Summary
Long-term dyrket interferon-γ enzymbundet immunospot assay blir anvendt som et mål på sentralhukommelsesresponser og korrelerer med beskyttende antimykobakteriell vaksine responser. Med denne analysen, er perifere mononukleære blodceller stimulert med mykobakterielle antigener og interleukin-2 i 14 dager, som muliggjør differensiering og utvidelse av sentrale minne-T-celler.
Abstract
Effektor og hukommelse T-celler er generert gjennom utviklings programmering av naive celler etter antigen anerkjennelse. Hvis infeksjonen er under kontroll inntil 95% av T-celler som genereres under ekspansjonsfasen er eliminert (ie., Sammentrekning fase) og minne T-celler forblir, noen ganger i en mannsalder. Hos mennesker har to funksjonelt distinkte undergrupper av T-celler minne blitt beskrevet på grunnlag av ekspresjon av lymph node homing reseptorer. Sentrale hukommelses T-celler uttrykker CC kjemokinreseptor 7 og CD45RO og er hovedsakelig lokalisert i T-celleområder av sekundære lymfeorganer. Effector minne T-celler uttrykker CD45RO, mangler CCR7 og vise reseptorer forbundet med lymfocytter homing til perifere eller betent vev. Effektor-T-celler ikke uttrykker enten CCR7 eller CD45RO men ved møte med antigen produsere effektor cytokiner, såsom interferon-γ. Interferon-γ frigivelse analyser anvendes for diagnostisering av bovin og human tuberkulose ogoppdage primært effektor og effektor minne T celle responser. Sentrale minne T-celleresponser hos CD4 + T-celler til vaksinering, på den annen side, kan brukes til å forutsi vaksineeffektivitet, som demonstrert med simian immunsviktvirus infeksjon av ikke-menneskelige primater, tuberkulose hos mus, og malaria hos mennesker. Flere studier med mus og mennesker, samt upubliserte data på storfe, har vist at interferon-γ ELISPOT analyser måle sentrale minne T-celle responser. Med denne analysen, perifere mononukleære blodceller dyrkes i avtagende konsentrasjon av antigen i 10 til 14 dager (langtids kultur), slik at effektor responser til topp og avta; tilrettelegge sentrale minne-T-celler til å differensiere og ekspandere i kulturen.
Introduction
Effektor og minne-T-celler blir generert gjennom utviklings programmering av naive CD4 + T-celler etter antigen gjenkjennelse. Differensiering av naive CD4 + T celler i cytokin produserende celler krever patogen anerkjennelse av medfødte immunceller, antigen presentasjon til T-celler, co-stimulering og transkripsjons endringer som resulterer i polarisert cytokinproduksjon. For eksempel: antigenpresenterende celler produserer interleukin (IL) -12 i respons til intracellulære patogener, som sammen med antigen gjenkjennelse, fremmer differensiering av T-celler til T-hjelper 1 (Th1) -celler 1,2 ved signalisering gjennom signal transduseren og aktivator av transkripsjon 4 (STAT4) og T-box uttrykt i T-celler (T-bet), som fører til celle-aktivering, IL-2-produksjon, klonal ekspansjon og interferon (IFN) -γ produksjon 3,4. Hvis infeksjonen er under kontroll, er opp til 95% av T-cellene som genereres under ekspansjonsfasen fjernet (dvs. sammentrekningfase) og minne T-celler forblir, noen ganger for en levetid 5. Sallusto et al. 6, åpenbarte to funksjonelt distinkte undergrupper av minne-T-celler hos mennesker basert på ekspresjon av lymph node homing reseptorer. Sentrale minne T-celler (TCM) uttrykke CC kjemokinreseptor (CCR) -7 og CD45RO og er hovedsakelig lokalisert i T-celle områder av sekundære lymfoide organer. Tcm har begrenset effektorfunksjon, en lav terskel aktivering og beholde høy IL-2-produksjon og proliferativ kapasitet. Effector minne T-celler (TEM) uttrykke CD45RO, mangler CCR7 og visnings reseptorer for homing til perifere eller betent vev. Effektorceller ikke uttrykker enten CCR7 eller CD45RO men straks produsere effektor cytokiner, for eksempel IFN-γ, ved antigen gjenkjennelse.
