Introduction
farklı soy veya CD4 + T helper altkümelerinden kavramı (Th) hücreleri 20. yüzyılın ikinci yarısında 1 beri civarında olmuştur. Hücre çoğalması ve efektör Th hücreleri içinde nihai farklılaşmasının birkaç tur birlikte uyaran sinyallerin sonuçlar mevcudiyetinde aynı kökenli antijenin tanınması. Bu işlem sırasında oluşan Th hücre tipi aktivasyonu 2 sırasında, bu sitokin ortama bağlıdır. Başlangıçta, naif Th hücreleri T hücre reseptörü (TCR) aktivasyonu, birlikte uyaran CD28 ligasyonu ve sitokin sinyalizasyon aşağıdaki 2 farklı soy içine polarize düşünüldü. Tip 1 yardımcı hücreleri (TH1) olan IFNy sitokin, bunların etki edici üretiminin yanı sıra farklılaştırma işlemi 3,4; IL-12 sinyalleme duyulan gereksinimi ile karakterize edilir. Sonunda farklılaşmış Th1 hücreleri en belirgin b karakterize bir genetik profile sahip olduğu keşfedildiy Th1 genetik programın 5 ana regülatörü olarak kabul edilir T kutusu aile transkripsiyon faktörü ifadesi, Tbx21 (T-bahis). Bundan başka, IL-12, hem IFNy gibi T bahis ifade 6,7 teşvik edebilir. Immün yanıt olarak, Th1 hücreleri, hücre içi patojenler hem de oto-bağışıklık iltihap kuvvetli promotörler karşı konakçı savunması için önemlidir. Bunun aksine, tip 2 yardımcı hücreleri (Th2) kendi gelişimi için IL-4 ve IL-4, IL-5 de dahil olmak üzere, bunların etki edici sitokinler ve IL-13 gerektiren, B hücre yanıtları tahrik etmek için önemlidir ve alerji 8-patojen, 9. Th1 hücrelerinin benzer, Th2 hücreleri kendi ana transkripsiyonel regülatör ifade etmek bulundu, GATA'nın-3 10,11 olarak adlandırılan. İlginçtir, polarize sitokinlerin varlığı ve belirli bir Th soyun nesil sadece belirli bir alt kümesi Th bir bağışıklık yeniden sırasında baskın hale gelebilir düşündüren, başkalarının 2,12 gelişimine antagonistiktiryanıtlarının yokluğu.
Th1 ve Th2 soylarının belirlenmesi için, daha fazla çalışma son folikül yardımcı (TFH), (Th9), IL-9-üreten ve IL-22 üreten (Th22) dahil (T yardımcı hücrelerinin daha bile eşsiz bir alt küme, gösterdi ), 13 gözden. In vitro olarak farklılaşma deneylerin amaçları doğrultusunda, bu protokol regülatör T hücreleri (regülatör) ve IL-17 üreten CD4 + T hücreleri (Th17) olarak adlandırılan, yalnızca iki ek Th alt kümelerini odaklanacaktır. CD25 + regülatör T hücrelerinin timüsteki doğal (nTreg) oluşabilir; naif Th hücreleri de (14,15 gözden) çevre düzenleyici olmak üzere (iTreg) bağlı olabilir. Tregs Her iki tür karakteristik transkripsiyon faktörü, çözünür anti-inflamatuar aracıların üretimini, IL-2, tüketimi ve hücre temas yoluyla mekanizmaları 14,15 içerir, bunların etki edici bastırma mekanizmaları için kritik öneme sahiptir forkhead kutu P3 (Foxp3) olarak adlandırılan ifade eder. FoxP eksikliğiCiddi, çoklu organ otoimün bozukluğunun 3 ekspresyonu, bağışıklık düzensizliği, poliendokrinopati, enteropati olarak adlandırılan, enflamasyon çözme ve kendi çevresel tolerans düzenlemede, bu Th alt-grubun önemli bir rol gösteren X-bağlantılı sendromu (IPEX), 16 antijenleri. İn vitro olarak, saf CD4 + T yardımcı hücreleri, Foxp3 yukarı doğru regüle ve IL-2 ve 14,15, TGF-β uyarılan regülatör programına kararlı hale gelir. (17,18 gözden) sadece sitokin üretimini göz önüne alındığında, özellikle CD4 + T hücre soyları içinde önemli bir plastisite orta olabilir. Ancak, in vitro farklılaşma protokolleri amacıyla, benzersiz bir soy olarak her alt kümesi görüşecekler.
