i thymus; naive Th celler kan også induceres (iTreg) bliver regulerende i periferien (revideret i 14,15). Begge typer af tregs udtrykker en karakteristisk transskriptionsfaktor, betegnet forkhead box P3 (Foxp3), hvilket er kritisk for deres effektor suppression mekanismer, der indbefatter opløselige anti-inflammatorisk mediator produktion, IL-2 forbrug, og celle-kontakt-afhængige mekanismer 14,15. Manglen på Foxp3 ekspression resulterer i en alvorlig, multi-orgel autoimmun sygdom betegnes immundysreguleringssygdom, polyendocrinopathy, enteropati, X-bundet syndrom (IPEX), hvilket viser den kritiske rolle i denne Th undergruppe i løsningen inflammation og regulere perifer tolerance over selvantigener 16. In vitro, naive CD4 + T-hjælperceller opregulere Foxp3 og blive engageret i Treg program ved stimulering med IL-2 og TGF-β 14,15. Der kan være moderat til betydelig plasticitet i CD4 + T-celle slægter, især når man tænker kun cytokinproduktion (revideret i 17,18). Men med henblik på in vitro-differentiering protokoller, vi skal drøfte hver delmængde som en unik afstamning.
For nylig blev en delmængde af Th17 celler, der producerer IL-17 cytokin identificeret som en unik afstamning med pro-inflammatoriske funktioner, der er særligt patogen under autoimmun inflammation 19-21. Th17 celler udtrykker en unik transkriptionsfaktor, betegnes retinoid-relaterede orphan receptor gamma t (RORγt), der koordinerer Th17 genetiske program 22. TGFp er vigtigt for dannelsen af Th17 afstamning gennem induktion af RORγt. Imidlertid er virkningen af TGF signalering menes at kun fremkalde Th17 engagement ved synergizing med IL-6 (revideret i 12). Yderligere undersøgelser har vist, at en række andre signaler, kan positivt regulerer Th17 engagement, herunder IL-1β, øget natrium og TLR signalering 23-26. Andre rapporter har antydet, at de patogene Th17 celler in vivo er dem, der faktisk omgår TGFp signalering og i stedet stole på en kombination af IL-1, IL-6 og IL-23 for deres differentiering 27. Således kan Th17 celler afledes fra en række signalveje; med henblik på denne protokol, den almindeligt anvendte (TGFp og IL-6) vej for Th17 linjeforpligtelsevil blive præsenteret.
Differentieringen protokoller beskrevet nedenfor for alle effektor slægter afhængig fast antistof som stimuli for TCR og CD28 i hele løbet af forsøget. Imidlertid har andre vist, at TCR-aktivering med antigen-præsenterende celler 28 eller tværbinding anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer med hamster-antistof i 2 dage 29 er også yderst effektivt middel til at inducere frembringelsen af forskellige Th undergrupper. Protokollen præsenteres her bygger på tidligere rapporterede metoder til isolering murine CD4 + T-celler fra sekundære lymfoide organer 30 og generere Th17 celler 31. En væsentlig forskel er, at denne protokol bygger på anvendelsen af en cellesorterer at isolere naive CD4 + T-celler fra lymfoide væv. Men mange virksomheder tilbyder nu hurtig separation kits, der kan berige for naive CD4 + -T-celler, som kan være i stand til at omgå kravet feller sortering afhængig af eksperimentet. De metoder og reagenser, der præsenteres i denne protokol er, hvad vi rutinemæssigt bruge og finde på at være den mest effektive. Men husk på, at alternative reagenser og metoder findes for mange af de skridt, der præsenteres nedenfor, og det er op til den enkelte laboratorium at afgøre, hvad der fungerer bedst for deres formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer udføres ved hjælp af protokoller, der er godkendt af kontoret for Miljø og Sundhed på Rosalind Franklin University of Medicine and Science. C57BL / 6 mus (købt hos NCI), der anvendes til denne protokol været opstaldet under specifikke patogenfrie forhold, og alle dyreforsøg blev udført ved hjælp af protokoller godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Rosalind Franklin University of Medicine og Science.
