Introduction
El concepto de linajes o subconjuntos de CD4 + T helper distintas células (Th) ha estado presente desde la última parte del siglo 20 1. El reconocimiento de antígeno afín en presencia de señales coestimuladoras resultados en varias rondas de proliferación celular y la eventual diferenciación en células Th efectoras. El tipo de célula Th generado durante este proceso es dependiente del entorno de citoquinas presentes durante la activación 2. Inicialmente, se creía que las células Th ingenuas para polarizar en 2 linajes distintos siguientes receptor de células T (TCR) de activación, la ligadura de CD28 coestimuladora, y la señalización de citoquinas. Tipo 1 de células helper (Th1) se caracterizan por su producción efector de la citocina IFN así como su requisito para la señalización de IL-12 durante el proceso de diferenciación 3,4. Finalmente se descubrió que las células Th1 diferenciadas tienen un perfil genético que se caracteriza más claramente by la expresión del factor de transcripción de la familia caja T, TBX21 (T-bet), que se considera el regulador maestro del programa genético Th1 5. Además, IL-12, así como IFN puede promover la expresión de T-bet 6,7. En la respuesta inmune, las células Th1 son importantes para la defensa del huésped contra patógenos intracelulares, así como promotores fuertes de la inflamación autoinmune. En contraste, las células helper de tipo 2 (Th2) requieren IL-4 para su desarrollo y sus citocinas efectoras, incluyendo IL-4, IL-5 e IL-13, son importantes para la conducción de las respuestas de células B y son patógenos en la alergia 8, 9. De manera similar a las células Th1, se encontró que las células Th2 para expresar su propio regulador transcripcional principal, denominado GATA-3 10,11. Curiosamente, la presencia de citocinas polarizantes y la generación de un linaje Th específicas son antagónicos al desarrollo de otros 2,12, lo que sugiere que sólo un subconjunto Th particular puede llegar a ser dominante durante una re inmunerespuesta.
Desde la identificación de los linajes Th1 y Th2, un trabajo adicional ha demostrado aún más único subconjuntos de células T auxiliares, incluyendo folicular helper (TFH), IL-9-producción (Th9), e IL-22 de producción de (Th22) (recientemente revisado en 13). Para los propósitos de los experimentos in vitro de diferenciación, este protocolo se centrará solamente en dos subconjuntos de Th adicionales, denominados células T reguladoras (Treg) y células T CD4 + de IL-17 de producción de (Th17). Las células T reguladoras CD25 + pueden ocurrir naturalmente (nTreg) en el timo; células Th naïve también pueden ser inducidas (iTreg) para convertirse en regulador en la periferia (revisado en 14,15). Ambos tipos de células T reguladoras expresan un factor de transcripción característico, denominado caja forkhead P3 (Foxp3), que es crítica para sus mecanismos de supresión efectoras que incluyen la producción soluble anti-inflamatoria mediador, IL-2 el consumo, y la célula de mecanismos dependientes del contacto 14,15. La falta de FOXP3 resultados de la expresión de un trastorno autoinmune multiorgánico grave denominan desregulación inmune, poliendocrinopatía, enteropatía, síndrome ligado al cromosoma X (IPEX), lo que demuestra el papel fundamental de este subconjunto Th en la resolución de la inflamación y la regulación de la tolerancia periférica a la libre antígenos 16. In vitro, las células T auxiliares CD4 + vírgenes hasta de regular Foxp3 y se convierten comprometido con el programa Treg a la estimulación con IL-2 y TGF-β 14,15. Puede haber moderado a considerable plasticidad en linajes de células T CD4 +, especialmente cuando se considera solamente la producción de citoquinas (revisado en 17,18). Sin embargo, a los efectos de protocolos de diferenciación in vitro, vamos a discutir cada subconjunto como un linaje único.
