Abstract
At tendon ve bağ yaralanmalarının tedavisinde kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin (BMMSC) uygulanması son gelişmeler deneysel ve klinik çalışmalarda hem de sonuç önlemleri geliştirilmiş öneririz. BMMSC sayıda tendon lezyon içine implante edilir, ancak (genellikle 10-20.000.000 hücre), sadece nispeten az sayıda hayatta (<% 10), bu implantasyondan sonra 5 aya kadar devam edebilir rağmen. Bu BMMSC diğer dokulara implante edilmiş diğer türler ortak bir gözlem gibi görünüyor ve bu kayıp birçok ilk implantasyon sürecinin hayatta nasıl ve hücreler diğer organlara temizlenmiş olup olmadığını, ortaya çıktığında bunu anlamak önemlidir. Hücrelerin kaderini Takip hücrenin konumu ve hücre sayıları miktarının in vivo görüntüleme invazif olmayan implantasyon BMMSC önce radyo-etiketleme ile elde edilebilir.
Bu protokol, bir hücre labeli tarifAtlarda yaralanan fleksör tendon içine Teknesyum-99m (Tc-99m) ve implantasyon izleyen bu hücrelerin izleme kullanan ng prosedürü. Tc-99m gama ışınları yayar ve lipofilik bileşik hexamethylpropyleneamine oksim (HMPAO) varlığında hücreler tarafından içselleştirilebilir kısa süreli (t 1/2 6,01 hr) izotoptur. Bu özellikler çok farklı hastalıkların tanısında nükleer tıp kliniklerinde kullanılmak için idealdir. Etiketli hücrelerin kaderini akciğer, tiroid ve diğer organlarda Lezyonun ve hücrelerin dağılımı birikmiş hücre sayısı hem de ölçmek için, gama parıldaması ile kısa süreli (en fazla 36 saat için) 'de izlenebilir. Bu teknik, kan lökositlerinin etiketleme uyarlanmıştır ve diğer organlarda BMMSC implante görüntüye yararlanılabilir.
Introduction
Hastalıklı ya da zarar görmüş dokuların onarımı için Rejeneratif stratejiler etkilenen bölgeye doku çeşitli türetilir ve implante multipotent kök hücreleri dayanmaktadır. Atlarda tendon ve bağ yaralanmalarının tedavisinde otolog BMMSC uygulamasında son gelişmeler hem deneysel 1-5 iyileştirmiştir önlemleri ve klinik çalışmalar 6 göstermiştir. At o yaşta muzdarip ve distal ön ayakları tendon yaralanmaları ile ilgili aşırı yorgunluk, bir atletik hayvan olduğu için tedaviler ile ilgili kök hücre etkinliğini değerlendirmek için özellikle çekici bir model olduğunu ve büyük bir kolaylaştırıcı kemik iliği kurtarma ve Doğru implantasyon. Tendon yaralanmaları fibrozis ile doğal iyileşir ama iyileşmiş tendon 7 işlevsel aşağı ve yeniden yaralanma 8 yüksek risk taşır. Bir elastik enerji olarak hareket etmek gelişti gibi yüzeysel dijital fleksör tendon (MFDS) en sık etkilenenmağaza ve deneyimler yüksek yükleme enerjisini verimli ve yüksek hızda lokomosyon elde vurguluyor. Yaralanma sonrası işlevini geri nedenle önemlidir. Bu yaralanmalar benzer bir işlevi 9 gerçekleştirir insanlarda Aşil tendonu etkileyen benzemektedir. Bu nedenle hücre tabanlı rejeneratif stratejiler sonuçlarını iyileştirmek için ve yeniden yaralanmaları azaltmak için cazip bir fırsat sunuyoruz, tedavi ya da yaralanmalar için iyi onarımını sağlamak iyi bir tedavi seçeneği vardır.
Çalışmaların çoğunda 5-20.000.000 otolog BMMSC genellikle bu nedenle hücreler için bir kap gibi davranır tendon vücudun çekirdek içinde meydana lezyon içine doğrudan enjekte edilir. Bir kez enjekte edilen hücrelerin kaderi hücreleri son zamanlarda tarif edilmiştir izlemek için açık ve farklı hücre etiketleme yöntemleri değildir. Bir floresan etiket ile etiketlenmiş hücreler, sadece nispeten az sayıda (<% 10) 10,11 hayatta gösterilmiştir. Floresan etiketleri gerektirenzaman alıcıdır ve değildir, histolojik analiz için doku çıkarma ve kesit hali hazırda büyük bir hayvan modelinde veya klinik vakalarda geçici analiz kolaylaştırır. Daha yeni çalışmada, hücreleri etiketlemek ve gama sintigrafisi 1 kendi kaderini takip radyoizotop 99m Tc kullandık. Bu yöntem, hızlı karşılaştırmalar intra-arteriyel 12 veya intravenöz enjeksiyon yoluyla 1,12 juguler ven 1 veya bölgesel perfüzyon yoluyla intravenöz lezyon içine dahil olmak üzere hücre teslim farklı yolları, arasında yapılacak sağlar. Hücrelerin sebat ve dağıtımı daha sonra çeşitli organlarda gama sintigrafisi ile görüntülenebilir. Bu hücrelerin sadece% 24 intralezyonel 24 saat 1 ile lezyonun kaldı enjekte ve deneysel oluşturulan lezyonlar kullanarak ve aynı radyoetiket 5 kullanarak bir başka çalışmada tarafından desteklenen olduğunu göstermiştir. Ayrıca, hücreler delivere tendon lezyonları içine eve sınırlı yeteneğini göstermekintravenöz bölgesel perfüzyon veya tarafından d ama ikincisi yolları 4 ile akciğerlere dağılır.