Son zamanlarda, IL-17 sitokin üreten, Th17 hücrelerinin bir alt kümesi, otoimmün iltihabı 19-21 sırasında özellikle patojenik pro-iltihap fonksiyonları ile benzersiz bir soy olarak tanımlanmıştır. Th17 hücreleri benzersiz bir transkripsiyon faktörü ifade, Th17 genetik programı 22 koordinatları olarak adlandırılan retinoid ilgili yetim reseptör gama t (RORγt). TGFβ RORγt indüksiyonu ile Th17 soyunun üretimi için önemlidir. Ancak, TGFβ sinyal etkisi sadece (12 gözden), IL-6 ile sinerji üzerine Th17 taahhüdünü neden olduğuna inanılmaktadır. Daha ileri çalışmalar için diğer pozitif IL-1β de dahil olmak üzere, Th17 kararlılığını düzenleyen sinyallerin, artan sodyum ve TLR çeşitli 23-26 sinyal olduğunu göstermiştir. Diğer raporlar, in vivo olarak, patojenik Th17 hücreleri aslında TGFβ sinyal bypass olanlardır ve bunun yerine farklılaşma 27, IL-1, IL-6 ve IL-23 arasında bir kombinasyonuna bağlıdır olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu nedenle, Th17 hücre sinyal yollarının çeşitli türetilebilir; Th17 soy bağlılığı için bu protokolün amaçları için, yaygın olarak kullanılan (TGFβ ve IL-6) yolusunulacaktır.
Tüm efektör soyları için aşağıda tarif edilen farklılaşma protokolleri tüm deney süresi boyunca TCR ve CD28 için uyaranı sabit antikor dayanır. Bununla birlikte, diğer göstermiştir ki antijen sunan hücreler 28 veya çapraz bağlama, anti-CD3 ve Hamster antikoru anti-CD28 antikorları, 2 gün 29 aynı zamanda çeşitli Th alt-üretilmesini indükleme son derece etkili araçlardır ile TCR aktivasyonu. Burada sunulan protokol Th17 hücreleri 31 ikincil lenfoid organlara 30 kemirgen CD4 + T hücreleri izole ve üretmek için daha önce bildirilen yöntemler üzerine inşa. Önemli bir farklılık, bu protokol, lenfoid dokulardan naif CD4 + T hücreleri izole etmek için bir hücre ayıklayıcısıyla kullanımına dayanır olmasıdır. Ancak, birçok şirket artık gereksinimi f atlamak mümkün olabilir ki, naif CD4 + T hücreleri için zenginleştirebilirsiniz hızlı ayırma kitleri teklifveya sıralama deneye bağlı olarak. yöntemler ve bu protokolde sunulan reaktifler rutin kullanımı ve en etkili bulmak ne. Ancak, alternatif reaktifler ve metodolojiler aşağıda sunulan adımları birçok mevcut olduğunu akılda tutmak ve onların amaçları için en iyi çalışacaktır belirlemek için bireysel laboratuvara kadar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler Tıp ve Bilim, Rosalind Franklin Üniversitesi Çevre Sağlığı ve Güvenliği dairesince onaylı protokolleri kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol için kullanılan (NCI satın alınmıştır), C57BL / 6 fareleri, spesifik patojenden serbest durumlar altında muhafaza edildi ve her hayvan deneyleri Tıp Rosalind Franklin Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller kullanılarak testi gerçekleştirildi ve Bilim.
