Protocol
O Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Geórgia aprovou o estudo humano sujeitos a recolha de sangue periférico de voluntários saudáveis (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 Os voluntários assinaram o termo de consentimento necessária antes de tirar sangue. A pesquisa realizada neste artigo está em conformidade com as diretrizes éticas para pesquisas médicas envolvendo seres humanos da Declaração de Helsinki.
1. Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano (Figura 1)
Nota: Existem várias maneiras para isolar os neutrófilos a partir de sangue periférico. O protocolo a seguir fornece uma possibilidade. Este protocolo resulta um grande número de neutrófilos não activados humanos capazes de libertar rede sobre a estimulação externa. Use 40 ml de sangue total obtido a partir de voluntários saudáveis por punção venosa. 7,9
- Alíquota de 20 ml de sangue em dois tubos de 50 ml cônico. Adicionar 10 ml de dextrano a 6%. Misture delicadamente.
- Após 20 min de transferência do leucócito-rich fase superior sem tomar quaisquer glóbulos vermelhos peletizadas para limpar 50 ml tubos cônicos, e preenchê-lo com PBS estéril.
- Centrifugar a 400 xg, 10 min. Ressuspender o sedimento em 4 ml de PBS estéril.
- Preparar um gradiente de Percoll de 5 passos de 85% -80% -75% -70% -65% em dois tubos de 15 mL cónicos e camada 2 ml de suspensão de leucócitos no topo de cada gradiente.
- Centrífuga 800 xg por 30 min com freios fora.
- Recolha todas as células (neutrófilos) nas camadas do 75% / 80% e interface de 70% / 75%.
- Lavar as células duas vezes em PBS (350 xg, 10 min, RT) e contagem de células utilizando um hemocitómetro.
2. Medição da cinética de ADN extracelular de lançamento Usando uma microplaca de Fluorímetro
Nota: Este método permite a medição das alterações na fluorescência de um corante indicador de libertação de ADN em um formato de microplacas de 96 poços de ligação do ADN de membrana impermeável (Figura 2).
- Prepara-se uma suspensão de neutrófilos em meio de ensaio (HBSS +1% (v / v) + glucose no soro autólogo a 5 mM) a uma concentração de 2 X 10 6 células / ml.
- Adicionar 5 umol / L de corante a membrana impermeável de ligação de ADN. Misture delicadamente.
- neutrófilos humanos alíquota (50 pL / cavidade) em 96 cavidades, de fundo transparente preto microplacas. Certifique-se o meio de ensaio cobre a totalidade do fundo do poço. Se não, toque ligeiramente a placa do lado.
- Aquecer a placa contendo neutrófilos durante 10 min a 37 ° C.
- Nesse meio tempo preparar soluções de estímulos com o dobro de suas concentrações finais a ser utilizado (em C meio de ensaio quente 37 °). Como um controlo positivo NET usar neutrófilos humanos com 100 nM de forbol-miristato-acetato (PMA), durante 4 horas para desencadear liberação líquida máxima. 5,8 PMA estimulação durante 4 horas garante a liberação NET máxima enquanto a formação NET espontânea permanece baixa 5,8.
- Prepara-se o fluorímetro de microplacas durante a medição (4 h, 37 ° C, 530 nm para excitação e 590 nm para emissão). </ Li>
- Estimulam os neutrófilos através da adição de solução de 50 ul de estímulo para 50 ul de suspensões de neutrófilos. Use 0,5 ug / ml de saponina em um poço para medir sinal de liberação DNA máxima.
- Coloque placa no leitor e medir as mudanças na fluorescência durante 4 horas a cada 2 min sem agitação.
- Para análise de dados, calcular o aumento normalizado na fluorescência ao longo do tempo.
- Linha de base de fluorescência Subtrair os valores de ponto final para todos os poços incluindo saponina (Figura 2A, B). Aumento na fluorescência saponina deve ser o sinal mais alto. Ele é referido como "libertação máxima de ADN" (Figura 2A).
- Calcular as percentagens de libertação de ADN em amostras desconhecidas dividindo aumentos na fluorescência de amostras desconhecidas por libertação máxima de ADN.
- Média de resultados de repetições e apresentá-los como "% de libertação de DNA máxima" (Figura 2C).