Demir nanopartiküller ile etiketlenmiş BMMSC ön ayakları tendonların 13 implante hücreleri izlemek için alternatif bir yöntemdir. Demir nanopartikül etiketli hücreler MRI ile in vivo olarak, hücre izlenmesine izin birlikte, büyük bir hayvanda zamansal çalışmalar, anestezi MRG gerçekleştirmek için her bir zaman noktasında tatbik edilebilir kaç kez ile sınırlıdır. Ayrıca, demir nanopartiküller tendon vücuda işaretli hücrelerin göç hakkında bilgi sınırlar MR hipointens bulunmaktadır. Kullanılabilen diğer radyoizotoplar İndiyum-111 bulunur, ancak bu Tc-99m daha uzun bir yarı-ömür dezavantajına (2,8 gün vs 6,0 saat) ve daha yüksek bir gama ışını emisyonu enerji uğrar. İndiyum-111 14 ile etiketlenmiş Buna ek olarak, hücre canlılığı, azaltılabilir bildirilmiştir. Tc-99m, diğer taraftan, rutin olarak iki, at ve insan nükleer kullanılantıp periferik kan mononükleer hücreleri etiketlemek ve sintigrafi ile in vivo dağıtımını takip etmek. Bu nispeten kolay hücrelere, Tc-99m-HMPAO olarak, teknesyum bağlamak için bir bağlayıcı molekül olarak HMPAO ile hücreler tarafından alınabilir. Tc-99m-HMPAO BMMSC iyi canlılığı göstermek ve in vitro 4 çoğalırlar yapabilirsiniz etiketli. Bu protokol ön ayakları MFDS doğal olarak oluşan lezyonlar içine implante etiketleme ve at otolog BMMSC izleme ayrıntıları.
Bu protokol sadece amaçlanan bir araştırma aracı olarak kullanılmak üzere dikkat etmek önemlidir. Klinik tedavi yöntemi olarak kullanımı tam olarak açıklığa kavuşturulamamıştır hücresel fenotip üzerindeki radyoaktif etkisi olarak tavsiye edilmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada tarif edilen vakalar Colegio de Veterinarios de Malaga, İspanya Hayvan Etik ve Sosyal Komitesi ve Kraliyet Veteriner Koleji, Kuzey Mymms, İngiltere atlara kullanılan prosedürler tarafından verilen Etik izni aşağıdaki yapıldı vardır onaylı protokoller dayanmaktadır implantasyon sonrası sedasyon, kemik iliği aspirasyonu, intra-tendinöz enjeksiyon, bölgesel perfüzyon, intravenöz enjeksiyon, işlem sonrası tedavi ve ağrı yönetimi ve izleme içerir kök hücre bazlı terapiler alan atlara klinikte kullanılan.
1. Temel Düzenlemeler Advance Yapılacak
- Kurumsal etik ve hayvan refahı onayı Seek ve çalışmaya başlamadan önce yerel yasal gereklere uygun.
- Personelin uygun koruma düzeyi ve çevre ve bulaşm bertarafı dahil olmak üzere yerel ve yasal düzenlemeler emrettiği gibi iyonlaştırıcı radyasyon ile çalışmak için kurumsal onayını alıniyice kirlerden atık.
- Aşağıdaki dahil edilme kriterlerine kullanın: ön ayakları ve tendon içindeki bir arıza ve kusur sonucu lezyonların yüzeyel fleksör tendon dijital olmayan bir travmatik yaralanma aşırı yorgunluk (tendinopati veya desmopathy) ile mevcut atları sağlam tendon ve / veya paratenon çevrilidir .
Not: Bu tür yaralanmalar ve hücre implantasyonu için atların klinik hazırlanması için muayene ve tanı başka 6,15 detaylı edilmiştir.
Not: At kemik iliğinden türetilen BMMSC kültüründe izolasyonu ve genişleme önce 6,16 ayrıntılı edilmiştir. Atı MFDS yaralanmaları BMMSC enjekte geçerli protokol otolog kemik iliği süpernatant (BMS) 16 ml 4 başına 10 milyon hücreleri kullanır. - Yüksek geçiş numarası c ile ilişkili potansiyel hücre fenotipi genetik değişiklikleri önlemek için in vivo implantasyonu için en fazla 4 pasajlar geçirmiş hücreler kullanarakarşın.
- BMS hücrelerin gerekli sayıda sunun (4 bir ürperti kutusuna 24 saat içinde - 8 o C) hücre implantasyonu yapılacak olan veteriner kliniğine.