Araçların, Sarf Malzemeleri, ve Reaktifler 1. Hazırlık
- Anti-CD3 ve anti-CD28 ile kaplayın 48 kuyucuklu veya 24-yuvalı plakalar (Tablo 1) steril PBS, kapak ve parafilm sarın buharlaşmayı ve kirlenmeyi önlemek için, ve daha sonra, T bir gün önce cı 4 ° C'de O / N kuluçkalanması hücre izolasyonu. 37 o C de Alternatif, kat kuyular 1 saat 0.5-1 ml 1 ug / ml anti-CD3 ve anti-CD28 hem de kaplanarak Th0 Th1, Th2 ve iTreg şartları yerinetal hacmi (48 çukurlu plaka) eritin. Th17 için, tipik haliyle kaplama, anti-CD3 1 ug / ml'de ml anti-CD28 2 ug / ml'de.
NOT: Bu daha yüksek bir anti-CD3 konsantrasyonu Th17 üretimi için en uygun süre daha düşük bir anti-CD3 konsantrasyonu, Th1, Th2 ve iTreg üretimi için uygun olduğunu bulduk. Bu nedenle, anti-CD3 ve anti-CD28 konsantrasyonları titre ve her laboratuvar (Tablo 2) için optimize edilmelidir. - Otoklav veya dezenfektan çözeltisi ile diseksiyon araçları (makas ve forseps) bir dizi sterilize. Bir tüp veya% 70 etanol içeren küçük beher disseksiyonlarında arasındaki araçların hızlı sterilizasyon için gerekli olacaktır. Son olarak,% 70 etanol ihtiva eden bir sprey şişesi diseksiyon önce fare yüzey sterilize etmek için gerekli olacaktır.
- Alüminyum folyo düz strafor parçası veya Corkboard sararak bir diseksiyon yüzey hazırlayın. Kesme veya iğne yerine hayvan sabitlemek için kullanılır.
- Ti toplanması için yemekler ya da tabak hazırlayınssues. Havuzu dokular halinde, 3 ml ihtiva eden ayrı bir 60 mm tabaklar steril PBS + dalak ve lenf düğümü dokular için FBS (PBS +) yeterlidir% 1. Tek tek farelerden tutmak dokular ayrı ise, kuyulara, arzu edilen sayıda PBS + 'nın bir 24-çukurlu plaka ihtiva eden 1 ml hazırlar.
- Kullanmadan önce, hücre kültürü ve ön sıcak için tam RPMI ortamı hazırlanması (Tablo 1).
NOT: Biz rutin RPMI kullanmak ancak IMDM'de ve DMEM gibi diğer medya eşit derecede etkilidir ya da laboratuarda deney ve bağlı üstün olabilir. - Naylon kareler sterilize etmek için bir 120 um gözenek büyüklüğü ve otoklav ile örgü Kesme 2x2 sm (Tablo 1).
- İsteğe bağlı: CD4 + hücre zenginleştirme öncesi sıcak koşma için autoMACS olarak sisteme sıralama yüksek hızlı manyetik hücre kullanarak ve makineye zarar görmesini önlemek için 37 o C su banyosunda tamponlar durulama ise.
- Not: Zenginleştirme ayırma verimi artırmak ve zaman ayırma azaltmak için tavsiye edilir.
- Tümhazırlama aşamaları, diseksiyon için hariç olmak üzere, bir steril doku kültürü kaputu yapılmalıdır.
Fareler gelen Lenf Nodu ve Dalak 2. izolasyonu
- Bir kurumsal onaylı tekniği kullanılarak hayvanların gerekli sayıda Euthanize. Olarak, erkek göre naiv T hücreleri ve alt vücut yağ yüksek oranda veya daha yaşlı farelerin C57BL / 6 dişi fareler, yaş, 5-10 hafta boyunca, kullanın.
Not: erkek farelerden elde edilen hücreler in vitro olarak benzer gerçekleştirir ve protokol safhaları aynı kalır. 5-10 hft dişi fareler, genellikle fare başına 3-6 x 10 6 naif CD4 + T hücreleri verecektir. Ancak, fareler kullanılarak çeşitli tipleri verim ve performansını etkileyebilir. Örneğin, C57BL / 6 farelerinden alınan hücreler Balb.c farelerden aldıkları hücreler kullanarak, Th2 hücrelerin üretilmesi için daha iyi ise, Th1 hücrelerinin üretilmesi için daha iyidir. - Hayvan uzuvları yaymak ve Şekil 1'de gösterildiği gibi yerde pin. Uzun cildi kesinDikkatli olmak itudinally çene anüs değilken derin doku delinme.