1. Fremstilling af instrumenter, forsyninger og reagenser
- Coat 48-brønds eller 24-brønds plader med anti-CD3 og anti-CD28 (tabel 1) i sterilt PBS, dække og wrap i parafilm for at forhindre fordampning og forurening, og derefter inkuberes O / N ved 4 ° C dagen før T celleisolering. Alternativt coat brønde i 1 time ved 37 ° C. Udfør Th0, Th1, Th2 og iTreg betingelser ved at overtrække både anti-CD3 og anti-CD28 på 1 ug / ml i 0,5-1 ml tiltal volumen (48-brønds plade). For Th17, vi typisk coat anti-CD3 ved 2 ug / ml og anti-CD28 på 1 ug / ml.
BEMÆRK: Vi har fundet, at en lavere anti-CD3-koncentration er optimal for Th1, Th2 og iTreg generation, mens en højere anti-CD3-koncentration er optimal for Th17 generation. Således bør anti-CD3 og anti-CD28 koncentrationer titreres og optimeret til individuelle laboratorier (tabel 2). - Steriliseres et sæt dissektion værktøjer (saks og tang) ved autoklave eller desinficerende opløsning. Et rør eller lille bægerglas indeholdende 70% ethanol vil være behov for hurtig sterilisering af redskaber mellem dissektioner. Endelig vil en sprayflaske indeholdende 70% ethanol være behov for sterilisering af overfladen af mus før dissektion.
- Forbered en dissektion overflade af indpakning et fladt stykke Styrofoam eller opslagstavlen i aluminiumsfolie. Dissekere stifter eller nåle anvendes til at fastsætte dyret på plads.
- Forberede retter eller plader til indsamling af tissues. Hvis pooling væv, separate 60mm skåle indeholdende 3 ml sterilt PBS + 1% FBS (PBS +) for milt og lymfeknuder væv er tilstrækkelig. Hvis holde væv fra individuelle mus adskilt forberede en 24-brønds plade indeholdende 1 ml PBS + i det ønskede antal brønde.
- Forbered komplet RPMI medier til cellekultur og præ-varm før brug (tabel 1).
BEMÆRK: Vi rutinemæssigt bruger RPMI men andre medier såsom IMDM og DMEM kan være lige så effektiv eller bedre afhængigt af laboratoriet og eksperimentet. - Cut 2x2 cm kvadrater af nylon mesh med en 120 um porestørrelse og autoklave til at sterilisere (tabel 1).
- Valgfrit: Hvis du bruger high-speed magnetisk cellesortering system som autoMACS til CD4 + celler berigelse, præ-varmt rindende og skylning buffere i en 37 ° C vandbad for at forhindre beskadigelse af maskinen.
- BEMÆRK: Tilsætning anbefales at øge sortering udbyttet og formindske sortering tid.
- Allefremstillingstrin, undtagen for dissektion, bør udføres i en steril vævskultur hætte.
2. Isolering af lymfeknuder og milt fra mus
- Aflive det nødvendige antal dyr under anvendelse af en institutionelt godkendt teknik. Brug C57BL / 6 hunmus, alder 5-10 wks, på grund af deres høje procentdel af naive T-celler og lavere kropsfedt i forhold til mænd eller ældre mus.
BEMÆRK: Celler afledt fra hanmus vil udføre tilsvarende in vitro og protokollen trin forbliver de samme. Hunmus 5-10 wks gamle, vil typisk give 3-6 x 10 6 naive CD4 + T-celler pr mus. Ved hjælp af forskellige stammer af mus, kan dog påvirke udbyttet og ydeevne. For eksempel kan celler fra C57BL / 6-mus er bedre til at generere Th1-celler, mens celler fra Balb.c mus er bedre til at generere Th2-celler. - Spred benene af dyret og pin dem på plads som vist i figur 1. Skær huden længeitudinally fra anus til hagen og samtidig være omhyggelig med ikke at punktere dybere væv.
- Spread åbner huden med pincet og pin huden på plads for at give nem adgang til lymfeknuder, som vist i figur 1.
- Høst de tilgængelige lymfeknuder fra de steder, der er vist i figur 1. Sensationsprægede lymfeknude med en pincet, mens adskille væv med en anden tang vil give mulighed for nem fjernelse. Placer væv i samlingen skålen.