Not: Kemik iliği süpernatanda mezenkimal kök hücrelerin klinik kullanım yetkisi gerektirebilir ReCellerate Inc (ABD) ve kullanımı aittir patentli bir işlemdir.
Not: Tc-99m, nispeten kısa bir yarı ömre sahip bir gamma yayıcı (140 keV) 'nin (6,0058 saat, bu nedenle de yaklaşık% 94, 24 saat 99 Tc istikrarlı formuna dönüşür). Gama enerjisi at ve hayvan taşıma personeli hem çok sınırlı radyasyona maruz kalma zamanında gama kameralar (sintigrafi) ve kısa yarılanma ömrü sonuçları tespiti için uygundur. Bu protokol [HMPAO (sodyum perteknetat gibi) Tc-99m ile işaretli] Tc-99m-HMPAO kullanarak hücrelerin bünyesinde etiketleme anlatır. - Hücrelerin zekâ etiketlemek için teslim ve kullanılan şekilde tedarikçiden taze Tc-99m SiparişTc-99m jeneratör elüsyon 2 saat hin. Tc-99m, 1 ml çözelti (tedarikçinin standart tamponu) 1 GBq olarak verilir emin olun.
- RT'de tüm tamponları kullanın. Etiketleme prosedürü uygulayın, alkol ile temizlenmelidir tüm ekipmanları ile bir izotop muhafaza odasında hücreleri ve görüntüleme (gama sintigrafi) implantasyonu Çalışmaya başlamadan önce, mendil.
Ön ayakları Tendon Horse and Ultrasonografinin 2. Hazırlık
- Zaman noktasında daha sonra ilk (kemik iliği aspire edilir) yaralanma için başvuru ve Tutanak ultrason taramaları radyoaktif işaretli hücreler enjekte edildiğinde.
- Atı ahır eşit ağırlık taşıyan ve (yerine genel anestezi yerine) sedasyon ayakta altında ultrasonografi ve hücre implantasyonu gerçekleştirin. 0,01 0,02 mg / kg IV detomidine HCI ve butorfanol tartrat karışımı, her biri kullanılarak sedasyon uygulayın.
Not: Kurtarma hızlı ve ameliyat sonrası bir tedavi gerektirir hayırözel durumlar. - Perinöral anestezi etkilenen ekstremite (adım 2.6) uygulandıktan sonra, tedavi sırasında at hareketini azaltmak için sedasyon altında istasyonunda atı tutmak. Görme indirilmiş baş pozisyonu ve at tavır ve at hücre enjeksiyonu ve sintigrafik görüntüleri alımı sırasında gama kamera hareketleri sırasında rahat olduğunu karar sedasyon uygun seviyesini kontrol edin.
Not: Çünkü sedasyon yanıp sönen altında gözlerin (kuruluğunu önlemek için) üzerine veteriner merhem uygulamak etkilenmez gerekli değildir ve at gözlerin hidrasyon koruyabiliyor. Hücrelerin implantasyon sonrası izlenmesi non-invaziv (ultrason ve gama sintigrafisi) 'dir. - Klip yakından (at kılı kesme makineleri ile) tendonuna örten saç sonra nihayet alkol klorheksidin cerrahi fırçalayın kombinasyonunu kullanarak kırpılmış alanı temizlemek.
- Alan akustik bağlantı jel uygulayın veSeri on-insidansı enine ve boyuna görüntüler elde etmek için bir lineer transdüser (12 MHz veya benzeri) ile, 7 17 - tam palmar metakarp bölge taramaları, sırayla etiketli seviyelere 1 kayıt yöntemli tarayın. Kesit alanı ve maksimal yaralanma yeri 4 görüntü analizi yazılımı yardımı ile elde edilebilir ve böylece dijital görüntü saklayın.
- Tendon ve yüzeyel fleksör tendon dijital örten derinin tam duyarsızlaştırma sağlamak için lokal anestezik aseptik enjeksiyon için carpus hemen distalinde palmar sinirleri örten alanı hazırlayın. Mepivicaine 2 mL deri altına ve (bunların alt fasyal konumda) palmar sinirlerin bitişik fleksor tendonları ile kolun her iki yanında el bileğinin hemen distal kasık bağı hem enjekte edilir.
- Ön tarama klorheksidin cerrahi s alanı ovma yoluyla implantasyon sitesi hazırlamak gerçekleştirildikten sonracrub en az 5 dakika boyunca çözeltisi ve son olarak alkol emdirilmiş gazlı bezle. Aseptik moda sonraki tüm adımları uygulayın.
Atçılık Mezenkimal Kök Hücre 3. Tc-99m-etiketleme
Not: Hücre etiketleme adımlar tendon içine hücre etiketleme ve işaretli hücrelerin implantasyonu arasındaki bu minimize edecek izotop çürüme olarak ön ayakları ultrasonografi sırasında yapılabilir.