- Yayılması forseps ile cildi açın ve Şekil 1'de gösterildiği gibi lenf düğümlerine kolay erişim sağlamak için yerinde cilt pin.
- Şekil 1'de gösterilen yerlerden erişilebilir lenf düğümleri Hasat. Forseps bir çift ile lenf düğümü kapma forseps başka bir çift ile doku ayıran kolay çıkarılması için izin verir ise. Toplama kabındaki doku yerleştirin.
- Şekil 1 'de gösterilen konumdan dalak hasat edilir. Bu durumda, periton içine dikkatli bir kesme dalak erişmek için gereklidir. Bir toplama kabına doku yerleştirin.
- Daha fazla dokular hasat edilecektir işlemi tekrarlayın. Aksi takdirde bir sonraki adımlara geçin. Bu noktada, sıralama sonra T hücrelerinin kaplama kadar buz üzerinde kalan tüm adımları.
3. Doku İşleme ve CD4 + Zenginleştirme
- Küçük lökosit ölümle sonuçlanabilir eritrosit lizis gerekmez lenf nodu hücre preparatları olarak verimi artırmak için farklı yemekler lenf düğümleri ve dalak işleyin. Bu nedenle, aşağıdaki adımlar ayrıca sıralama için etiketleme önce araya getirilmesi, sonra dalak ve lenf düğümü popülasyonlarının işlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.
- PBS + 3 ml içeren yeni bir 60 mm çanak toplama çanak ve yerden doku (dalak veya toplanmış lenf nodları) sökün. Sterilize forseps kullanarak doku üzerinde örgü steril naylon bir kare yerleştirin.
- Bir şırınga pistonu başparmak tarafına (3-10 ml) alın ve yavaşça örgü karşı doku şut. Hemen hemen tüm doku süspansiyonu gitmek gerekir. Alternatif olarak, iki Otoklavlanmış buzlu slaytlar arasındaki doku yerleştirmek ve süspansiyon içine öğütülmüş.
- Süspansiyon yukarı Pipet ve bir kaç kez aşağı kalan çözünebilir öbekler kırmak için. Bir açılması üzerine naylon örgü yeni bir kare parça yerleştirin15 ml konik tüp ve kalan enkaz kaldırmak yoluyla süspansiyon filtre.
- Tekrar ek lenf nodu ve dalak dokusu için 2-4 adımları.
- Süspansiyon 15 ml tüp içine süzüldü sonra PBS + ile borunun kalan dolgu ve birkaç kez ters çevirin. 4 o C'de 5 dakika boyunca 475 xg'de hücreleri santrifüj
- Dalak hücreleri için, yüzer, aşağıdaki santrifüj aspire ve eritrositleri lizise uğratmak üzere, 1 dakika için dalak başına buzla soğutulmuş 1X ACK çözeltisi, 1 ml hücre pelletini. Daha sonra, ACK üstünde PBS + 10 ml ilave tüp ters ve santrifüj 475 x g 4 O ° C'de 5 dakika boyunca
- Lenf nodu hücreleri için, PBS + 2 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon aspire. Arzu edildiği takdirde, bu da ACK liziz ve yıkama aşamasından sonra, dalak hücreleri ile birleştirilebilir.
- PBS + ve bir 10 ml splenositlerin santrifüj ve tekrar süspansiyon sonra süpernatan aspire. Bu noktada, lenf nodu süspansiyon birdalak süspansiyon üstünde dded doku havuzu sıralamak için gerekli ise. 4 O ° C'de 5 dakika boyunca 475 x g hızında tekrar santrifüj tüpü
- Hücre pelet şimdi CD4 zenginleşmesi için hazırlanmış olabilir. Bu adımı gerçekleştirilmez ise, sıralama hazırlık adımlara devam edin.