Recientemente, un subconjunto de células Th17 que produce la citoquina IL-17 se identificó como un linaje único con funciones de pro-inflamatorias que son particularmente patógena durante la inflamación autoinmune 19-21. Células Th17 expresan un factor de transcripción único, denominado relacionados retinoide-receptor gamma huérfano t (RORγt) que coordina el programa genético Th17 22. TGF es importante para la generación de Th17 linaje a través de la inducción de RORγt. Sin embargo, se cree que el efecto de la señalización de TGF sólo para inducir el compromiso Th17 en sinergia con IL-6 (revisado en 12). Otros estudios han demostrado que una variedad de otras señales que pueden regular positivamente el compromiso Th17, incluyendo IL-1β, el aumento de sodio, y TLR de señalización 23-26. Otros informes han sugerido que las células Th17 patógenos in vivo son los que realmente omiten la señalización de TGF y en su lugar se basan en una combinación de IL-1, IL-6 e IL-23 para su diferenciación 27. Así, las células Th17 se pueden derivar de una variedad de vías de señalización; para los fines de este protocolo, que se utiliza comúnmente el (TGF e IL-6) y la vía de Th17 linaje compromisoserá presentado.
Los protocolos de diferenciación se describen a continuación para todos los linajes efectoras se basa en anticuerpo fija como estímulos para la TCR y CD28 a lo largo de todo el curso del experimento. Sin embargo, otros han demostrado que la activación del TCR con células presentadoras de antígeno 28 o entrecruzamiento de anticuerpos anti-CD28 con el anticuerpo de hámster anti-CD3 y durante 2 días 29 también son medio muy eficaz para inducir la generación de diversos subgrupos Th. El protocolo que aquí se presenta se basa en métodos reportados previamente para el aislamiento de células T CD4 + murinas de los órganos linfoides secundarios 30 y la generación de células Th17 31. Una diferencia importante es que este protocolo se basa en el uso de un clasificador de células para aislar células T CD4 + vírgenes de los tejidos linfoides. Sin embargo, muchas compañías ahora ofrecen kits de separación rápidos que pueden enriquecer las células T naïve CD4 +, que puede ser capaz de pasar por alto el requisito fo clasificación dependiendo del experimento. Los métodos y reactivos que se presentan en este protocolo son lo que habitualmente utilizamos y encontramos a ser el más eficaz. Sin embargo, tenga en cuenta que existen reactivos y metodologías alternativas para muchos de los pasos que se presentan a continuación y le corresponde al laboratorio individual para determinar lo que funciona mejor para sus propósitos.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales se realizaron utilizando los protocolos aprobados por la Oficina de Salud y Seguridad Ambiental de la Universidad Rosalind Franklin de Medicina y Ciencia. C57BL / 6 ratones (adquirida de NCI) que se utiliza para este protocolo fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos, y todos los experimentos con animales se realizaron usando protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en la Universidad Rosalind Franklin de Medicina y Ciencia.
1. Preparación del instrumental, insumos y reactivos
- Coat de 48 pocillos o placas de 24 pocillos con anti-CD3 y anti-CD28 (Tabla 1) en PBS estéril, cubierta y envolver en parafina para prevenir la evaporación y la contaminación, y luego se incuban O / N a 4 ° C el día antes T aislamiento de células. Alternativamente, los pozos de la capa 1 h a 37 ° C. Realice condiciones Th0, Th1, Th2, y iTreg mediante el recubrimiento de tanto anti-CD3 y anti-CD28 de 1 g / ml en 0,5-1 ml devolumen tal (placa de 48 pocillos). Para Th17, típicamente la capa anti-CD3 a 2 g / ml y anti-CD28 a 1 mg / ml.
NOTA: Hemos encontrado que una concentración más baja anti-CD3 es óptima para la generación de Th1, Th2, y iTreg mientras que una concentración de anti-CD3 más alta es óptima para la generación de Th17. Por lo tanto, las concentraciones de anti-CD28 y anti-CD3 se deben titular y optimizados para los laboratorios individuales (tabla 2). - Esterilizar un conjunto de herramientas de disección (tijeras y fórceps) por solución autoclave o desinfectante. Se necesitarán un tubo o vaso de precipitados pequeño que contiene 70% de etanol para la esterilización rápida de herramientas entre las disecciones. Finalmente, se necesitará una botella de spray que contiene 70% de etanol para la esterilización de la superficie del ratón antes de la disección.