- O izotopun alımı engel olarak hücreleri BMS çıkarın. Bunu yapmak için, soğutma kutusundan BMMSC şişesini (BMS 1 ml 10.000.000 hücre) almak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350 x g'de bir mikrosantrifüj pelet hücreleri. Dikkatle hücre tabanda yardım etmek için bir tüp içinde, küçük bir damla (≤0.1 mi) bırakarak, bir 18G ya da (2 mi şınngaya bağlanmış) 19G iğnesi ile supernatant çıkarın. Steril bir mikrosantrifüj tüp içinde süpernatant (BMS) kaydedebilir ve daha sonra yeniden kullanım için buz üzerinde tutmak.
- Fl süpernatanttan kalıntı damlacık hücrelerin tekrar(yerine girdap dışında) parmaklarınızla hafifçe tüp Icking ve oda sıcaklığında bir rafa tüp bırakın. Hücreler tamamen yeniden süspanse ve hiçbir görünür hücre kümeleri olmadığından emin olun.
- Aşağıdaki gibi Tc-99m hazırlayın. Teknetyum devri 1 ml 1 ml şırınga ve iğneyi kullanarak HMPAO bir şişe içerisine perteknetat. Yavaşça ama iyice karıştırın ve kurşun koruyucu arkasında 5 dakika bekletin. Not: Hücreler adım 2.1 iplik ise bu adım yapılabilir.
- Hücrelere 1 ml'lik şırınga ve bir iğne kullanılarak Tc-99m-HMPAO karışımın tümü ekleyin ve yavaşça karıştırın. Talebi koruyucu örtünün arkasına oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- Bir sonraki adımlar için, izotop (eldivenli) başparmak kirlenmesini ve daha sonra diğer donanımları en aza indirmek için mikrosantrifüj tüp kapağını açmak için forseps (ya da doku kağıt parçası) kullanın. Eklemek veya yıkama tamponu çıkarmak için 2 ml şırınga ve 21 G iğne kullanın.
Not: Bir alan izotop monitörün kullanım yüzeylerinin ve ekipmanların kirlenmesini izlemek için teşvik edilmektedir. , Kapağı kapatın hafifçe karıştırın ve sıkma adımında 3.1 olarak pelet hücreleri, Tc-99m-HMPAO hücre karışımına 1 ml PBS ekleyin. - Dikkatle yeni bir tüp (W1 olarak kurşun koruma ve etiket arkasında bu tasarruf) için PBS kaldırmak. Taze PBS 1 ml hücre pelletini. Tüp Santrifüj ve (W2 olarak bu ve etiketi kaydetmek) yukarıdaki gibi süpernatant kaldırmak.
- W1 ve W2 tüplerinde karıştırıldı ve hücre peleti içerisindeki sayımları ölçülerek etiketleme verimi olarak hesaplanır. Bir Şey izotop doz kalibratör enstrüman her tüpleri yerleştirerek ve dakika (CPM) başına sayım olarak radyoaktivite kaydederek bunu yapın. (Hücre CPM olarak Radyoaktivite) olarak etiketleme verimliliği hesaplayın / (Radyoaktivite hücrelerinin + süpernatant) x 100.
- BMS adım 3.1 kurtulmuş ekleyin kalıntı PBS iyice hücreleri tekrar süspansiyon ve. Hücreler lezyon içi implantasyon için hazırız.
Tc-99m-HMPAO etiketli Hücre 4. implantasyonu
- İntralezyoner implantasyonultrason eşliğinde tendon içine
- Yavaş yavaş iğne ile paralel olarak 1,5 ya da 2 inç (50 mm) bir steril örtü kaplı ultrason transdüktörü ile uzunlamasına yönde lezyon maksimum yaralanma bölgesine 20 G iğne tanıtmak iğne uzunluğu olabilir ve böylece İğne doğru lezyonun merkezinde ise ultrasonografik teşhis ve ucu olabilir.
- 2 ml şırınga içine hücreleri toplamak, uygun zırhlama kullanarak 20 G iğne kullanılarak (Luer kilidi dış kontaminasyon riskini ve kurşun-korumalı şırınga kapak aza indirmek için). Herhangi bir sıvıyı kaybetmemek için dikkatli olmak iğne atın. Şimdi iğne tendon önceden bulunan üzerine işaretli hücrelerin şırınga takmak.
- Dokuda iğne yolu açıkça görülebilir şekilde iğnenin altında ultrason probu yerleştirin. Lezyon içine yavaş ama istikrarlı bir hızda hücreleri enjekte edilir. Enjeksiyona direnç olmadığından emin olun. Bu karşılaştıdikkatle ultrason eşliğinde iğne yerleştirin. Lezyon içine sıvı fırlatma hiperekojen hava kabarcıkları içeren anekoik sıvı gibi ultrason görüntüsünde görünür olduğundan emin olun.
- İğneyi geri çek ve hemen enjekte edilen hücrelerin kaybını önlemek ve bacak dış yüzeyi üzerinde izotop yayılmasını en aza indirmek için iğne deliği üzerinde baskı yerleştirin. Hemen autoadhesive bandaj bir tabaka ile uzuv elbise. At şimdi gama sintigrafisi için hazırdır. Hemen bu gerçekleştirin.