3. Quantificação do Formulário NETção por MPO-ADN e ADN-HNE ensaios ELISA
Nota: Estes ensaios (MPO-DNA) modificado ou estabelecida (HNE-DNA) em nosso laboratório quantificar formação NET medindo os níveis de MPO-DNA e complexos de DNA-HNE 5.
- Revestimento de 96 poços de alta capacidade de ligação de placas de ELISA durante a noite com anticorpos de captura (50 uL / poço): anti-MPO (1: 2000 de diluição) ou anti-HNE (1: 2000).
- Lavagem ELISA placas três vezes com PBS (200 ul / poço) e bloqueá-los com 5% de BSA e 0,1% de albumina de soro humano durante 2 horas à temperatura ambiente (200 ul / poço). Lavar três vezes com PBS.
- neutrófilos das sementes sobre microplacas de 96 poços a uma densidade de 100.000 células / poço em 100 ul de meio de ensaio, e estimular a formação de rede. Incubar as células: 4 horas para 37 ° C.
- Realizar uma digestão DNase limitada por adição de 2 U / ml DNase para sobrenadantes de neutrófilos, misture bem. Mantê-los à temperatura ambiente.
- Pare a ADNase após 15 min por adição de 11 uL de EGTA 25 mM (concentração final 2,5 mM). Misture bem. Recolha supernatants em tubos de microcentrífuga limpo. amostras de rotação para se livrar de detritos de células a 300 xg por 5 min a RT. Transferir os seus sobrenadantes para tubos de microcentrífuga limpo. Mantê-los em gelo até estar pronta.
- Use uma alíquota de uma previamente preparado "padrão NET".
Nota: O NET-padrão é uma mistura de sobrenadante digerido-DNase de neutrófilos PMA-estimuladas obtidas a partir de pelo menos 5 diferentes doadores humanos, independentes.- Para usar o mesmo padrão para um longo período de tempo, recolher e aliquotar um grande volume de sobrenadantes de neutrófilos a partir de cada um dos doadores. Recolha de, por exemplo, 2 ml de sobrenadantes digeridos DNase de neutrófilos estimulados com PMA-resultará em alíquotas de 200 (10 ul cada) suficiente para 200 placas de ELISA. Os dados que caracterizam o padrão NET são encontrados na Figura 5.
- Estimular a neutrófilos humanos com 100 nM PMA durante 4 horas e aplicar DNase digerir a seus sobrenadantes de acordo passos 3,4-3,5.
- Recolha, piscina, alíquota (10 ul) e livreze sobrenadantes (-20 ° C) de neutrófilos.
- Para preparar o "NET-padrão", descongelar uma alíquota / doador obtido a partir de pelo menos cinco doadores diferentes, misturá-los e mantê-los no gelo.
- Descarte amostras descongeladas e usar os frescos para o próximo experimento.
- Prepare uma diluição 1: serial 2 do NET-padrão em PBS + EGTA.
- Diluir as amostras digeridas (DNase1-padrão e desconhecidos) sobrenadantes de 20 vezes em PBS + EGTA e aliquotar-los em placas de ELISA revestidas com anticorpos de captura.
- Incubar as placas de ELISA durante a noite a 4 ° C e lava-se três vezes com PBS.
- Aplicar a solução anticorpo de detecção (100 ul / poço): peroxidase de rabanete anticorpo anti-ADN cavalo conjugado (1: 500, de ratinho). Incubar durante 1 hora no escuro.
- Depois de quatro lavagens com PBS, adicionar substrato de peroxidase TMB: 100 ul / poço, 30 min. coloração azul é uma indicação de atividade da peroxidase (redes presentes).
- Parar a reacção pela adição de 100 ul / poço de HCl 1 M. osoluções azuis ficará amarela (Figura 5A).
- Ler a absorvância a 450 nm usando um fotómetro de microplacas.
- Para análise dos dados, calcular a quantidade de MPO-DNA ou complexos de DNA-HNE comparação com o padrão NET.
- Subtrair o valor de densidade óptica de fundo do meio de ensaio de todas as amostras.
- Traçar os valores de absorvância (eixo X) de amostras-padrão diluído contra o seu conteúdo líquido relativa (eixo Y) (Figura 5A).