- Preparar una superficie disección envolviendo una pieza plana de espuma de poliestireno o corcho en papel de aluminio. Alfileres o agujas de disección se utilizan para fijar el animal en su lugar.
- Preparar platos o placas para la recogida de tiT EMAS. Si los tejidos de fondo común, de 60 mm platos separados que contienen 3 ml de PBS estéril + 1% FBS (PBS +) para los tejidos del bazo y de los ganglios linfáticos es suficiente. Si de mantenimiento de los tejidos de ratones individuales se separan, preparar un 1 ml placa de 24 pocillos que contiene de PBS + en el número deseado de pozos.
- Preparar medio RPMI completo para el cultivo celular y pre-calentamiento antes de su uso (Tabla 1).
NOTA: rutinariamente Utilizamos RPMI pero otros medios como IMDM y DMEM puede ser igualmente efectivo o superior dependiendo del laboratorio y el experimento. - Cut 2x2 cm cuadrados de malla de nylon con un tamaño de poro de 120 micras y autoclave para esterilizar (Tabla 1).
- Opcional: si se utiliza la célula magnética de alta velocidad del sistema de clasificación como autoMACS para el enriquecimiento de células CD4 +, en ejecución de pre-calentamiento y enjuague buffers en un baño de agua a 37 ° para evitar daños a la máquina.
- NOTA: Se recomienda Enriquecimiento para aumentar el rendimiento de clasificación y reducir el tiempo de clasificación.
- Todospasos de preparación, excepto para la disección, deben realizarse en una campana de cultivo de tejido estéril.
2. Aislamiento de los ganglios linfáticos y el bazo de los ratones
- La eutanasia el número requerido de animales utilizando una técnica aprobado institucionalmente. Utilice C57BL / 6 ratones hembra, edad 5-10 semanas, debido a su alto porcentaje de células T vírgenes y menor grasa corporal en comparación con los hombres o con los ratones de más edad.
NOTA: Las células derivadas de ratones machos llevará a cabo de manera similar in vitro y los pasos del protocolo siendo el mismo. Los ratones hembra, 5-10 semanas de edad, normalmente producirán 6.3 x 10 6 ingenuos células T CD4 + por ratón. Sin embargo, utilizando diferentes cepas de ratones pueden afectar el rendimiento y el rendimiento. Por ejemplo, las células de ratones C57BL / 6 son mejores para la generación de células Th1, mientras que las células de ratones Balb.c son mejores para la generación de células Th2. - Difundir las extremidades del animal y el pin en su lugar como se muestra en la Figura 1. Cortar la piel a largoitudinally desde el ano hasta la barbilla con cuidado de no perforar el tejido más profundo.
- Spread abrir la piel con pinzas y el pin de la piel en el lugar para permitir el fácil acceso a los ganglios linfáticos, como se muestra en la Figura 1.
- Cosecha de los ganglios linfáticos accesibles desde los lugares mostrados en la Figura 1. Agarrando el ganglio linfático con un par de fórceps mientras se separa el tejido con otro par de pinzas permita la eliminación fácil. Coloque el tejido en el plato de colección.
- Cosechar el bazo de la ubicación que se muestra en la Figura 1. En este caso, se necesita cuidado de corte en el peritoneo para obtener acceso al bazo. Coloque el tejido en un plato de colección.
- Repita el procedimiento si se cosecharán más tejidos. De lo contrario, continúe con los pasos siguientes. En este punto, realizar todos los pasos restantes en hielo hasta el forro de las células T después de la clasificación.
3. Procesamiento de tejidos y células CD4 + Enriquecimiento
- Procesar los ganglios linfáticos y el bazo en diferentes platos para aumentar el rendimiento como preparaciones de células de ganglios linfáticos no requieren lisis de los eritrocitos, lo que puede resultar en la muerte de leucocitos menor. Por lo tanto, los pasos siguientes describen un método para procesar las poblaciones de bazo y de ganglios linfáticos, seguida por separado mediante la combinación de antes del marcaje para la clasificación.