Not: tendon içine hücreler enjekte sonra şırınga içinde kalabilir hücrelerin olası doğrudan kaybını değerlendirmek için boş şırınga ve iğne sayısını kazanır.
- Tc-99m-HMPAO-işaretli hücrelerin Bölgesel perfüzyon
- Adımı 2.4 izleyin.
- Medial ve lateral konumlandırılmış iki adet 100 mm'lik pamuk rulo gazlı bez bandaj ile proksimal metacarpus'un üzerinde 100 mm lastik turnike bandaj uygulayın.
- Aseptik th hazırlamakEn az 5 dakika boyunca bir klorheksidin cerrahi fırçalayın çözeltisi ile bölgeyi ovma ve nihayet alkole batırılmış gazlı bez ile yanal Proksimal susam kemik seviyesinde yatay palmar dijital ven üzerinden e cilt. Aseptik moda sonraki tüm adımları uygulayın.
- Heparinize steril serum fizyolojik ile doldurularak venipunktür için 21 G x ¾ "(0.8 x 19 mm) kelebek iğne ile ayarlanmış bir 100 mm uzantısı hazırlayın ve daha sonra yan palmar dijital ven içine iğne tanıtmak. Damar girildikten sonra kan kısmen uzatma seti dolduracaktır. Luer lock konnektörü etiketli hücrelerin sonraki enjeksiyon kolaylaştırmak için bir Luer kilit lastik kapağı takın.
- PBS ile önceden yüklenmiş bir 20 ml şırınga içinde hücrelerin toplanması ile PBS 19 ml MKH'lerin seyreltilir. (- 40 sn 30) 18 G (1.2 x 40 mm) yavaş ama düzenli bir hızda derialtı iğne kullanılarak lastik fincan yoluyla hücrelere uygulayın. Bir Syring önceden yüklenmiş 1 ml PBS ile kateter yıkayıne.
- Beş 4 x 4 pamuklu gazlı bezlerin tabakası ile iğne deliğinin üzerine deri baskı uygulamaktan derhal iğneyi çıkarın ve. Daha sonra Proksimal susam alanı üzerinde elastik yapışkan ile hafif bir bandaj yerleştirin ve enjeksiyondan sonra 30 dakika boyunca bir yerde turnike bırakın.
- 30 dakika sonra turnike bırakın. At şimdi gama sintigrafisi için hazırdır.
Not: hücrelerini enjekte ettikten sonra, şırınga içinde kalabilir hücrelerin olası doğrudan kaybını değerlendirmek için boş şırınga ve iğne sayısını kazanır.
5. Gamma Sintigrafi
- Sintigrafi görüntüler
- Düşük enerji, paralel delik kolimatör ile donatılmış (% 20 simetrik penceresini kullanarak 140 KeV fotoelektrik zirvede ayarlanır) bir gama kamera ile düzlemsel sintigrafisi görüntüler elde.
- Adım 2.2 olarak sedasyon atları duran zaman 0 sonra tüm görüntüleri edinin. Zaman 0 sintigrafisine sonra, implantasyon si üzerinde ışık bandaj yerineBir yastıklı bandaj ile te. Her sintigrafi sınav öncesinde bu bandaj çıkarın.
- "Çalışma seçimi" - - "edinilen" ile işleme yazılımı kullanarak 60 saniye, her (256 256 matris) statik görüntü elde "kemik statik" seçenekleri. Statik mod seçeneği hareketinin düzeltilmesi için bir modül olmadığından at görüntü elde etme dönemi boyunca hareket etmez esastır.
- Intralezyonel enjeksiyon için, uzak ekstremiteye carpus gelen lezyon alanından yanal görüntüler elde kontralateral bacak, sol akciğer alanında ve sol tiroid eşdeğer alanı. Ön ayakları görüntülerin elde edilmesi sırasında, bacak Kontrlateral görüntülenmesinde önlemek için bacaklarının arasına bir kurşun ekrana yerleştirin. Enjeksiyonu (saat 0) 5 dakika sonra da görüntüler elde, ve daha sonra 1, 3, 6, 12, 24, 36 ve 48 saat sonra.
- Bölgesel perfüzyon için, 5.1.1.3 gibi yanal ve dorsal gama görüntüleri elde edebilir. Görüntüleri 5 dk af edininter turnike bırakma. Bu hemen serbest bırakılmasını turnike öncesinde sayıları değerlendirmek için hücreler enjekte sonra bu uzuv görüntü için yararlı olabilir zaman 0. olacaktır. Hücrelerin verilmesinden sonra 1, 3, 6, 12, 24, 36 ve 48 saat sonra gama görüntüleri elde edilir.
- Görüntüleri elde edildikten sonra, süreç el "Sokoloff" renk ve "Invert" renk seçenekleri ile seçilen yazılımın "işlem" seçeneğini kullanarak görüntüleri. Bu lezyon alana seçim maske ve hareketin yeniden şekillendirilmesi izin verdiği Sonraki "ilgi bölgesi" (ROI) ve "elips" seçeneğini seçin. "İstatistiklere ekle" seçeneğini seçerek ROI üzerinde sayıları edinin. İlgi alanına (ROI) bu denk boyutlandırılmış bölgeleri, farklı zaman noktalarında her bir hayvan için kaydedildi emin olun.