- Yüksek hızlı manyetik hücre sıralama sistemini kullanarak CD4 zenginleştirme için, CD4 boncuklar ile hücresel pelletini. Tipik haliyle, PBS + 85 ul seyreltilmiş boncuk 15 ul 1 fare dokuları etiketlemek için kullanılır. Gerektiği gibi, boncuk karışımı sesini rampa pelletini ve 4 o C'de 15-30 dakika inkübe
- PBS + 10 ml hücreleri yıkayın 4 O ° C'de 5 dakika boyunca 475 x g hızında tekrar artıkları ve santrifüj çıkarmak için yeni bir 15 ml tüp içine naylondan süspansiyon geçmesi
- Fare başına PBS + 100 ul pelet yeniden süspanse edin ve yüksek hızda manyetik hücre sınıflandırma sistemi üzerinde olumlu seçim geçin. Manuel ayırma sistemi, f kullanıyorsanızzenginleştirme için üreticinin talimatlarını ollow. Seçenek olarak ise, FACS tampon çözeltisi içinde tekrar süspansiyon örnekleri PBS, 1 mM EDTA (pH = 8) ve% 1 BSA, steril olarak filtreden geçirilmiş olan.
- Pozitif kısmını çıkarın ve PBS + 10ml ile tekrar yıkayın. zenginleştirilmiş CD4 + fraksiyonu şimdi sıralamak için etiketli hazırdır.
4. Ayırma Naif CD4 + T hücreleri
- PBS CD62L, CD44, CD25, CD4 ve karşı yöneltilmiş içeren floresan antikorlar + hücre pelet etiketleyin. Tablo 1 'de listelenen antikorlar kullanılarak, her biri için seyreltme sağlanır. Boyama için, antikor kokteylinin bir 100 ul hacim, bir fare doku başına kullanılır.
- Antikor kokteyli pelletini tekrar ve karanlıkta 4 o C'de 15-30 dakika inkübe.
- 4 O ° C'de, PBS + 10 ml santrifüj 475 x g 5 dakika boyunca hücreleri yıkayın
- Yeniden başka bir naylon filtre veya hücre süzgeç kapağı üzerinde karışımı geçmekherhangi bir artık enkaz taşıyın. Hücre sıralayıcı ile uyumlu olan bir tüp içine etiketli hücreler Pipet. Buz üzerinde hücreleri tutun ve tür kadar ışıktan korunmalıdır.
- Bir hücre sıralayıcı toplama uyumlu tüplerin dibine tam RPMI ortam veya FBS 1-2ml pipetleme toplama tüpleri hazırlayın.
- Sıralama bir CD4 + CD25 gibi naif CD4 + T hücreleri - CD62L + CD44 - nüfusun (Şekil 2). Tam RPMI ortamı ile toplanan hücreler yıkanır ve yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj.
- Tam RPMI içinde pelletini saf hücrelerin sayısı ve 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonu ayarlanır.
5. in vitro Farklılaşma Kurma
- Anti-CD3 ve anti-CD28 kaplı plakalara çukurlarına aspire ve steril PBS (hiç FBS) ve 1 ml her bir yıkayın. 48 oyuklu plakalar için, RP 0.5 x 10 6 hücre / oyuk olarak 0.5 ml plakaMI. 24 oyuklu plakalar, kültür 1 x 10 6 hücre RPMI / oyuk içinde 1.0 ml.
- Bu tür bir ilaç olarak, bir faktör etkisi test sırasında ya da daha önce, uygun oyuklara madde ekleme veya deneye bağlı olarak farklılaşma sonra ise. Sonraki, buna göre sitokinler ve engelleme antikorlar ile kültür ortamı tamamlamaktadır. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2 ve 5000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2.000 ng 37,51 çözünür / ml, 5000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5.000 ng / ml XMG1.2 ve 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5000 ng / ml XMG1.2 ve 5.000 ng / ml 11B11.
