体内成像与追踪锝-99m标记的马骨髓间充质干细胞治疗肌腱病

摘要

本方案描述了马源间充质干细胞的放射性标记及其向马肌腱损伤部位的植入，以通过伽马闪烁显像技术确定细胞存活率和组织分布情况。

摘要

近年来，骨髓间充质干细胞（BMMSC）在治疗马匹肌腱和韧带损伤中的应用取得了进展，在实验和临床研究中均显示出改善的疗效指标。尽管将大量BMMSC（通常为1000万至2000万个细胞）植入肌腱病灶，但仅有相对较少的细胞能够存活（<10%），尽管这些存活细胞可在植入后持续存在长达5个月。这一现象在其他物种中将BMMSC植入其他组织时也普遍存在，因此了解细胞丢失发生的时间、有多少细胞能够耐受初始植入过程，以及细胞是否被清除至其他器官显得尤为重要。通过在植入前对BMMSC进行放射性标记，可实现对细胞命运的追踪，从而进行细胞定位的无创体内成像以及细胞数量的定量分析。

本方案描述了一种使用锝-99m（Tc-99m）对细胞进行标记的方法，并在将这些细胞植入损伤的马屈肌腱后对其进行追踪。Tc-99m 是一种短半衰期（t_1/2 为 6.01 小时）的同位素，可发射γ射线，在脂溶性化合物六甲基丙二胺肟（HMPAO）存在的情况下可被细胞内化。这些特性使其非常适合用于核医学临床，以诊断多种不同疾病。通过γ闪烁显像，可在短期内（最长36小时）追踪标记细胞的去向，定量分析滞留在病灶中的细胞数量，以及细胞在肺、甲状腺和其他器官中的分布情况。该技术改编自血液白细胞标记方法，也可用于对其他器官中植入的骨髓间充质干细胞（BMMSC）进行成像。

引言

修复病变或受损组织的再生策略基于来源于多种组织的多能干细胞，并将其植入受损区域。近年来，自体骨髓间充质干细胞（BMMSC）在治疗马匹肌腱和韧带损伤中的应用取得了进展，在实验研究^1-5和临床研究⁶中均显示出更优的治疗效果。马是评估干细胞相关治疗疗效的理想模型，因其会自然发生与年龄和过度劳损相关的前肢远端肌腱损伤，且马属于运动型动物，体型较大，便于进行骨髓采集和精确的细胞植入。肌腱损伤在自然愈合过程中会形成纤维化组织，但愈合后的肌腱功能较差⁷，且再损伤风险较高⁸。其中最常受累的是浅支指深屈肌腱（SDFT），该肌腱在进化中被优化为弹性能量储存结构，以实现高效节能和高速运动，因而承受极高的负荷应力。因此，损伤后恢复其功能至关重要。这类损伤与人类中发挥类似功能的跟腱损伤具有相似性⁹。目前尚无有效的治疗方法可实现此类损伤的良好修复，因此基于细胞的再生治疗策略为改善疗效和降低再损伤风险提供了极具前景的途径。

在大多数研究中，将500万至2000万个自体骨髓间充质基质细胞（BMMSC）直接注射到病变部位，这些病变通常位于肌腱体的核心区域，因此该区域可作为细胞的容纳部位。细胞注射后的归宿尚不明确，近期已有多种细胞标记方法被用于追踪细胞。使用荧光标记的细胞被证实仅能以相对较少的数量（<10%）存活^10,11。荧光标记需要进行组织取材和切片以完成组织学分析，这....

方案

本文所述病例均在获得西班牙马拉加兽医协会动物伦理与福利委员会以及英国北迈姆斯皇家兽医学院伦理许可后进行。对马匹实施的操作基于已批准的临床方案，这些方案用于接受基于干细胞治疗的马匹，包括镇静、骨髓抽吸、肌腱内注射、区域灌注、静脉注射、术后治疗以及植入后的疼痛管理和监测。