- Harvest milten fra placeringen vist i figur 1. I dette tilfælde er omhyggelig skæring i peritoneum er nødvendig for at få adgang til milten. Placer væv i en samling skålen.
- Gentag proceduren, hvis flere væv vil blive høstet. Ellers gå videre til de næste skridt. På dette tidspunkt, udføre alle resterende trin på is indtil udpladning af T-cellerne efter sortering.
3. Tissue Forarbejdning og CD4 + Enrichment
- Proces lymfeknuder og milt i forskellige retter at øge udbyttet som lymfeknude cellepræparater ikke kræver erythrocyt lyse, hvilket kan resultere i mindre leukocyt død. Derfor følgende trin beskriver en metode til behandling af milt og lymfeknude befolkninger særskilt efterfulgt ved at kombinere før mærkning til sortering.
- Fjern væv (milt eller fælles lymfeknuder) fra samlingen skålen og sted i en ny 60 mm skål indeholdende 3 ml PBS +. Placer et kvadrat med steril nylon mesh over vævet med steriliserede pincet.
- Tag tommelfinger side af en sprøjte stempel (3-10 ml) og forsigtigt smadre vævet mod masken. Næsten alle af vævet skal gå ind i suspension. Alternativt placeres væv mellem to autoklaverede matteret dias og slibes i suspension.
- Pipette suspensionen op og ned et par gange for at bryde op de resterende opløselige klumper. Læg et nyt firkantet stykke nylon mesh over åbningen af en15 ml konisk rør og filtrere suspensionen gennem for at fjerne resterende snavs.
- Gentag trin 2-4 for yderligere lymfeknude og milt væv.
- Når suspensionen er blevet filtreret i et 15 ml rør fylde den resterende del af røret med PBS + og vend et par gange. Centrifuger cellerne ved 475 x g i 5 minutter ved 4 o C.
- For miltceller, aspireres supernatanten efter centrifugering og resuspendere cellepelleten i 1 ml iskold 1X ACK opløsning pr milt for 1 min for at lysere erythrocytter. Derefter tilsættes 10 ml PBS + oven på ACK vendes røret og centrifuge 475 xg i 5 minutter ved 4 o C.
- For lymfeknudeceller, aspireres supernatanten og resuspender i 2 ml PBS +. Om ønsket kan disse kombineres med miltceller efter deres ACK lysis og vasketrin.
- Aspirer supernatanten efter centrifugering af splenocytter og resuspender i en anden 10 ml PBS +. På dette tidspunkt lymfeknude suspension kan være endded oven af milten suspension, hvis væv pooling er påkrævet for sortering. Centrifugeres røret igen ved 475 xg i 5 minutter ved 4 o C.
- Cellepelleten kan nu forberedt til CD4 berigelse. Hvis dette trin ikke udføres, fortsætte til sortering fremstillingstrin.
- For CD4 berigelse ved hjælp af high-speed magnetisk celle sorteringssystem, resuspender cellulære pellet med CD4-perler. Typisk 15 pi perler fortyndet i 85 pi PBS + anvendes til at mærke de væv fra 1 mus. Rampe op for lyden af perle blanding efter behov, pellet resuspenderes, og der inkuberes i 15-30 minutter ved 4 ° C.
- Vask cellerne med 10 ml PBS +, passere suspensionen gennem nylon i et nyt 15 ml rør til at fjerne snavs, og centrifugeres igen ved 475 x g i 5 minutter ved 4 o C.
- Resuspender pellet i 100 pi PBS + pr mus og videre til positiv udvælgelse på high-speed magnetisk cellesortering system. Hvis du bruger en manuel adskillelse system fBenyt samme producentens anvisninger for berigelse. Alternativt opblande prøverne i FACS buffer: PBS med 1 mM EDTA (pH = 8) og 1% BSA, sterilfiltreret.
- Fjern den positive fraktion og vaskes igen med 10 ml PBS +. Den berigede CD4 + fraktion er nu klar til at blive mærket til sortering.