- Retire el tejido (bazo o ganglios linfáticos agrupados) desde el plato de recogida y colocar en una nueva placa de 60 mm que contiene 3 ml de PBS +. Coloque una escuadra de nylon estéril malla sobre el tejido usando pinzas esterilizadas.
- Tome el lado del pulgar de un émbolo de la jeringa (3-10 ml) y aplastar suavemente el tejido contra la malla. Casi todo el tejido debe entrar en suspensión. Como alternativa, coloque el tejido entre dos diapositivas esmerilado autoclave y molido en suspensión.
- Pipetear la suspensión arriba y abajo varias veces para disolver los grumos solubles restantes. Coloque un nuevo pedazo cuadrado de malla de nylon sobre la apertura de un15 ml tubo cónico y filtrar la suspensión a través de eliminar los escombros restantes.
- Repita los pasos 2-4 para los ganglios linfáticos adicionales y tejido esplénico.
- Una vez que la suspensión se ha filtrado en un tubo de 15 ml llenar el resto del tubo con PBS + e invertir varias veces. Centrifugar las células a 475 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Para las células esplénicas, aspirar el sobrenadante después de la centrifugación y resuspender el sedimento celular en 1 ml de solución de ACK 1X enfriado con hielo por bazo durante 1 min para lisar los eritrocitos. A continuación, añadir 10 ml de PBS + en la parte superior de la ACK, invierta el tubo y centrifugar 475 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Para las células de los ganglios linfáticos, aspirar el sobrenadante y resuspender en 2 ml de PBS +. Si se desea, estos se pueden combinar con las células esplénicas después de su lisis ACK y etapa de lavado.
- Aspirar el sobrenadante después de la centrifugación de los esplenocitos y resuspender en otros 10 ml de PBS +. En este punto, la suspensión de los ganglios linfáticos puede ser unadded en la parte superior de la suspensión bazo si se requiere la puesta en común de tejido para la clasificación. Centrifugar el tubo de nuevo a 475 xg durante 5 min a 4 ° C.
- El sedimento de células se puede ahora preparados para el enriquecimiento de CD4. Si no se realiza este paso, continúe con los pasos de preparación de clasificación.
- Para el enriquecimiento de CD4 utilizando el sistema de clasificación celular magnética de alta velocidad, resuspender el sedimento celular con perlas de CD4. Típicamente 15 l de perlas diluidas en 85 l de PBS + se utiliza para etiquetar los tejidos a partir del 1 de ratón. Eleva el volumen de la mezcla de grano, según sea necesario, volver a suspender el sedimento, y se incuba durante 15-30 minutos a 4 ° C.
- Lavar las células con 10 ml de PBS +, pasar la suspensión a través de nylon en un nuevo tubo de 15 ml para eliminar los desechos, y se centrifuga de nuevo a 475 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender el precipitado en 100 l de PBS + por ratón y proceder a la selección positiva en el sistema de clasificación celular magnética de alta velocidad. Si se utiliza un sistema de separación manual, figa las instrucciones del fabricante para el enriquecimiento. Alternativamente, resuspender las muestras en tampón FACS: PBS con 1 mM EDTA (pH = 8) y 1% de BSA, esterilizada por filtración.
- Retire la fracción positiva y lavar de nuevo con 10 ml de PBS +. La fracción de células CD4 + enriquecido ya está listo para ser etiquetado para la clasificación.
4. Las células T CD4 + Clasificación Naïve
- Etiquetar el sedimento celular con PBS + anticuerpos fluorescentes contienen dirigidos contra CD62L, CD44, CD25 y CD4. Si el uso de los anticuerpos listados en la Tabla 1, se proporcionan diluciones para cada uno. Para la tinción, un volumen de 100 l de la mezcla de anticuerpos se utiliza por los tejidos de un ratón.
- Resuspender el precipitado en cóctel de anticuerpos y se incuba durante 15-30 min a 4 ° C en la oscuridad.
- Lavar las células con 10 ml de PBS y centrifugar + 475 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Pase la mezcla sobre otro filtro de nylon o filtro celular tapa para volvermover cualquier residuo sobrante. Pipetear las células marcadas en un tubo que es compatible para el clasificador de células. Mantener las células en hielo y protegido de la luz hasta el estilo.