IFN-γ utslipp analyser (IGRA) brukes for diagnostisering av bovin og menneskelig tuberkulose 7. Mycobacterium bovis er det viktigste middel for bovin tuberkulose (BTB) mens menneskelig cases av tuberkulose er forårsaket hovedsakelig av Mycobacterium tuberculosis. Med disse tester, helt blod eller perifere mononukleære blodceller (PBMC) stimulert med mykobakterielle antigener i 16 til 24 timer og IFN-γ produksjonen i supernatanten målt ved ELISA eller ved påvisning av celler som produserer IFN-γ ved hjelp av ELISPOT teknikker. Som følge av den korte perioden stimulering (ie., 16 til 24 timer), og hurtig cytokin produksjon, ex vivo-analyser detektere hovedsakelig effektor og Tem responser. Dette har blitt bekreftet av strømningscytometrisk analyse av cellepopulasjoner i disse kulturene 8-10.
Ex vivo-IFN-γ responser blir rutinemessig inkludert i immunresponsen panel evaluering av tuberkulose vaksiner, inkludert de som brukes til å evaluere responser hos storfe. De fleste effektive storfe tuberkulosevaksiner lokke fram konkrete IFN-γ svar, men ikke alle vaksiner som induserer IFN-γ responser er Skyddse. Også nivåer av IFN-γ utløst ved vaksinasjon, målt før infeksjon, ikke nødvendigvis korrelerer med beskyttelse. For eksempel kan ulike BCG-stammer har ulike kapasiteter for å indusere ex vivo IFN-γ respons, på tross av lignende beskyttelsesnivå 11. Dermed ex vivo IGRAs er verdifulle for tuberkulose diagnose og for å få tilgang til vaksine immunogenisitet; derimot, er deres bruk som predikator for vaksineeffekt begrenset. TCM respons på vaksinering, på den annen side, kan brukes til å forutsi vaksineeffektivitet, som demonstrert med simian immunsviktvirus (SIV) infeksjon hos ikke-humane primater 12,13, tuberkulose hos mus 14 og malaria hos mennesker 15,16.
Etter en effektiv immunrespons som resulterer i patogen clearance, blir Tcm vedlikeholdes og gi beskyttelse til en eventuell andre infeksjon av det samme middel. Et bemerkelsesverdig unntak til dette scenariet er M. tuberkulose infeDette skjer av mennesker der pasienter som får kurativ antimykobakteriell terapi er utsatt for re-infeksjon 17,18. I tillegg hendelser styrende immunologisk minne under kroniske infeksjoner, hvor antigenstimulering vedvarer, er ikke godt forstått 19. Under kroniske infeksjoner, for eksempel med humant immunsviktvirus (HIV) og tuberkulose, er en betydelig Tcm respons forbundet med et positivt resultat (for eksempel ventetid med tuberkulose og subklinisk sykdom med HIV) 20,21. Flere studier med mus og mennesker har vist at langtids dyrkede IFN-γ ELISPOT analyser måle Tcm svar 16,20-22. Med denne analyse PBMC dyrket i avtagende konsentrasjon av antigen i 10 til 14 dager, slik at effektor responser til topp og avta; tilrettelegge Tcm å differensiere og utvide i kulturen.
Long-term dyrkede IFN-γ ELISPOT-analyser har også vært anvendt i veterinærforskning, men fenotypen til responderende celler som har vært vanskelig å bedømme på grunn av en mangel på kritiske reagenser, spesielt et antistoff til CCR7. Effektive storfe tuberkulosevaksiner [eg. ved hjelp av en enkelt dose av M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), etterfulgt BCG av viral-vectored Antigen 85A subenhetsvaksine eller dempes M. bovis ΔRD1] lokke fram langsiktige kultur IFN-γ ELISPOT svar etter vaksinasjon som korrelerer med beskyttelse (dvs. lavere mycobacterial byrde og redusert TB-assosiert patologi) mot senere utfordring med virulent M. bovis 23,24. Videre antall antigen-spesifikke IFN-γ-sekresjon celler innenfor langsiktige PBMC kulturer er høyere på 12 måneder, men reduseres i 24 måneder etter BCG-vaksinasjon av nyfødte kalver, korrelerer med graden av beskyttelse påviselig post M. bovis utfordring 25. I dette scenariet, er kultivert IFN-γ ELISPOT enn viktig verktøy for å forutsi vaksineeffekt, noe som gir et middel til å prioritere vaksinekandidater for høye kostnader effektstudier. I tillegg kan dyrkede ELISPOT teknikker tilpasses for forskjellige verter, patogener og cytokiner ved å forandre antigener eller antistoffer for en rekke formål i forskjellige forskningsfelt.
