Un flusso di lavoro metaproteomica Aquatic microbica: dalle celle ai Trittico Peptidi per l'analisi basata su spettrometria di massa tandem

Sommario

Questo protocollo è per l'estrazione e la concentrazione di proteine e DNA da biomassa microbica raccolta dall'acqua di mare, seguita dalla generazione di peptidi triptici adatti per l'analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa tandem.

Abstract

Le tecnologie meta-omiche come la metagenomica, la metatrascrittomica e la metaproteomica possono aiutare nella comprensione della struttura e del metabolismo della comunità microbica. Sebbene potente, la metagenomica da sola può solo chiarire il potenziale funzionale. D'altra parte, la metaproteomica consente di descrivere il metabolismo espresso in situ e la funzione di una comunità. Qui descriviamo un protocollo per la lisi cellulare, l'isolamento di proteine e DNA, nonché la digestione e l'estrazione di peptidi da cellule microbiche marine raccolte su un'unità filtrante a cartuccia (come l'unità filtrante Sterivex) e conservate in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA (come RNAlater). Negli studi di proteomica basati sulla spettrometria di massa, l'identificazione di peptidi e proteine viene eseguita confrontando gli spettri di massa tandem dei peptidi con un database di sequenze nucleotidiche tradotte. L'inclusione del metagenoma di un campione nel database di ricerca aumenta il numero di peptidi e proteine che possono essere identificati dagli spettri di massa. Quindi, in questo protocollo il DNA viene isolato dallo stesso filtro, che può essere utilizzato successivamente per l'analisi metagenomica.

Introduzione

I microrganismi sono onnipresenti e svolgono ruoli essenziali nel cicli biogeochimici della Terra ^1. Attualmente, ci sono numerosi approcci molecolari disponibili per caratterizzare la struttura comunità microbica e funzione. Più comune è l'analisi del gene 16S rRNA sequenze PCR-amplificato dal DNA ambientale ^2-4. Uno svantaggio di analisi del gene 16S rRNA è che fornisce solo informazioni sull'identità filogenetica e struttura della comunità, con poche informazioni sulla funzione metabolica. Al contrario, approcci come metagenomica, metatranscriptomics e metaproteomica forniscono informazioni sulla struttura delle comunità e il metaboli....

Protocollo

1. Preparare Reagenti

1. Preparare la soluzione SDS-estrazione: 0.1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% glicerolo, EDTA 10 mM e 1% SDS. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro e conservare 0,22 micron a 4 ° C.
2. Preparare i reagenti azionari necessari per il gel di poliacrilammide.
   1. Preparare 1.5 M Tris-HCl pH 8.8. Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente.
   2. 0.5 M Tris-HCl pH 6.8. Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente.
   3. Preparare 10% SDS. Filtro sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente.
3. Pre....

Risultati

A dimostrazione, abbiamo eseguito il protocollo su due campioni di acqua di mare prelevati dalla superficie e la clorofilla massima del mare costiera nel nord del Canada. Mentre in mare, 6-7 L di acqua di mare è stato passato attraverso un 3 micron GF / D prefiltro, quindi le cellule microbiche sono state raccolte su un filtro di 0,22 micron unità cartuccia seguendo il protocollo di Walsh et al. ^20. Le cellule sono state immediatamente memorizzati in una soluzione di stabilizzatore RNA fino al proced.......

Discussione

Conservazione del campione è fondamentale per gli studi metaproteomic e lavoro precedente ha dimostrato che una soluzione di stabilizzazione RNA è un buffer di archiviazione utile per conservare le cellule prima dell'estrazione delle proteine ^​​28. Idealmente, i campioni dovrebbero essere conservati in situ di negare cambiamenti nell'espressione delle proteine ​​durante la movimentazione ^33,34. Infatti, in situ sono state sviluppate tecnologie di campionamento e di fissagg.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sterivex -GP 0.22 μ m unità filtrante	Millipore	SVGP01050	Campionamento
RNAlater Soluzione di stabilizzazione	Ambion	AM7021	Campionamento
Tris	Bio Basic	77-86-1 o TB0196-500G	Gel SDS PAGE
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Estrazione di proteine
SDS	Bio Basic	15-21-3	Estrazione di proteine / Gel SDS PAGE
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Estrazione di proteine
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Estrazione
di proteineFiltro Amicon 10K	Millipore	UFC801024	Estrazione di proteine
Metanolo	Sigma-Aldrich	179337-4L	Precipitazione di proteine
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1	Precipitazione di
proteine MPC Reagente di precipitazione di proteine	Epicentro	mmP03750	Precipitazione del DNA
2-propanolo	Fisher Scientific	67-63-0	Precipitazione del DNA
Kit di analisi Qubit dsDNA BR	Life Technologies	Q32850	Kit
analisi delle proteine Qubit	Life Technologies	Q33211	Quantificazione delle proteine
Saccarosio	Bio Basic	57-50-1	Gel SDS PAGE
TEMED	Bio Rad	161-0800	Gel SDS PAGE
APS	Bio Rad	161-0700	Gel SDS PAGE
30% Acrilammide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glicina	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoetanolo	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Campione tampone	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Caleidoscopio Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Tripsina digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Tripsina digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Tripsina digest
Acido formico	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsin digest
HPLC grado H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Tripsina digestato
Iodoacetamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Tripsina digestato Tripsina
	Promega	V5111	In-gel Tripsina digest
Protein LoBind Tube 1,5 ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2 ml ROBO fiala 9 mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	Digestato di tripsina in gel
Inserto in PP BM, senza molla	Candian Life Science	4025P-631	Digestato di tripsina in gel

Estrazione di proteine / Estrazione di proteine di per quantificazione del DNA