- Utilizando a gama nonsaturated desta curva padrão estabelecer uma linha de tendência (usar melhor ajuste exponencial a partir do software utilizada) (Figura 5A). A equação desta linha de tendência determina a conversão dos valores de DO para quantitativos quantidades de redes.
- Insira os valores de DO medidos das incógnitas na equação da linha de tendência de 3.13.3 que vai dar a quantidade de redes na amostra desconhecida em percentagem do NET-padrão (Figura 5A).
- Calcularmédias de repetições (triplicado) e apresentar os dados finais como "quantidade de MPO-DNA ou complexos de DNA-HNE (% do normal)" (Figura 5c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os números desta manuscrito descrever o método de isolamento de neutrófilos, procedimentos experimentais e apresentar resultados representativos com explicação da análise dos dados. A Figura 1 mostra as etapas sequenciais de preparação de neutrófilos humanos. Este protocolo representa apenas uma forma possível de isolamento de neutrófilos. Ela produz grandes quantidades de neutrófilos que descansa capazes de libertar rede sobre a estimulação. A Figura 2 mostra como o ensaio de libertação de ADN baseados em fluorescência funciona. Utilizando um leitor de microplacas de fluorescência a cinética de libertação de ADN em neutrófilos humanos são seguidos em microplacas de 96 poços. A Figura 3 explica cada passo da análise dos dados. Em primeiro lugar, calcular o sinal de ADN máxima em neutrófilos tratados com saponina (Figura 3A). Aumento na fluorescência é sempre calculado como a diferença entre o valor de fluorescência mais elevada e o nível de fundo de fluorescência (
A Figura 4A representa o esquema explicar os princípios da MPO-ADN e ADN-HNE ensaios de ELISA. A Figura 4B mostra imagens representativas de imunofluorescência não estimulados, PMA- e neutrófilos humanos activados por PAO1. ADN extracelular mostra a morfologia típica NET e co-localiza com MPO e histona H4 citrulinados, um marcador de formação de rede. 6 A Figura 4C mostra MPO-DNA e HNE-ADN libertação em neutrófilos humanos, sob as mesmas condições, anteriores (como a Figura 3B, 3C e 4B). IA métodos de "rede" de ELISA foram anteriormente caracterizados. 5 Resumidamente, 2 L / tratamento de DNase ml (equivalente a 1 ug / ml de concentração da ADNase usada) durante 15 min à TA resultaram nos sinais mais elevados de MPO-DNA e HNE-DNA . 5 amostras corrida (100 ng / pista) sobre um gel de agarose revelou que o comprimento do DNAem os rendimentos mais baixos kb gama óptima de sinal de ELISA. 5 overdigestion ADN (ADNase dose mais elevada do que 20 U / ml) ou com omissão quer a captura ou o anticorpo de detecção eliminados os sinais de ELISA. 5
Além disso, os ensaios aqui e o "padrão REDE" são ainda caracterizados (Figura 5A). O NET-padrão contém em 19,5 mg / DNA média ml extracelular (medida usando um padrão com concentrações de DNA conhecidos), 399 ng / ml MPO e 103,4 ng / ml HNE (ELISAkits comerciais) (n = 8). Com base nos pesos moleculares totais de MPO (84 kDa) e HNE (29,5 kDa) e o facto de 1 ug de DNA contém 9,91 x 10 14 nucleótidos, NET-padrão contém 109 HNE moléculas e 147 moléculas de MPO por cada 1000 nucleótidos (ADN kb ). Duas vezes experiências de diluição em série do NET-padrão revelou que as gamas dinâmicas de ensaios tanto o MPO-ADN e ADN-HNE de ELISA são entre 19,0-609,0 ng /concentrações ml de ADN (Figura 5B). As diluições de inferior a 32 vezes o número de padrão NET resultou em saturação enquanto que as diluições de maior do que 1024 vezes não eram diferentes dos do fundo (Figura 5B). O tratamento padrão da rede com os inibidores de protease não alterou os resultados obtidos pelos ensaios de MPO-ADN e ADN-HNE, indicando que as proteases não interferem com estes ensaios (Figura 5C). Assim, os resultados obtidos da mesma amostra NET-padrão pela MPO-ADN ou ADN-HNE ensaios ELISA correlacionam fortemente umas com as outras (Figura 5D). Para mostrar que os sobrenadantes PMN congelados podem também ser utilizados nestes ensaios sem perder eficiência, algumas aliquotas da NET-padrão foram deixados sem tratamento ou outros foram expostos a um ou dois de congelamento / descongelamento ciclos executados à temperatura de -20 ° C ou -80 ° C (um intervalo de HR). Nenhum dos tratamentos de congelamento / descongelamento afectadas as MPO-ADN ou ADN-HNE resultados (Figura 5E). Em resumo, oNET-padrão fornece um ponto de referência confiável nestes ensaios-quantificar NET que permitem a comparação quantitativa dos resultados líquidos entre experimentos independentes.