- Preparar tubos de recogida de pipeteando 1-2 ml de medio RPMI completo o FBS en el fondo de los tubos compatibles para la recolección sobre un clasificador de células.
- Ordenar las células T CD4 + vírgenes como CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - población (Figura 2). Se lavan las células recogidas con medio RPMI completo y se centrifuga como se describe anteriormente.
- Resuspender el precipitado en RPMI completo, contar las células de los animales, y ajustar la concentración de 1 x 10 6 células / ml.
5. Configuración de la diferenciación in vitro
- Aspirar los pocillos de las placas recubiertas de anti-CD3 y anti-CD28 y lavar cada pocillo con 1 ml de PBS estéril (sin FBS). Para placas de 48 pocillos, placa 0,5 x 10 6 células / pocillo en 0,5 ml de RPMI. Para placas de 24 pocillos, cultura 1 x 10 6 células / pocillo en 1,0 ml de RPMI.
- Si probar la influencia de un factor tal como un fármaco añadir la sustancia a los pocillos apropiados, ya sea antes, durante o después del proceso de diferenciación dependiendo del experimento. A continuación, complementar los medios de cultivo con citoquinas y anticuerpos bloqueantes en consecuencia. Th0: 30 U / ml de hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml de hIL-2, y 5,000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml de hIL-2, 2000 ng / ml soluble 37,51, y 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml de hIL-2, 5,000 ng XMG1.2 / ml, y 5,000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5000 ng XMG1.2 / ml, y 5,000 ng / ml 11B11.
NOTA: Las condiciones presentadas anteriormente resultaron ser óptima para maximizar la producción de citoquinas como se mide al final del experimento diferenciación (sección de resultados representativos). Sin embargo, cada condición debe ser optimizado para los laboratorios individuales (Tabla 2 - Incubar la placa a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 4-5 d antes del análisis de la expresión génica y la producción de citoquinas. Alternativamente, retirar las células de los estímulos de TCR después de 2 d, se ajustó a 1 x 10 6 células / ml con medio fresco, y la placa en nuevos pozos (no recubierto) para aumentar la proliferación y el rendimiento final. En este caso, no son necesarias las citoquinas polarización frescas y anticuerpos pero deben añadirse 10 U / ml de IL-2 a los nuevos medios de Th0, Th1, Th2 y culturas iTreg.
6. Análisis de Diferenciación
- Para el análisis de citoquinas por citometría de flujo, reestimular cada pocillo con 10 ng / ml de PMA y 1,000 ng / ml ionomicina o Tabla / ml anti-CD3 durante 4-6 horas en presencia de un inhibidor de golgi como brefeldin A (1 g1). Realizar tinción intracelular de citoquinas dependiendo del experimento (Figura 3).
NOTA: Mancha no específicos de linaje citoquinas o factores de transcripción, tales como IL-4 (no mostrado) y IFN (Figura 3) de los cultivos Th17, para cada condición como controles negativos y como indicador de la eficiencia de diferenciación. Además, Foxp3 mancha para cultivos Th17 como el desarrollo recíproco de Tregs puede ocurrir con la adición de TGF. - Para la cuantificación de proteína, recoger los sobrenadantes de cada pocillo de ensayo y por citoquina ELISA específico (Figura 3). Si existe la preocupación de que el factor está probando ha influido en la proliferación en comparación con las muestras de control, las células se pueden lavar, se contaron, normalizada, y luego volvieron a estimular con 1 g / ml de anti-CD3 para 24 h antes de recoger los sobrenadantes para los ensayos de ELISA. Si el ensayo de IL-4 de Th2 es necesario condiciones, lavado y volviendo a estimular para eliminar IL-4 que puede ser leftover del cultivo inicial diferenciación.
- Para el análisis de la expresión génica mediante PCR en tiempo real, las células de la cosecha después de que el período de incubación, se lavan, se normalizan, y re-estimulan durante 2-6 horas con 1 g / ml de anti-CD3 antes de la recolección de ARNm (Figura 3).