4. Sorteringen naive CD4 + T-celler
- Mærk cellepelleten med PBS + indeholdende fluorescerende antistoffer rettet mod CD62L, CD44, CD25 og CD4. Hvis anvendelse af antistofferne anført i tabel 1, er fortyndinger for hver billede. Til farvning, er en 100 ul mængde af antistoffet cocktail anvendt pr væv fra en mus.
- Resuspender pellet i antistofcocktail og inkuberes i 15-30 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Vask cellerne med 10 ml PBS + og centrifuger 475 xg i 5 minutter ved 4 o C.
- Før blandingen over en anden nylon filter eller cellefilter cap at reflytte alle rester snavs. Pipette de mærkede celler i et rør, der er kompatibel for cellesorteringsapparatet. Hold celler på is og beskyttet mod lys, indtil den slags.
- Forbered opsamlingsrør ved pipettering 1-2ml af komplet RPMI medier eller FBS i bunden af rør kompatible til indsamling på et cellesorteringsapparat.
- Sorter de naive CD4 + T-celler som en CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - population (figur 2). Vask de indsamlede celler med komplet RPMI medier og centrifugeres som beskrevet ovenfor.
- Pellet resuspenderes i komplet RPMI, tælle de naive celler, og justere koncentrationen til 1 x 10 6 celler / ml.
5. Opsætning af in vitro Differentiering
- Aspireres brøndene i de anti-CD3 og anti-CD28-overtrukne plader og vaske hver brønd med 1 ml sterilt PBS (ingen FBS). For 48-brønds plader, plade 0,5 x 10 6 celler / brønd i 0,5 ml RPMI. For plader med 24 brønde, kultur 1 x 10 6 celler / brønd i 1,0 ml RPMI.
- Hvis testning indflydelse af en faktor, såsom et lægemiddel tilføje stoffet til de passende brønde, enten før, under eller efter differentiering proces afhængig af eksperimentet. Dernæst supplere dyrkningsmedier med cytokiner og blokerende antistoffer i overensstemmelse hermed. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2 og 5000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2.000 ng / ml opløselig 37,51, og 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5000 ng / ml XMG1.2 og 5000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5.000 ng / ml XMG1.2 og 5000 ng / ml 11B11.
BEMÆRK: De betingelser beskrevet ovenfor blev fundet at være optimal for at maksimere cytokinproduktion målt ved slutningen af differentiering eksperimentet (Repræsentative resultater afsnit). Imidlertid bør hver betingelse optimeres til de enkelte laboratorier (tabel 2 - Inkubér pladen ved 37 ° C med 5% CO 2 for 4-5 d før analyse af genekspression og cytokinproduktion. Alternativt fjerne cellerne fra TCR stimuli efter 2 d, justeret til 1 x 10 6 celler / ml med frisk medium, og pladen i nye boringer (ikke-coated) at øge spredning og endelig udbytte. I dette tilfælde er friske polariserende cytokiner og antistoffer ikke nødvendigt, men 10 U / ml IL-2 bør tilføjes nye medier til Th0, Th1, Th2 og iTreg kulturer.
6. Analyse af Differentiering
- For cytokin analyse ved flowcytometri restimulere hver brønd med 10 ng / ml PMA og 1000 ng / ml ionomycin eller 1 ug / ml anti-CD3 for 4-6 timer i nærvær af en Golgi inhibitor, såsom Brefeldin A (tabel1). Udfør intracellulær cytokin farvning afhængigt af forsøget (figur 3).
BEMÆRK: Stain non-slægt-specifikke cytokiner eller transkriptionsfaktorer, såsom IL-4 (ikke vist) og IFNy (figur 3) for Th17 kulturer for hver betingelse som negative kontroller og som en indikator for differentiering effektivitet. Endvidere kan pletten Foxp3 for Th17 kulturer som gensidig udvikling af tregs forekomme med tilføjelse af TGF. - For protein kvantificering, indsamle supernatanterne fra hver brønd og assayet ved cytokin-specifik ELISA (figur 3). Hvis der er bekymring for, at den faktor, der testes har påvirket proliferation sammenlignet med kontrolprøver, kan cellerne vaskes, tælles, normaliseret og derefter restimuleret med 1 ug / ml anti-CD3 i 24 timer før indsamling supernatanter til ELISA assays. Hvis analyse IL-4 fra Th2 er nødvendigt betingelser, vask og igen at stimulere at fjerne IL-4, som kan være leftover fra den indledende differentiering kultur.