Not: Yukarıda belirtilen koşullar farklılaşma deneyinde (Örnek Sonuçlar bölümü) sonunda ölçülen sitokin üretimini maksimize etmek için en uygun olduğu bulunmuştur. Ancak, her koşul her laboratuvar (Tablo 2 için optimize edilmelidir - Önceden gen ifadesi ve sitokin üretimi analizine d 4-5 için% 5 CO2 ile 37 C 'de plaka inkübe edin. Seçenek olarak ise, hücre proliferasyonunu ve son verimi artırmak için, taze ortam ile 1 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde ayarlandı, 2 gün sonra, TCR uyaranlara hücreleri çıkarmak ve yeni bir kuyu (kaplamasız) plaka. Bu durumda, taze polarize sitokinler ve antikorlar gerekli değildir, ancak, IL-2, 10 U / ml Th0, Th1, Th2 ve iTreg kültürleri için yeni ortama ilave edilmelidir.
Farklılaşma 6. Analizi
- Akış sitometrisi ile sitokin analizi için, / ml iyonomisin veya 1 ug (örneğin, bir Brefeldin bir Golgi inhibitörünün varlığında 4-6 saat süre ile, anti-CD3 / ml Tablo ng 10ng / ml PMA ve 1000 ile her bir yeniden uyarmak1). Hücre içi sitokin boyama deney bağlı (Şekil 3) gerçekleştirin.
Not: Leke olmayan soy spesifik sitokinler ya da (gösterilmemiştir), IL-4 ve IFNy gibi transkripsiyon faktörleri, negatif kontroller olarak ve farklılaşma verimliliği bir göstergesi olarak her bir durum için, Th17 kültürler için (Şekil 3). Ayrıca, Tregs karşılıklı bir gelişme olarak, Th17 kültürleri için leke Foxp3 TGFβ eklenmesi ile meydana gelebilir. - Protein ölçümü için, sitokine spesifik ELISA (Şekil 3), her bir sıra ve testte süpernatantlar toplamak. Test edilen faktör kontrol numuneleri ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunu etkilediğini endişe varsa, hücreler, yıkanabilir, normalize sayılır ve ELISA tahlilleri için süpernatanların toplanması önce 24 saat boyunca anti CD3 1 ug / ml ile yeniden uyarılan. L kadar olabilecektir, IL-4 koşulları, yıkama ve tekrar uyarılmasından gereklidir Th2'den IL-4 kaldırmak için tahlil halindeİlk türev kültüründen eftover.
- Gerçek zamanlı PCR ile gen ekspresyon analizi için hasat hücreleri kuluçka döneminden sonra, yıkama, normalize, ve anti-CD3 ve 1 ug / ml hasat mRNA önce (Şekil 3) ile 2-6 saat boyunca tekrar harekete geçirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnci durumuna bağlı olarak değişebilir farklılaşma analizi için zaman noktası T hücresi reseptör aktivasyonunun gücü gibi test edilir. Farklılaşma 2-3 gün sonra hücreler, T-hücresi çoğalması derecesini tespit etmek için ışık mikroskobu ile görselleştirilebilir. Hücrelerin çoğalmasını ve geniş topaklanma sergileyen Wells muhtemelen büyük olasılıkla kültüründe 4 gün sonra ortam tüketecektir, eksojen IL-2, örneğin, Th1 ve Th2 olarak ilave dayanarak günde 4 Farklılaşma koşullarında analiz için hazır olacaktır. Sitokin üretimini maksimize etmek için, bitkin medya ile bu tür kuyular taze RPMI IL-2 içeren doldurulan veya sayılmış ve IL-2 başka bir gün ya da iki farklılaşma uzatmak için içeren taze RPMI iyi başına 1 x 10 6 hücre yeniden kaplama olabilir Bu yöntem kullanılarak.