- Daha sonra, her bir zaman noktasında teknetyum tahmin edilen bozunma için sayıları düzeltin. Çürüme düzeltmek için aşağıdaki denklemi kullanın:A = A e o - (0.693t / T 1/2) çürüme sıfır zamanında radyoaktiviteyi düzeltilmiş bir o izotopun ilk faaliyettir, A, T geçen zaman ve T 1/2 yarısı izotopun -Hayat. Daha sonra aşağıdaki formül kullanılarak, kalan hücrelerin yüzdesini atlatmanın 0 zamanında ROI bir yüzdesi olarak her zaman bir noktada düzeltilmiş sayar ifade:
- Düşük enerji, paralel delik kolimatör ile donatılmış (% 20 simetrik penceresini kullanarak 140 KeV fotoelektrik zirvede ayarlanır) bir gama kamera ile düzlemsel sintigrafisi görüntüler elde.
% hücreler geriye kalan (t) = 100 - {[(tahmin edilen bozunma (±) - bozunma (t)) / çürüme tahmin (t)]} x 100
bozunumu (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BMMSs içine Tc-99m-HMPAO birleşme olumsuz doku kültürü plastik uymak için kendi yeteneğini etkilemez ve onlar (Şekil 1) tek tabakaları oluşturmak için çoğalma yeteneğini göstermek ederken çoğalma oranları veya diğer hücresel fenotipleri etkilenir olsun tam kararlı değil. Bunların morfoloji tipik iğ şekilli etiketlenmemiş hücrelerden benzer. Hücresel markalama etkinlik (yani. Etiketin, soğurulma) tipik olarak yaklaşık% 1.5 ila% 25 arasında değişir. Düşük etiketleme verimliliği için temel nedeni Mo-99 / Tc-99m jeneratörü ayrıştırılmıştır olmuştur siteden kliniğe 99m Tc teslim gecikme ile ilgilidir. 2'den fazla st gecikmeler hücrelerin etiketleme büyük bir düşüşe neden olur. Bununla birlikte, yeterli izotop kadar 36 saat (Şekil 2) için gama scintigrafisi gerçekleştirmek için hücreler içine dahil edilir. Etiketleme verimliliğini artırabilir faktörler tartışmada ayrıntılı olarak verilmiştir.
1 ya da arter 12 yoluyla, (doğrudan lezyon içine) ya da bölgesel perfüzyonla intralezyonal implantasyon 1 ile. Yaralanma tendon çekirdek ve hücreleri için bir depo olarak etkiyen sağlam tendon dokusuna çevrili zaman Lezyon implantasyon mümkündür. Bölgesel perfüzyon bir kan damarına enjekte edilir, ancak yöntem MKH tendon lezyona "ev-in" edebiliyoruz beklenti dayanmaktadır olarak hücreleri yönetmek için kolay bir yoldur. MSC'ler ancak özellikle ev tendon lezyonları sitelerinde içine can bu yöntem MKH homing kapasitesini artırabilir uygulamalar geliştirmek için yararlı bir deneysel bir yaklaşım sağladığını sınırlı kanıt vardır.
Intralezyonel teslimat güzergahı ile hücreler nispeten zaman yani lokalize kalır sinyalin odak alanı olarak görülecektir. Sınırlı s varpread veya çevredeki tendon dokusuna hücrelerin göç. Hücreler dijital palmar ven (Şekil 2) üzerinden bölgesel perfüzyon tarafından uygulandığında aksine, enjeksiyon yerinde zamanla sinyali kademeli olarak azaltılması olacak. Akciğer alanları negatif ama çok erken zaman noktalarında bazı durumlarda akciğer fazla (Şekil 3) jeneralize olur, sonra odak olabilir ve izotop sinyalini gösterebilir için bu lezyon içine enjeksiyon ile yaygındır. Tiroid bu uygulama yolu ile negatif kalır. Bölgesel perfüzyon benzer daha sonra yaygın hale ama sinyal intralezyonel rota ile gözlenen oranla anlamlı olarak daha yoğun olduğu akciğerlerde fokal sinyal göstermiyor olabilir. Tiroid de sıklıkla fokal sinyal gösterebilir.
Hücreler (zaman 0, ön enjeksiyon) ve ilgilenilen bölgede ilk gama sintigrafisine gelen sayım başlangıç toplam radyoizotop sayımı (zaman 0, post-injection) kaydedildi ve her bir zaman noktasında sayılarında yüzde azalmayı hesaplamak için kullanılır. Bu ilk sayım gelen Tc-99m tahmin çürüme (Şekil 4) karşılaştırmak için kullanılır. Hesaplanan eğri tahmin eğriyi takip edecektir. Bununla birlikte, göz önüne tahmin çürüme aldıktan sonra, intralezyonal uygulama sonrası enjeksiyon yerinde kalan hücrelerin kalıcılık (12 saat sonra), yaklaşık% 32 ve (24 saat sonra)% 24 (Şekil 4).