- For genekspressionsanalyse af real time PCR, høst celler efter inkubationsperioden vaskes, normalisere og restimulere for 2-6 timer med 1 ug / ml anti-CD3 før høst mRNA (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidspunktet til analyse af differentieringen kan variere afhængigt af Th tilstand testes samt styrken af T-celle-receptor-aktivering. Efter 2-3 dages differentiering, kan celler visualiseret ved lysmikroskopi for at bestemme omfanget af T-celleproliferation. Wells udviser omfattende proliferation og sammenklumpning af celler vil sandsynligvis være klar til analyse på dag 4. differentieringstilstande afhængige tilsætning af exogent IL-2, såsom Th1 og Th2, vil sandsynligvis udtømme mediet efter 4 dage i kultur. For at maksimere cytokinproduktion kan sådanne brønde med opbrugte medier suppleres med frisk RPMI indeholdende IL-2 eller talt og re-udpladet ved 1 x 10 6 celler pr brønd i frisk RPMI indeholdende IL-2 til at udvide differentieringen til en anden dag eller to ved hjælp af denne metode.
Figure 1. Illustration af pin placering for at fastsætte en mus til isolering af milt og lymfeknuder. (A) Spred benene fra hinanden og løse dem med en steril nål eller dissektion pin. Fra denne position, skære pels og hud i længderetningen fra halen til hagen. (B) Efter skæring, fordeles forsigtigt huden fra hinanden for at blotlægge lymfeknuder som vist på billedet. Placeringerne af lymfeknuder, der er let tilgængelige fra denne position er angivet i billedet. Milten er placeret lige under brystkassen på højre side af dyret. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. repræsentant sortering strategi til isolering af naive CD4 + T-celler ved cellesortering. Startende fra øverste venstre, lymfocytter først låge efter størrelse og derefter singlet celler skelnes fra dublet celler. Gating på singletter afslører en population af CD4 + CD25 + celler, der er nTregs. Gate på CD4 + CD25 - befolkning og derefter sortere naiv (CD62L + CD44 -) fra effektor / hukommelse (CD62L - CD44 +) CD4 + celler. Stiplede linjer angiver porten oprindelse næste plot. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Sample data følgende in vitro Th differentiering. (A) Intracellular cytokin farvning data (gated på CD4 +) fra Th1, Th2, iTreg og Th17 opdelinger. Typisk ikke-afstamning specifikke cytokiner, såsom IL-4 og IFNy for Th17 kulturer skal farves til at bestemme kvaliteten af differentiering. (B) ELISA-dataene efter 4 d Th differentiering, vask, og 24 h restimulering af celler med 1 ug / ml anti-CD3. (C) Real time PCR data af slægt-specifikke transkriptionsfaktorer følgende 4 d differentiering og restimulering i 4 timer med 1 ug / ml anti-CD3. Alle gen mængder blev normaliseret til ekspressionen af β-actin og mRNA fra udifferentierede naive T-celler tjene som grundlag for genekspression. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Tabel 1. se Materialer tabellen nedenfor.