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Representative Results
El punto de tiempo para el análisis de la diferenciación puede variar dependiendo de la condición Th está probando así como la fuerza de la activación del receptor de células T. Después de 2-3 días de diferenciación, las células pueden ser visualizadas por microscopía de luz para determinar el grado de proliferación de células T. Wells expositoras extensa proliferación y de agrupación de células más probable es estar listo para el análisis en el día 4. Condiciones de diferenciación que dependen de la adición de IL-2 exógena, como Th1 y Th2, es probable que agotar los medios de comunicación después de 4 días de cultivo. Para maximizar la producción de citoquinas, tales pozos con medios agotada puede ser repuesta con RPMI fresco que contenía IL-2 o contaron y se re-sembraron a 1 x 10 6 células por pocillo en RPMI fresco que contenía IL-2 para extender la diferenciación para otro día o dos usando este método.
Figure 1. Ilustración de la colocación de los clavos para fijar un ratón para el aislamiento de bazo y los ganglios linfáticos. (A) Difundir las extremidades aparte y fijarlos con una aguja estéril o pin disección. Desde esta posición, cortar la piel y la piel longitudinalmente desde la cola a la barbilla. (B) Después de cortar, suavemente difundir la piel aparte para exponer los ganglios linfáticos, como se muestra en la imagen. Las ubicaciones de los ganglios linfáticos que son fácilmente accesibles desde esta posición se enumeran en el cuadro. El bazo se encuentra justo debajo de la caja torácica en el lado derecho del animal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Representante estrategia de clasificación para el aislamiento de CD4 + naïve Células T por clasificación de células. A partir de la parte superior izquierda, los linfocitos se gated primero por tamaño y luego las células son discriminadas singlete a partir de células doblete. Gating en singletes revela una población de células que son nTregs CD4 + CD25 +. Puerta en el CD4 + CD25 - población y luego ordenar ingenuo (CD62L + CD44 -) desde el efector / memoria (CD62L - CD44 +) las células CD4 +. Las líneas de puntos indican el origen puerta de la siguiente trama. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Datos de la muestra in vitro siguiente Th diferenciación. (A) Intracdatos de tinción de citoquinas ellular (cerradas en CD4 +) de Th1, Th2, iTreg, y diferenciaciones Th17. Típicamente, las citoquinas específicas no linaje, tales como IL-4 y IFN para cultivos Th17, deben teñirse para determinar la calidad de la diferenciación. De datos (B) de ELISA siguiente 4 d Th diferenciación, lavado, y 24 h reestimulación de células con anti-CD3. (C) en tiempo real los datos de PCR 1 mg / ml de factores de transcripción específicos de linaje siguientes 4 d diferenciación y la reestimulación durante 4 h con 1 mg / ml anti-CD3. Todas las cantidades de genes se normalizaron a la expresión de β-actina y ARNm de las células T vírgenes indiferenciadas sirven como línea de base para la expresión génica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Ver Tabla de Materiales a continuación.
| Reactivo | Rango recomendado Titulación |
| Las citoquinas: | |
| Human (h) IL-2 | 5 U / ml - 50 U / ml |
| rmIL-4 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-6 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-12 | 10 ng / ml - 30 ng / ml |
| hTGFb (Th17) | 0,1 ng / ml - 5 ng / ml |
| hTGFb (iTreg) | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| Anticuerpos: | |
| 2C11 (anti-CD3) | 500 ng / ml - 5000 ng / ml |
| 37,51 (anti-CD28) | 250 ng / ml - 2500 ng / ml |
| 11B11 (anti-IL-4) | 5000 - 10.000 ng / ml |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | 5000 - 10.000 ng / ml |
Tabla 2. Recomendaciones Range Titulación para la Optimización de la diferenciación Condiciones.