Protocol
1. Forbered følgende løsninger
- Forbered komplett RPMI (cRMPI) ved tilsetning av føtalt bovint serum (FBS) til en konsentrasjon på 10% (volum / volum), glutamin (2 mM), natriumpyruvat (1 mM), ikke-essensielle aminosyrer (0,1 mM), penicillin -streptomycin (100 enheter / ml penicillin og 0,1 mg / ml streptomycin) og 2-merkaptoetanol (50 mM) i RPMI 1640.
- Forbered 2 X syresitratdekstrose, ved å blande natriumcitrat (77 mM), sitronsyre (38 pM), og dekstrose (122 uM), i destillert vann.
- Forbered Ca2 + Mg2 + fri fosfatbufret saltvann (PBS) pH 7,2: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), 2 Na HPO 4 (dibasisk, 10 mM), KH 2PO 4 (monobasisk, 2 mM) i destillert vann; justere pH til 7,2.
- Forbered PBS 1% (1% BSA PBS) ved tilsetning av bovint serumalbumin i PBS (volum / vekt, 1 g / 100 ml PBS).
- Forbered PBS + 0,05% tween 20(PBST) ved tilsetning av 0,05% Tween 20 i PBS (volum / volum, 500 ul Tween 20/1 l PBS).
- Forbered 100 mM Tris-HCl pH 8,2-buffer ved å blande Tris (100 mM), HCl (0,50 mM) i destillert vann.
- Forbered 35% etanoloppløsning ved fortynning av etylalkohol (renhet ≥99.5%) i destillert vann (volum / volum, 35 ml etylalkohol / 100 ml destillert vann).
- Filter sterilisere cRPMI, 2 x syresitratdekstrose, PBS, PBS 1% BSA ved bruk av 0,22 pm filtre.
2. Langsiktige dyrkede celler (14 Dag Protocol)
(Dag en)
- Forbered antigen løsninger til to ganger den endelige konsentrasjonen i cRPMI. Antigen valg er kritisk og bør være tilpasset formålet med undersøkelsen.
- Fortynne rekombinant M. tuberkulose antigener og antigen TB10.4 Ag85A til 2 ug / ml (av hvert antigen; sluttkonsentrasjonen er 1 mikrogram / ml).
- Fortynnet M. bovis renset protein derivat(PPD-B, Prionics Ag) til 10 ug / ml (sluttkonsentrasjonen er 5 ug / ml).
- Fortynn den rekombinante tidlig sekretoriske antigene mål 6 (ESAT-6) og kulturfiltratet protein 10 (CFP-10) fusjonsprotein (RESAT-6: CFP10) til 2 ug / ml (sluttkonsentrasjon på 1 pg / ml).
NB! Disse antigener er immunodominant IFN-γ induserende antigener av tuberkuløse mykobakterier, og kan være inkludert for å stimulere PBMC fra M. bovis smittet dyr. BCG eller M. bovis ΔRD1 vaksinerte dyr ikke svare på RESAT-6: CFP10, som regionen koder disse antigenene (dvs. RD1) er slettet i disse stammene. RESAT-6: CFP10 brukes i disse studien var en slags gave fra Dr. C. Minion, Iowa State University. TB10.4 og antigen Ag85A er immunodominante antigener tilstede i virulente og vaksine M. bovis stammer 37. PPDB, som et renset protein-derivat, er et kompleks av flere antigener, inkludert antigener som deles med ikke-tuberkuløse mykobakterier. Infected dyr vil potensielt svare på alle antigener (nemlig: TB10.4, Ag 85A, RESAT-6: CFP10 og PPDb), mens vaksinerte dyr ikke bør svare på RESAT-6: CFP10 11. - Plate 500 ul / brønn av antigen-oppløsning i quadruplicates for hvert dyr i en 24-brønners plate. For denne protokollen, bruker antigener som en pool; dermed bruke alle brønnene inneholder alle antigener og ingen kontroller (for eksempel, null eller mitogen) dette trinnet. Inkuber platen ved 39 ° C / 5% CO2. Den normale temperatur av storfe er 39 ° C; således, at en del forskere utnytte 39 ° C for dyrking av bovine celler. Også, i visse tilfeller med humane celler, gir cellekultur ved 39 ° C fordelen 26,30.
- Pre-load sprøyter kombinert med 16 eller 18 G sprøyter med 6 ml 2 X syre citrate-dekstrose; og samle 60 ml bovint blod ved halsvenepunksjon.