1. 需提前完成的关键准备工作

1. 在开始工作前，须获得机构伦理和动物福利审批，并遵守当地的法律法规要求。
2. 根据当地法律法规，申请使用电离辐射的机构许可，包括对人员和环境的适当保护措施，以及污染废弃物的处理。
3. 采用以下纳入标准：马匹患有非创伤性过度劳损损伤（屈肌腱病或韧带病），累及前肢浅层屈指肌腱（SDFT），且病变导致肌腱内出现缺损，缺损周围由完整的肌腱和/或腱周组织包绕。
   注：此类损伤的检查与诊断，以及马匹细胞植入前的临床准备，已在其他文献中详细描述^6,15。
   注：从马骨髓中分离并体外扩增骨髓间充质干细胞（BMMSC）的方法此前已有报道^6,16。目前针对马SDFT损伤植入BMMSC的方案采用每毫升自体骨髓上清液（BMS）¹⁶含1000万个细胞⁴。
4. 用于体内植入的细胞传代次数不得超过4代，以避免高代次细胞可能出现的细胞表型或遗传特性改变。
5. 将所需数量的细胞置于BMS中（置于冷藏箱....

结果

Tc-99m-HMPAO 掺入骨髓间充质干细胞（BMMSs）后，不会对其黏附组织培养塑料的能力产生不利影响；尽管这些细胞显示出形成单层的增殖能力（图1），但我们尚未完全确定其增殖速率或其他细胞表型是否受到影响。其形态与未标记细胞相似，呈典型的梭形。细胞标记效率（即，标记物摄取率）通常在约1.5%至25%之间波动。标记效率较低的主要原因是^99mTc从Mo-99/Tc-99m发生器洗脱地点运送到临床场所的时间延迟。若延迟超过2小时，细胞标记率将显著下降。然而，细胞内掺入的同位素足以支持长达36小时的γ闪烁显像（图2）。可提高标记效率的因素详见讨论部分。

标记的细胞可通过病灶内植入¹（直接植入病灶）或经由指静脉¹或动脉¹²进行区域灌注的方式植入。当损伤位于肌腱核心且被完整的肌腱组织包围时，可采用病灶内植入，因为完整的肌腱组织可作为细胞的容纳结构。区域灌注是一种更简便的给细胞途径，因为细胞被注射入血管中，但该方法依赖于.......

讨论

除了骨髓外，从脂肪组织等来源分离的干细胞也适用于本方案的标记。此外，处于冷冻状态的细胞可复苏并在培养中扩增至标记研究所需的数量¹²。

决定BMMSC标记效率的一个关键因素是放射药房从钼发生器洗脱Tc-99m、制备Tc-99m-HMPAO以及在临床使用该放射性药物之间的时间间隔。标记效率与从发生器洗脱Tc-99m后的时间呈负相关，因此超过该时间间隔会显著降低细胞标记效率。因此，在细胞进行放射性标记并植入的当天，必须在实验室向临床运送细胞与Tc-99m送达临床之间进行密切协调。因此，运输至临床的时间是一个重要因素。供应商的数据表指出，Tc-99m在洗脱2小时后因衰变导致放射性化学纯度下降，可能干扰HMPAO与Tc-99m的结合，进而影响细胞对Tc-99m-HMPAO的摄取量。我们还注意到，在实验室环境中对培养的细胞进行标记比在临床环境中标记效率更高。另一项在马匹中开展的研究⁵也报告了在实验室环境中标记细胞的结果。此外，根据我们的经验，与培养后获得的细胞相比，从血液或组织样本分离后立即标记的细胞对示踪剂的摄取效率更高。然而，即使标记效率较低，仍.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
锝99m			请根据当地法律法规，咨询本地电离辐射供应商。 该同位素必须在从钼-99发生器洗脱后2小时内使用
Ceretec - 六甲基丙二胺肟（HMPAO）	GE HealthCare		请直接联系GE HealthCare
微量离心机，Minispin/Minispin Plus	Eppendorf	22620100
18 G 和 19 G 针头	Terumo Medical	NN-1838R (18 G)；         NN1938R (19 G)
1 ml 和 2 ml 注射器	Scientific Laboratory Supplies Ltd	SYR6200 (1 ml)；SYR6003 (2 ml)
1.5 ml 微量离心管	Greiner Bio-One Ltd	616201
PBS - 磷酸盐缓冲液	LifeTechnologies	14190
无菌纱布敷料	Shermond Ltd	UNG602
CoflexVet 自粘绷带	Andover Healthcare, Inc.	3540RB-018
超声成像软件	Scion Image, Scion Corporation, USA
MicasXplus 闪烁图处理软件	Bartec Technologies Ltd		http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html
用于同位素监测的现场同位素计数器	John Caunt U.K.	GMS1800a	http://www.johncaunt.com/
用于同位素测量的井型计数器、剂量校准仪	Capintec Southern Scientific	CRC-25R