Şekil 1. Hücre Etiketleme, Enjeksiyon ve Gamma sintigrafisi kurşun kaplı koruma (ekran ve şırınga tutucu) ve radyasyon monitör ve mikrosantrifüj arkasında Tc-99m-HMPAO ile önceden etiketleme için bir mikro içine BMMSC (A) aktarın.; (B) bir doku kültürü kabı göstermek iyi m tohumlandı Tc-99m-HMPAO ile işaretli hücrelerin bir alikotuorphology, canlılık ve çoğalması; (C) sağ ön ayakları MFDS yaralanma sitesine ultrason eşliğinde Tc-99m-HMPAO ile işaretli hücrelerin enjeksiyon; (D) ön ayakları Gama sintigrafisi. Gama kamera hassas bir manevra kabiliyeti, hidrolik kol ve bacak kontralateral hücreleri bacakları arasında düzenlenen bir kurşun zırh tarafından elimine edilir etiketli herhangi bir potansiyeli kullanarak önce yerleştirilmiştir. Gama kamera benzer akciğer alanını izlemek için göğüs veya tiroid alanını izlemek için boyun konumlandırılmış. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. MFDS Ultrason ve Gamma sintigrafilerinin. (A orta metakarpal bölgede ön ayakları tipik ultrasonographs (B) enine kesitini göstermektedir. MFDS içinde lezyon açıkça ve MFDS altındaki komşu derin dijital fleksör tendon (DDFT) ve yaralanmamış (normal) doku bütünlüğü ile karşılaştırıldığında (taramanın üst kısmına doğru) bir hipoekoik alan olarak görülüyor. Lezyonun ve tendonların göreli konumlarının alanı aşağıdaki şemada gösterilmektedir. Gama scintigraphs dijital palmar damarı vasıtasıyla damar içine, bölgesel perfüzyon ile lezyon ya da (D) enjekte edilen hücrelerin (C) için gösterilen radyo-etiketli hücre 3, 6 ve 12 saat sonra enjeksiyon yapılan. Gösterilen durumda, MFDS (kesiksiz oklar) lezyon sitesinde radyo-etiketli hücre alımı oldu. Palmar dijital ven yoluyla alımının Kalıcılık kesik okla gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Erken zaman noktalarından Şekil Akciğer ve Tiroid 3. Gama sintigrafilerinin. Tipik taramalar intralezyonel enjeksiyon ve etiketli hücreleri bölgesel perfüzyon hem de gösterilir. Akciğer ve tiroid alanlarında fokal ve diffüz sinyal unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Radyoaktivite Şekil 4. Çürüme. İntralezyonel Enjeksiyonu sonrası İlgi Bölgelerinden Kaydedilen bu atı olarak sayar lezyon içine enjeksiyon sonrası 36 saat boyunca MFDS gama sintigrafilerinin ölçüldü. Sol panel: Her bir zaman noktasında radyoaktivite süresi 0 değerine karşılık hesaplandı. Daha sonra99m Tc radyoaktivite olarak atural çürüme karşılaştırma için gösterilmiştir. Sağ paneli: kalan hücreler tahmini yüzdesi. Bu ilgi bölgelerinden radyoaktivite seviyesi hesaplanır. Bu durumda, 24 saat sonra hücrelerin kalan yüzdesi yaklaşık% 24 idi. Biz 21 atları (MSC ve implantasyon etiketleme) Bu protokolü gerçekleştirdik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemik iliğine ek olarak, yağ dokusu gibi kaynaklardan izole edilmiş kök hücrelerin bu protokol ile etiketlenmesi için uygundur. Bundan başka, bir donmuş durumdan hücreler canlandırıldı ve markalama çalışmaları 12 için arzu edilen numaralara kültürde genişletilebilir.
BMMSC etiketleme etkinliğini belirleyen önemli bir faktör radyofarmasötiklerin molibdenyum jeneratöründen Tc-99m elüsyonu arasındaki zaman, Tc-99m-HMPAO hazırlanması ve klinikte radyofarmasötiğin kullanılmasıdır. Bu dönemden sonra gecikmeler önemli ölçüde hücre etiketleme verimliliğini bozabilir şekilde jeneratörden Tc-99m elüsyondan sonra etiketleme verimlilik ve zaman arasında ters bir ilişki vardır. Bu nedenle, yakın eşgüdüm laboratuvar hücrelerin teslim ve hücreler radyoaktif işaretli ve implante olacak gününde kliniğe Tc-99m teslimi arasında gereklidir. Clini ulaşım süresic nedenle önemli bir faktördür. Tedarikçinin data sheet Tc-99m çürüme sonra Tc-99m ve alınan Tc-99m-HMPAO miktarı HMPAO bağlama engelleyebilir 2 saat sonrası elüsyondan sonra radyokimyasal saflığını azaltır belirtmek hücreler tarafından. Ayrıca laboratuvar ortamında kültürlenen hücrelerin etiketlenmesi klinikte daha verimli etiketleme verdi belirttiği. Bu aynı zamanda hücrelerin laboratuar ortamında etiketli atlar 5 başka çalışmada bildirdi. Buna ek olarak, deneyim, etiket bir kültüründen hazırlanmıştır hücrelere kıyasla, kan veya doku örneklerinden hazırlanması hemen sonra etiketlenmiş hücreler ile daha verimli bir şekilde alınır. Ancak, hatta etiketleme düşük verimlilik ile 36 saat boyunca sintigrafisi gerçekleştirmek için hücrelere bağlı yeterli etiket yok.