- Isoler PBMC av standard densitetsgradientsentrifugering av perifert blod buffycoat fraksjonerjustering av cellekonsentrasjonen til 4 x 10 6 celler / ml som beskrevet av Maue et al. 27
- Legg celler (500 ul / brønn) i antigen forbelastet 24 brønners plate, i fire eksemplarer for hvert dyr (trinn 2.5). Inkuber platen ved 39 ° C / 5% CO2.
(Days tre og sju)
- Ved å bruke steril teknikk, fjern forsiktig 500 ul av supernatanten fra hver brønn uten å forstyrre cellelaget.
- Fylle brønnvolum ved tilsetning av 500 ul / brønn cRPMI inneholdende IL-2 (30 U / pl, dvs. 15 U / brønn, rekombinant humant IL-2 Sigma I7908). Inkuber platen ved 39 ° C / 5% CO2.
(Dager 10 og 12)
- Ved å bruke steril teknikk, fjerne 750 pl av supernatanten fra hver brønn. Fylle volumet med 750 ul / brønn av cRPMI (uten IL-2). Inkuber platen ved 39 ° C / 5% CO2.
(Dag én (12. dag Langsiktig kultur protokoll))
- Merke ELISPOT plate skikkelig for hvert sett av prøver, for å unngå feil når plating celler: langsiktige celler pluss antigenpresenterende celler (APC), langsiktige celler uten APC og ex vivo / kortsiktig celler (figur 1). Replikater for hver behandling (dvs. antigenstimulering) bør gjøres minst i duplikat.
- Forbered fangst-antistoff-løsning ved fortynning av muse-anti-bovin IFN-γ antistoff (MCA2112, klone CC330) i PBS (8 ug / ml).
- Ved hjelp av en multikanalpipette pre-fukter brønnene i ELISPOT-plate med 15 ul / brønn av 35% etanol i 1 min. For å forhindre membranskade, må du ikke berøre bunnen av brønner med pipetter på noe tidspunkt under analysen.
- Platen vaskes seks ganger med 300 ul / brønn PBS. Vaskefluidet skal kastes etter plate inversjon. Vasker bør gjøres raskt, ikke slik at platebrønnene tørke.
- Pipetter 100 ul / brønn av fangst anti-IFN-γ antistoff (fra trinn 1 ovenfor). Inkuberes ved 4 ° CO / N (holde plate inne i en glidelås oppbevaringspose).
(Dag to (13. dag av den langsiktige kultur Protocol))
- Forbered antigen løsninger på to ganger endelig konsentrasjon. Behandlinger er: ingen stimulering (cRPMI), PPD-B (20 pg / ml, sluttkonsentrasjon: 10 ug / ml), protein cocktail av TB10.4 og Ag85A (2 ug / ml av hvert protein, sluttkonsentrasjon: 1 ug / ml av hvert protein), RESAT-6: CFP10 (for M. bovis-infeksjon, 2 ug / ml, sluttkonsentrasjon: 1 pg / ml), og en positiv kontroll, for eksempel pokeweed (20 ug / ml, sluttkonsentrasjon: 10 ug / ml). Andre mitogen kan brukes i stedet for PWM (f.eks Concanavalin A).
MERK: for dette trinnet antigener komponere fire forskjellige behandlinger og er not brukes som et basseng (som i trinn 2.5). De fire behandlinger er: NS, PPDb, protein cocktail (TB10.4 og Ag85A utgjør en behandling) og PWM.
4. Kortsiktige Cell Kultur og Adherent Cell (APC) Isolation
- Samle 60 ml blod fra de samme dyrene Bled på dag 1 (under: langsiktig kultur, 14 dagers protokollen) og isolere PBMCer som før.
- Juster cellekonsentrasjonen til 2 X 10 6 celler / ml. Merk rør klart å hindre misallocation når plating celler. Disse cellene vil bli brukt til APC isolasjon og også som kortsiktig cellekultur (trinn 6.5). Merk rør med både dyret nummer og type kultur (i dette tilfellet: ex vivo, kortsiktig eller friske celler).
- Fjern overflødig fangst antistoff fra ELISPOT av plate inversjon. Vask plater 6 ganger med 300 ul PBST.
- Fjern så mye PBST som mulig. Pipetter 50 mL av cellesuspensjoner til brønnene merket som langsiktige celler pluss APC. Block andre wells med 200 mL / brønn cRPMI. Inkuber 90 min ved eller 39 ° C. Pre-varm cRPMI eller 39 ° C (nødvendig for etterfølgende trinn). Friske PBMC ikke benyttes til heft celle (APC) isolering vil være nødvendig i etterfølgende trinn, og bør lagres.