Figürpim yerleştirme e 1. İllüstrasyon. dalak ve lenf nodlarının izolasyonu için bir fare düzeltmek (A) dışında uzuvları yaymak ve steril bir iğne veya diseksiyon iğne ile bunları düzeltmek için. Bu pozisyondan, yavaşça, kestikten sonra (B). Çene kuyruk boyuna kürk ve deri kesme resimde gösterildiği gibi lenf düğümleri maruz ayrı cilt yayıldı. kolayca konumundan ulaşılabilir lenf düğümlerinin yerlerinin resimde listelenmiştir. Dalak, sadece hayvanın sağ tarafındaki göğüs kafesi altında yer almaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Naif CD4 izolasyonu için Şekil 2. Temsilcisi sıralama stratejisi + Hücre tarafından T hücreleri sıralama>. Sol üst başlayarak, lenfositler, ilk boyutuna göre Geçitli ve daha sonra tekli hücreler çiftli hücrelerden ayırt edilir. Tekli üzerinde Yolluk, CD4 + CD25 + nTregs olan hücrelerden oluşan bir popülasyonu ortaya koyar. Nüfus ve sonra sıralama naif (CD62L + CD44 - -) Kapısı CD4 + CD25 üzerinde efektör / hafızadan (CD62L - CD44 +) CD4 + hücreleri. Noktalı çizgiler sonraki arsa kapısı kökene işaret etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Farklılaşma Th in vitro aşağıdaki Şekil 3. Örnek veri. (A) IntracTh1, Th2, iTreg dan (CD4 + kapılanmış) ellular sitokin boyama verileri ve Th17 farklılıklar. Tipik haliyle, bu Th17 kültürlere IL-4 ve IFNy olmayan soyundan bir sitokin, farklılaşma kalitesini belirlemek için boyanmış olmalıdır. (B), ELISA verileri, farklılaşma, yıkama Th 4 gün ve hücreler 24 saat yeniden güdüleme aşağıdaki 1 ug / ml anti-CD3 ile 4 saat boyunca 4 gün farklılaşması ve yeniden güdülemeden sonraki seri spesifik transkripsiyon faktörleri 1 ug / ml anti-CD3. (C), gerçek zamanlı PCR verilerini. Farklılaşmamış naif T hücreleri gen ifadesi için temel olarak hizmet tüm gen miktarları β-aktin ve mRNA ifadesi normalize edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Aşağıdaki Tablo 1. Bkz Malzemeleri Masa.
| Reaktif | Önerilen Titrasyon Aralığı |
| Sitokinler: | |
| Insan (h), IL-2 | 5 U / ml - 50 U / ml |
| rmIL-4 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-6 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-12 | 10 ng / ml - 30 ng / ml |
| hTGFb (Th17) | 0.1 ng / ml - 5 ng / ml |
| hTGFb (iTreg) | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| Antikorlar: | |
| 2C11 (anti-CD3) | 500 ng / ml - 5000 ng / ml |
| 37,51 (anti-CD28) | 250 ng / ml - 2500 ng / ml |
| 11B11 (anti-IL-4), | 5000 - 10,000 ng / ml |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | 5000 - 10,000 ng / ml |
Tablo 2. Farklılaşma Koşullar Optimizasyonu için Titrasyon Aralığı önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dalak saf Th hücreleri içerir, lenf düğümleri, bu nüfus oranı çok daha yüksektir. Düzgün, bu protokolde lenf düğümleri tespit ve kaldırmak için Başarısızlık saf hücrelerin kötü verim neden olacaktır. Bu daha çok yağ dokusu olması yaşlı farelerin ya da erkek farelerde özellikle zor olabilir. Hayvan bacaklarda ve cilt Şekil 1, uygun bir sabitleme ve çivileme gösterildiği gibi erişilebilir dış lenf nodu kolay görselleştirme için izin verir. Lenf düğümleri ve dalak işlenir sonra hücre sıralama son derece saf bir naif CD4 + T hücre popülasyonu elde etmek için tercih edilen bir yöntemdir. Saflık Naif hücre farklılaşması sürecini etkileyen hücreleri Th nTregs veya efektör ve bellek önlemek için kritik öneme sahiptir. Saf T hücrelerinin yüksek verim elde etmek için zorluklar tipik olarak ayırma aşamaları esnasında etkisiz doku toplama ve işleme veya hücre kaybına neden olur. Verim yapmak s artırmak içinure buz soğuk tamponlar ve inkubasyon kullanarak hücreleri işlemek için. Ayrıca, önceden tavsiye edilir reaktifler ve ayırma protokolleri optimize, zenginleştirme ve / veya sıralama sırasında hücrelerin kaybını önlemek için. Protokol adımda çeşitli noktalarda belirtildiği gibi, son olarak, farklılaşma durumları, büyük ölçekli deneyler (Tablo 2), uygulamadan önce, bireysel laboratuarlar için optimize edilmelidir.