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Discussion
Mientras que el bazo contiene células Th ingenuo, la proporción de esta población en los ganglios linfáticos es mucho mayor. No identificar correctamente y extirpar los ganglios linfáticos en este protocolo se traducirá en un pobre rendimiento de células ingenuas. Esto puede ser especialmente difícil en ratones más viejos o los ratones machos que tienen más tejido adiposo. Como se muestra en la Figura 1, la fijación adecuada y la fijación de las extremidades y la piel de animales permitirá más fácil la visualización de los ganglios linfáticos exteriores accesibles. Una vez que se procesan ganglios linfáticos y el bazo, la clasificación de células es el método preferido de obtención de una población naïve altamente purificada de células T CD4 +. La pureza es fundamental para prevenir nTregs o efectoras y de memoria Th células de influir en el proceso de diferenciación de las células naïve. Las dificultades para obtener un alto rendimiento de células T vírgenes son causadas por la recogida de tejidos ineficiente y el procesamiento o la pérdida de células durante las etapas de separación. Para aumentar el rendimiento de maquillaje sUre para procesar las células usando tampones fríos y las incubaciones en hielo. Además, para evitar la pérdida de células durante el enriquecimiento y / o clasificación, la optimización de los reactivos y protocolos de separación de antemano se recomienda. Por último, como se ha mencionado en varios puntos de los pasos del protocolo, condiciones de diferenciación deben ser optimizados para los laboratorios individuales antes de realizar experimentos a gran escala (Tabla 2).
Como se muestra en la Figura 2, las células T CD4 + vírgenes se pueden fácilmente ser distinguidos de la nTreg (CD4 + CD25 +) y el efector (CD4 + CD44 + CD62L -) poblaciones. La clasificación es una de las formas más fiables para prevenir la contaminación de efector Th subconjuntos, que también existen en el bazo y los ganglios. Contaminación Treg durante la diferenciación puede resultar en la supresión de la activación, así como la producción de citoquinas. La contaminación de otro efector Th subconjuntos pueden resultar enla producción de citoquinas que son inhibitorios para el desarrollo de los linajes Th deseados. Clasificación instalación de las tasas pueden ser costosos y algunos consideran que es más fácil para enriquecer en células T CD4 + por separación magnética para reducir el tiempo de clasificación, como se describe en este protocolo. En ausencia de un clasificador, algunas empresas ofrecen ahora kits de separación diseñados específicamente para el aislamiento de células T CD4 + vírgenes. Sin embargo, la pureza de la población siempre se debe revisar después de la separación, similar a las muestras clasificadas. El hallazgo de una baja frecuencia de ingenuo células T CD4 + (CD62L +) en comparación con las células de memoria / efectoras (CD44 -) puede indicar un problema con el ratón, como una infección o un tumor. En este caso las células no deben ser utilizados para este tipo de experimento.
Hay bastantes maneras de determinar la eficacia de Th diferenciación. El análisis de proteínas se realiza tradicionalmente mediante tinción de citoquinasing, que dará una idea del porcentaje de células de los animales que se han polarizado a un linaje específico (Figura 3). Proteína cuantificación por ELISA es también una herramienta útil para determinar la cantidad total de citocinas que se liberan en los medios de comunicación. La advertencia con el análisis de proteínas ELISA es sin embargo que comparar los resultados entre los grupos experimentales pueden ser difíciles si un factor particular que está siendo probado tiene una influencia en la proliferación y la supervivencia. En este caso, el número total de células productoras de citoquinas pueden ser diferentes entre los grupos al final del experimento. Por lo tanto, la normalización de el recuento de células y volviendo a estimular durante un corto período de tiempo (por ejemplo, anti-CD3 durante 24 h) es necesario para obtener resultados adecuados. Además, la IL-4 se utiliza como un factor de polarización para la generación del subconjunto Th2, por lo que estas células debe ser lavado, normalizada, y volvieron a estimular antes de realizar un ELISA para IL-4. Análisis de expresión génica mediante PCR en tiempo real es útil no sólo fo el análisis de la transcripción de genes de citoquinas, sino también para factores de transcripción específicos de linaje (Figura 3). Por lo tanto, dependiendo del experimento, hay varias maneras para ensayar la eficacia de Th diferenciación.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a todos los miembros del laboratorio de Reynolds en Rosalind Franklin de la Universidad de Medicina y Ciencia, y el laboratorio de Chen Dong de la Universidad del Centro Oncológico MD Anderson de Texas para la optimización de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por una beca para JMR de los Institutos Nacionales de la Salud (K22AI104941).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
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