5. dyrkede celler
- I løpet av 90 min inkubasjon (trinn 4.4, kortsiktig kultur og tilhenger celle isolasjon trinn), slakte langsiktige dyrkede celler.
- Ved hjelp av 5 eller 10 mL pipetter, pipettesmedie med celler opp og ned for å løsne cellene, kombinere fire eksemplarer gjentak fra hvert dyr i en enkelt 15 ml tube. Sentrifuger rørene i 5 min ved 400 g.
- Etter sentrifugering, kast supernatanten ved tube inversjon. Løsne cellepellet. Tilsett 5 ml PBS, forsiktig re-suspen pellet, om nødvendig. Gjenta sentrifugering. Gjenta vasketrinn to ganger. Kast supernatanten ved tube inversjon og forsiktig re-suspendere celler i 1 ml cRPMI. Juster cellekonsentrasjonentil 2 x 10 5 celler / ml.
6. Plating Frisk og kultivert PBMCer
- Etter 90 minutters inkubering, rist platene på platerister i 30 sek. Fjerne ikke-adherente celler fra plate inversjon. Pipetter 150 ul / brønn av varm cRPMI (fra trinn 4, i henhold til: Short-term-celler og adherent celle (APC) isolasjonstrinnet).
- Rist plater og kast vask væske. Gjenta vaske tre ganger. Tilsett 100 ul / brønn av hvert antigen i hensiktsmessige brønner (pre-merket).
- Til plate celler, pipette 100 mL / brønn langsiktig dyrkede cellesuspensjon (2 x 10 5 celler / ml) i brønnene merket som langsiktige celler pluss APC. Sørg for at de langsiktige celler lagt i dette trinnet er fra samme dyret som APC er allerede i brønnen. Ikke bland APC og langsiktige dyrkede celler fra forskjellige dyr.
- Pipetter 100 ul / brønn av den langsiktige dyrket cellesuspensjon (2 x 10 5 celler / ml) i brønner uten APCs for vurdering av APC kravet til langtidskultur respons.
- Tilsett 100 ul / brønn kortsiktige celler (fersk isolert og justert til 2 x 10 6 celler / ml) for ex vivo respons vurdering. Inkuber platene O / N ved 39 ° C / 5% CO 2 inkubator. Pass på at platene ligger flatt og ikke stable platene.
MERK: Hvis analyse av celle fenotype er ønsket, strømningscytometri kan utføres som en hjelpe-assay. Celler blir sådd ut i 96-brønners U bunnplater (i stedet for ELISPOT-plater) som beskrevet for ELISPOT-analyse. Capture antistoff adsorpsjon (trinn 3.4 til 3.5) skal hoppes. Celler blir så inkubert O / N ved 39 ° C / 5% CO2 og et standard cellefarging protokoll utført. Cell Fargingsreagensmidlene er inkludert i tabellen reagenser.
Dag tre (14 th dag i Long-term kultur protokoll)
- Fortynn deteksjon-antistoff (mus anti-bovin IFN-γ, klone CC302) til 5 ug / ml i PBS 1% BSA. Kast væske fra brønner og vaske tallerkener: seks ganger med PBST (300 mL / brønn), omsetning shaker hver gang i 10 sek før og ytterligere 6 ganger i mellom vasker, en gang med dH 2 O (300 mL / brønn), med PBST (300 ul / brønn) og to ganger med PBS (300 pl / brønn). Etter at cellene blir fjernet fra platene, og hvis ingen bekymringer for biologisk anvendelse, fremgangsmåter kan gjennomføres utenfor biologisk sikkerhetsskap.
- Kast Vaskefluidet. Fjern så mye vask væske som mulig ved å trykke plate på tørkepapir. Legg deteksjon-antistoff (100 ul / brønn).
- Inkuber platene i 120 minutter ved 39 ° C. eller I løpet av denne innkuberingstrinn, forberede alkalisk fosfatase løsningen etter produsentens anvisninger. Tretti minutter før bruk (dvs. 90 minutter etter tilsetningen av påvisningsantistoff til brønner) fortynne reagensen i PBST. Snu røret forsiktig for å blande reagensene og inkubert ved RT.
- Etter 120 min inkubasjon forkaste overflødig deteksjonsantistoff av plate inversjon. Vask plate 6 ganger med PBST (300 mL / brønn). Fjern så mye vask væske som mulig ved å trykke plate på tørkepapir.