Popülasyonlarının - Şekil 2 'de gösterildiği üzere, saf CD4 + T hücrelerinin kolayca nTreg (CD4 + CD25 +) ve efektör (CD4 + CD44 + CD62L) ayırt edilebilir. Sıralama ayrıca dalak ve lenf düğümlerinde mevcut alt kümeleri Th efektör kirlenmesini önlemek için en güvenilir yollardan biridir. Farklılaşması sırasında regülatör kirlenme aktivasyonunu baskılar gibi sitokin üretimi ile sonuçlanabilir. Neden olabilir alt kümeleri Th diğer efektör kirlenmesiİstenen Th soy gelişimi engelleyici olan sitokin üretimi. Sıralama tesis ücretleri pahalı olabilir ve bazıları bu protokol açıklandığı gibi zaman sıralama kısmak için manyetik ayırma ile CD4 + T hücreleri için zenginleştirmek için daha kolay olduğunu bulmak. Sıralayıcıdan yokluğunda, bazı şirketler naif CD4 + T hücrelerinin izolasyonu için özel olarak tasarlanmış ayırma setleri sağlar. Ancak, nüfusun saflığı her zaman sıralanmış örneklere benzer ayrılık, sonra kontrol edilmelidir. Hafıza / efektör hücreleri ile karşılaştırıldığında naif CD4 + T hücreleri (CD62L +) düşük frekanslı bulgu (CD44 -) Böyle bir enfeksiyon ya da tümör gibi fare ile bir soruna işaret ediyor olabilir. Bu durumda, hücreler, deney türü için kullanılmamalıdır.
Th farklılaşma etkinliğini belirlemek için epeyce yolu vardır. Protein analizleri geleneksel sitokin leke tarafından yapılırBelirli bir soy polarize edilmiş naif hücrelerin yüzdesi bir fikir verecektir ing, (Şekil 3). ELISA ile Protein miktar da sitokin toplam tutarı ortamına serbest bırakılması belirlemek için kullanışlı bir araçtır. olsa ELISA protein analizi ile ihtar test edilen belirli bir faktör çoğalması ve sağkalım üzerine etkisi varsa deney grupları arasında karşılaştırma sonuçları zor olabilir olmasıdır. Bu durumda, sitokinleri üreten hücrelerin toplam sayısı, deneyin sonunda gruplar arasında farklı olabilir. Bu nedenle, hücre sayısını normalize ve kısa bir süre için tekrar uyarılmasından (örneğin, 24 saat süre ile, anti-CD3) uygun sonuçlar elde etmek için gereklidir. Bundan başka, IL-4 Th2 lerin oluşumu için bir polarizasyon faktörü olarak kullanılır, bu nedenle bu hücreler, normalize yıkanmalıdır ve IL-4 için bir ELISA gerçekleştirmeden önce yeniden uyarılmıştır. Gerçek zamanlı PCR ile gen ifadesi analizi f sadece yararlıdırveya sitokin gen transkripsiyonu analizi, aynı zamanda seri spesifik transkripsiyon faktörleri için (Şekil 3). Bu nedenle, deneye bağlı olarak, Th farklılaşma etkisini tahlil etmek için çeşitli yollar bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar, bu protokolün optimizasyonu için Texas MD Anderson Kanser Merkezi'nde Üniversitesi Tıp ve Bilim, Rosalind Franklin Üniversitesi Reynolds laboratuarında tüm üyelerini ve Chen Dong laboratuar teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (K22AI104941) den JMR bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