Figura 1:. Isolamento dos granulócitos neutrófilos humanos Os neutrófilos foram isolados a partir de sangue periférico de voluntários de acordo com o protocolo descrito. contendo o anticoagulante sanguíneo foi usada para isolar neutrófilos por sedimentação com dextrano e centrifugação de gradiente. Sangue sem anticoagulante foi utilizado para preparar soro. A viabilidade das preparações de neutrófilos é avaliada por ensaio de exclusão de azul de tripano. Pureza dos neutrófilos é avaliada por citocentrifugação ou citometria de fluxo (CD16, CD66abcd células double-positivos). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Princípios do ADN Extracelular Ensaio de Libertação de (A) A fluorescência é obtida somente em neutrófilos cujo plasma e as membranas nucleares ter sido comprometida e o corante de ligação a ADN de membrana impermeável pode ligar-se ao seu ADN. (B) O ensaio é realizado em preto microplacas de 96 poços utilizando um fluorímetro de microplacas. (C) O fluorímetro regista as curvas de fluorescência em tempo real em cada poço. Um resultados representativos nos mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A análise dos dados de lançamento de ADN (.
Figura 4: MPO-DNA e HNE-DNA ELISA Os ensaios:. Princípio e resultados representativos (A) Esquema explicaring como o MPO-ADN e ensaios de trabalho HNE-ADN ELISA. (B) Os resultados representativos de imagens preparadas para imunofluorescência em neutrófilos humanos expostas a PMA 100 nM ou P. aeruginosa PAO1 estirpe (MOI 10) durante 4 h. DNA extracelular (DAPI, azul) co-localiza em redes com MPO (verde) e histona H4 citrullinated (vermelho). Um resultado representativo, n = 3. (C) libertação líquida foi medida em neutrófilos humanos, expostos aos mesmos estímulos como acima pela MPO-ADN e ensaios de ELISA de HNE-ADN. A média ± SEM, n = 3. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Caracterização dos "NET-padrão" (A) As diluições em série. (1: 2) do padrão NET foram preparadase submetidos a ELISA de MPO-ADN. valores de DO medidos são plotados contra a% de teor de NET-padrão. Vermelho "X" indica um valor de DO medido de uma amostra desconhecida. seta cinza indica como a "concentração NET" (azul "X") da amostra desconhecida é determinado usando a faixa central da curva padrão montada. Concentrações (B) de ADN em amostras NET-padrão diluídas em série foram determinados e plotados contra os valores de DO medidos do MPO-DNA ou HNE-DNA ensaios ELISA. áreas cinzentas indicam as gamas dinâmicas dos ensaios. (C) tratamento inibidor de protease (cocktail inibidor de protease, 1%) não afecta o resultado da MPO-ADN ou ADN-ensaios HNE (NET-padrão). A média ± SEM, n = 2. (D) Correlação de MPO-DNA e os resultados de DNA-HNE (OD 450 nm) de amostras diluídas em série "Net-padrão" em suas faixas dinâmicas (Veja 5B). (E) o congelamento e descongelamento ciclos (-20 ° C ou -80 ° C; one ou dois) não afetam os resultados de MPO-DNA e ensaios de DNA HNE (NET-padrão, média ± SEM, n = 2). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NET representar um novo mecanismo fascinante pelo qual neutrófilos matar agentes patogênicos. 1 Embora a literatura de redes tem sido continuamente expandindo ao longo dos últimos dez anos desde a sua descoberta, várias questões importantes relacionadas com o seu papel na biologia, mecanismo e regulação permanecem obscuras. metodologia adequada tem de ser desenvolvido para medir a NET, esse mecanismo antimicrobiano muito original. Este artigo descreve métodos que podem ser utilizados para quantificar de uma forma NET de elevado rendimento. O primeiro ensaio segue uma cinética de fluorescência de um corante de ligação a ADN da membrana impermeável. Este teste fornece grande quantidade de informações sobre a inclinação ea velocidade de libertação de DNA a partir de neutrófilos. Esta informação é crucial nas investigações que estudam eventos de sinalização precoce, levando à formação NET. Toda esta informação é perdida em ensaios de ponto final medição da libertação do ADN no final da incubação. O ensaio à base de corante de ADN extracelular não é específico para as redes. istosó mede liberação DNA. Para confirmar redes, é amplamente aceito para executar imunofluorescência em neutrófilos formando-NET e mostrar co-localização de DNA, quer com marcadores de grânulos (MPO, HNE) ou histonas. A determinação quantitativa dos dados imunofluorescência é que muito tedioso e subjetiva.