% 40 etiketlenmesi verimlilikleri - Tc-99m bir mesafede kullanıldığında% 80 lökositler için elde edilebilir(- 0.5 mi 1) 18 30 dakika ve küçük bir hacim içinde reaksiyona olan jeneratörden sıyırma sıvısı. % 47 Etiketleme verimlilikleri -% 71 at MKH 19 ideal şartlarda MKH etiketleme verimliliğini artırmak mümkün olduğunu göstermek için elde edilmiştir.
Kadar 40 milyondan fazla hücre büyük lezyonlar için implante olmasına rağmen rutin MFDS çekirdek lezyonlarının tedavisi için 20 milyon hücre implant. Bu yöntem, genel olarak, daha karmaşık prosedür olmamasına rağmen hücrelerin yakın sayıda bölge perfüzyon yoluyla implante edilebilir. Bununla birlikte, lezyon içine yeterli hücrelerin ana beklentisi ile tendon yüzeyinin çevresine uzanan lezyonlar için yararlı olabilir. Gama sintigrafisi ile hücrelerin Takip farklı yollardan uygulanan hücrelerin hareketi hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir. Bu protokolde, intralezyonel yoldan implante hücreleri MÖSTL vardıry intralezyonel yol ile, enjeksiyon yerinde tutulan. Radyoizotop sinyali bazı durumlarda akciğer alanlarında görülebilir ama bu hücrelerin küçük göç uzak lezyon sitesinden olduğunu, genel olarak görünür. Bölgesel perfüzyonla BMMSC teslim yara alanında hücre tutma olabileceğini düşündürmektedir, ancak intravenöz enjeksiyon 4 tarafından teslim zaman hücrelerin homing görülmez. Tc-99m-HMPAO hücreler tarafından ve sitoplazmadaki tutulan olarak Tc-99m-HMPAO etiketli hücreler geçiş yeteneği 20 etki etmez ve bu yapışma özelliklerine müdahale etmek mümkün değildir.
Bu (ölü hücrelerin veya canlı hücrelerden verildiği başka mekanizmalar serbest) hücrelerden etiketin önemli bir ayrılma olabileceğini mümkündür gibi ilgi bölgelerinden sinyalinin hesaplanması düşük tahmin edilmiş olabilir. Tiroid ücretsiz ölü veya ölmekte hücrelerden salınan izotopu (Tc-99m) ve Tc-9 yakalar9m-HMPAO böbrek ve gut ile elimine edilebilir. Bu dokular etiketin potansiyel kaybı değerlendirmek için gama sintigrafisi ile takip edilebilir.
Hücre etiketleme prosedürü, farklı dağıtım yolları kullanılarak çeşitli noktalarda (organ ve yaralanma) hücre tutma ve alımını test etmek için adapte edilebilir. Akciğerlerde sinyalin fokal doğası muhtemelen zamanla kırmak ya da hücre lizizine girmek hücre agrega göstergesi olabilir. Ölü hücrelerden enjekte edilen hücrelerin ve elde edilen enkaz dolaşım yoluyla tiroid için daha erişilebilir bir rota var çünkü ücretsiz izotop yakalar tiroid, muhtemelen bölgesel perfüzyon aşağıdaki alımında bir artış gösterir. Hücrelerin sadece% 24, 24 saat sonra kalan, ancak çoğu durumda tiroid serbest Tc-99m gösterdi, tendonda lezyon içi yol en etkili dağıtım yoldur. Bu tür protokolleri kullanan kazanılan bilgiler mo için kök hücre uygulamaları gelecekteki tasarım ve geliştirme bilgilendirebiliretkili klinik tedaviler yeniden.
Hücre Etiketleme protokol, insan tıbbi uygulamalarda lökositlerin Tc-99m-HMPAO etiketleme at kullanım için adapte edilmiştir. Bu protokolde Kullanımı tendon hastalıkları, hücre bazlı tedavilerin araştırmalar için kendiliğinden oluştuğu büyük bir hayvanda uygulanabilirliğini göstermektedir. Klinik vakaların işe daha büyük bir hayvan ile çalışma ile ilgili yüksek maliyetleri dengelemek için yardımcı olabilir. Bir görüntüleme yöntemi olarak kullanım için etiketleme prosedürü, küçük hayvan modellerinde 21 tarif edilmiştir ve protokolü benzer şekilde diğer kiriş hastalıkların araştırmalar için koyun gibi daha büyük hayvanlarda kullanılmış inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, Suppl S23. 23-26 (1997).
- O'Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