| Reagens | Anbefalet Titrering Range |
| Cytokiner: | |
| Human (h) IL-2 | 5 U / ml - 50 U / ml |
| rmIL-4 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-6 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-12 | 10 ng / ml - 30 ng / ml |
| hTGFb (Th17) | 0,1 ng / ml - 5 ng / ml |
| hTGFb (iTreg) | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| Antibodies: | |
| 2C11 (anti-CD3) | 500 ng / ml - 5000 ng / ml |
| 37,51 (anti-CD28) | 250 ng / ml - 2.500 ng / ml |
| 11B11 (anti-IL-4) | 5.000 - 10.000 ng / ml |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | 5.000 - 10.000 ng / ml |
Tabel 2. Anbefalet Titrering Range for Optimering om differentiering Betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens milten indeholder naive Th-celler, andelen af denne population i lymfeknuder er meget højere. Manglende korrekt identificere og fjerne lymfeknuder i denne protokol, vil resultere i en dårlig udbytte af naive celler. Dette kan især være vanskeligt i ældre mus eller hanmus, der har mere fedtvæv. Som vist i figur 1, ordentlig fastgørelse og pinning af animalske lemmer og hud vil give mulighed for lettere visualisering af tilgængelige ydre lymfeknuder. Når lymfeknuder og milt behandles, cellesortering er den foretrukne fremgangsmåde til opnåelse af et højt oprenset naive CD4 + T-celle population. Renhed er kritisk for at forhindre nTregs eller effektor og memory Th-celler i at påvirke naive celledifferentiering proces. Vanskeligheder med at opnå et højt udbytte af naive T-celler er typisk forårsaget af ineffektiv væv indsamling og behandling eller tab af celler ved udskillelse trin. For at øge udbyttet make sure til at behandle celler under anvendelse af kolde buffere og inkubationer på is. Desuden, for at forhindre tab af celler under berigelse og / eller sortering, optimere reagenser og adskillelse protokoller anbefales på forhånd. Endelig var som nævnt forskellige steder i protokollen trin, differentiering betingelser skal være optimeret til de enkelte laboratorier, før du udfører store eksperimenter (tabel 2).
Som vist i figur 2, kan let skelnes naive CD4 + -T-celler fra nTreg (CD4 + CD25 +) og effektor (CD4 + CD44 + CD62L -) populationer. Sortering er en af de mest pålidelige måder at forhindre forurening af effektor Th delmængder, som også findes i milten og lymfeknuder. Treg kontaminering under differentieringen kan resultere i undertrykkelse af aktivering samt cytokinproduktion. Forurening af andre effektor Th delmængder kan resultere iproduktionen af cytokiner, der er hæmmende for udvikling af ønskede Th afstamninger. Sorteringsanlæg gebyrer kan være dyrt, og nogle synes, at det er lettere at berige for CD4 + T-celler ved magnetisk separation til at skære ned på sortering tid som beskrevet i denne protokol. I mangel af et sorteringsanlæg, nogle virksomheder tilbyder nu adskillelse kits designet specielt til isolering af naive CD4 + T-celler. Imidlertid bør renheden af befolkningen altid kontrolleres efter separation, svarende til sorterede prøver. Fundet af en lav frekvens af naive CD4 + T-celler (CD62L +) i sammenligning med hukommelsen / effektorceller (CD44 -) kan indikere et problem med musen, såsom en infektion eller tumor. I dette tilfælde bør ikke anvendes af cellerne i denne type forsøg.
Der er en hel del måder at bestemme effektiviteten af Th differentiering. Protein analyse traditionelt udføres af cytokin pletmaterialer, som vil give en idé om procentdelen af naive celler, der er blevet polariseret til en specifik afstamning (figur 3). Protein kvantificering med ELISA er også et nyttigt redskab til at bestemme den totale mængde af cytokiner frigives i medierne. Det forbehold med ELISA proteinanalyse er dog, at sammenligne resultater mellem eksperimentelle grupper kan være vanskeligt, hvis en bestemt faktor, der testes har indflydelse på spredning og overlevelse. I dette tilfælde kan det samlede antal celler, der producerer cytokiner være forskellig mellem grupperne ved slutningen af eksperimentet. Således normalisere celletælling og igen at stimulere i en kort periode (f.eks anti-CD3 i 24 timer) er nødvendig for at opnå passende resultater. Desuden er IL-4 anvendes som en polariserende faktor for genereringen af Th2 delmængde, så disse celler skal vaskes, normaliseret og restimuleret før udførelse af en ELISA for IL-4. Genekspressionsanalyse ved real time PCR er ikke kun nyttig feller analyse af cytokingen transkription, men også for slægt-specifikke transkriptionsfaktorer (figur 3). Således, afhængig af eksperimentet, er der forskellige måder at analysere effektiviteten af Th differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af Reynolds lab på Rosalind Franklin University of Medicine and Science samt Chen Dong lab ved University of Texas MD Anderson Cancer Center for optimering af denne protokol. Dette arbejde blev støttet af en bevilling til JMR fra National Institutes of Health (K22AI104941).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