Aqui, uma modificação de um ensaio de ELISA desenvolvido anteriormente detecção de complexos de ADN-MPO é apresentada. A medição de ensaio de complexos de ADN-HNE semelhantes ELISA que representam medidas de líquido específico também é descrito. 3,5 Ambos os ensaios foram caracterizadas em detalhada. 5 A MPO-ADN e ADN-HNE ensaios ELISA são quantitativos e NET-específica ao mesmo tempo . 5 Esses recursos não são preenchidas por qualquer outro método atual. Os ensaios são fáceis de realizar e fornecer dados reprodutíveis. 5 A etapa DNase digestão limitada está incluído o que garante a manipulação rápida e padronizada de redes directamente sobre os neutrófilos. 5 Estes ensaios são adequados para compare várias amostras ao mesmo tempo. Em novas medições, de controlo mostra-se que os ciclos de congelamento / descongelamento e proteases não afectam o resultado dos ensaios de MPO-ADN e ADN-HNE. Não se sabe, contudo, se as proteínas que se sabe ligarem ao ADN em redes (incluindo histonas e LL-37) 1,11 iriam interferir com estes ensaios.
As etapas críticas dos protocolos apresentados são os seguintes. É importante colher os neutrófilos que estão em um repouso, estado de repouso e não liberam grande quantidade de redes espontaneamente. A falta de um passo de lise hipotónico para remover as células vermelhas do sangue no protocolo de isolamento de neutrófilos apresentada é crucial para se obter os neutrófilos não activados. Para inibir a activação de neutrófilos após as células terem sido purificado, é também importante para ressuspender neutrófilos num meio contendo soro de seu próprio dador. Para obter células quiescentes é também crucial para usar reagentes pyrogen- e livre de contaminação durante a preparação de neutrófilos. Spontaliberação NET rs os de neutrófilos durante o ensaio de liberação de DNA extracelular também poderia acontecer. A adição de 1% de soro autólogo ao meio de ensaio é importante para o impedir. Doses mais elevadas ou mais baixas de soro autólogo pode ser testado para obter resultados óptimos. É crítico durante o MPO-ADN e ensaios de ELISA de HNE-ADN que libertado ADN não deve ser excessivamente digerido pela ADNase porque vai resultar na perda completa do sinal. Portanto, a dose ideal deve ser determinada para cada novo lote DNase. Os parâmetros da digestão do DNA pode ser ligeiramente alterada para obter sinais possível a maior ELISA. É também importante para misturar a ADNase e redes cuidadosamente para garantir que a ADNase terá acesso claro para o ADN. Ao colher as redes digeridos, lavar o bem extensivamente para coletar todas as redes.
O limite de detecção do ADN do MPO-ADN e ensaios de ADN-HNE é de cerca de 10-20 ng de ADN ml / (Figura 5B). Os níveis séricos e DNA livre no plasma de Severai cem a mil ng / ml foram relatados em doenças (cancro, lúpus eritematoso sistémico, infecção do miocárdio) que têm sido associados com a formação anormal NET 12-14. Isto sugere que os ensaios de MPO-ADN e ADN-HNE ELISA também têm o potencial para ser capaz de quantificar as redes em amostras clínicas humanas. Esta futura aplicação da MPO-DNA e ensaios HNE-DNA ELISA permitirá ligar quantitativamente redes para patogênese da doença.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
- Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
- Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
- Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
- Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205 (2013).
- Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
- Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
- Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
- Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).