- Tilsett 100 ul / brønn av alkalisk fosfatase-oppløsning (fra trinn 3 ovenfor). Inkuber platene i 45 minutter ved RT. Kast væsken og vask hver plate seks ganger med PBST (300 mL / brønn).
- Forbered substratoppløsningen følge produsentens instruksjoner (Vector Blå AP substrat III): Fortynn reagenser i 100 mM Tris HCL pH 8,2 buffer. Pipetter 50 ul / brønn av en substratløsning.
- Inkuber ved RT inntil blåfargen begynner å utvikle seg (ca. 30 min). Kast væsken og vaske tallerkener med store mengder dH 2 O. Fjern bunnplaten for å eksponere membran, vaske baksiden av brønner og la platen lufttørke.
- Les plater på immunospot bildeanalysator eller ELISPOT leser (tabell 1), eller manuelt, ved hjelp av et stereomikroskop. Alternativt holde plateri mørke ved RT til lesing. På grunn av den høye stabilitet av reaksjons substratet blir kvalitet bevares i flere år.
MERK: Celler og antigenkonsentrasjoner ble optimalisert for å unngå brønner med utallige flekker 23,24,27,37. Det er mulig at utallige flekker dannelse oppstå i ulike sammenhenger, eller som følge av biologisk variasjon. Hvis det er tilfelle, bør cellekonsentrasjonen optimaliseres slik at en lesbar sted telle respons oppnås.
7. Plates Lese- og dataanalyse
- Utføre analyser som per Cellular Technology Limited (CTL) ELISPOT plateleser anvisning (tabell 1). Etter Flekkene tellinger blir oppnådd for hver av brønnene, beregne den gjennomsnittlige mellom duplikater. Den spesifikke immunrespons for hver antigen stimulus blir beregnet ved å subtrahere den gjennomsnittlige antall plasser i ikke-stimulerte brønner fra den av antigen-stimulerte brønner.
Representative Results
Omtrent en måned etter aerosol infeksjon med M. bovis (10 fire kolonidannende enheter), PBMC fra infiserte (n = 8) og kontrolldyrene (n = 8) ble dyrket i nærvær av antigener og IL-2 i 13 dager. Utvikling av TCM responser etter infeksjon ble bestemt ved hjelp av IFN-γ ELISPOT-analyse. Representative Tcm (i nærvær eller fravær av APC-er) og ex vivo IFN-γ ELISPOT responser fra infiserte dyr (tre dyr) og en ikke-infiserte dyr (et dyr) er vist i figur 1. En vellykket langsiktig IFN-γ ELISPOT analyseresultatene i celler som produserer IFN-γ (spot-forming celler, SFC) under stimulert forhold og nærheten fravær av et svar fra ikke-infiserte dyr og under ikke-stimulerte forhold. Dessuten bør en sterk T-celle respons opptrer som respons på PWM. Spesifikke svar på M. bovis ble vurdert av PPD-B eller RESAT-6: CFP10 antigenstimulering. Som vist i figur1, robust Tcm og ex vivo responser til PPD-B og RESAT-6: CFP10 ble oppdaget fra alle tre M. bovis -infected dyr. Minimal til ingen TCM og ex vivo responser ble detektert fra kontrolldyret. Også tilstedeværelse av APC var nødvendig for optimale Tcm svar av infiserte dyr, som vist ved sterkt redusert respons ved langtids celler dyrket i fravær av autologe APCer. IFN-γ respons av PBMC fra M. bovis infiserte og ikke-infiserte dyr er vist i figur 2. Antallet SFCs fra hvert dyr ble beregnet som det gjennomsnittlige antall SFCs i dobbeltprøver som respons på PPD-B minus den respektive reaksjon på mediene alene. Svarene ble estimert til 10 6 celler. Svarene var forskjellige (p <0,05) basert på infeksjonsstatus, tilstedeværelse eller fravær av APC og kultur varighet (f.eks., Langtidskultur versus ex vivo kultur).
| Anskaffelse bilde av plater | |
| 1. | Slå på maskinen |
| 2. | Open "Immuno Capture" versjon 6.3 software. |
| 3. | Trinn 1: Velg plate type. |
| 4. | Trinn 2: load plate. |
| 5. | Trinn 3: velg skannealternativer. |
| 6. | Trinn 4: starte skanningen. |
| 7. | Skaffe oversikt bilde av plate. |
| 8. | Løs ut plate. |
| 9. | Avslutt "Immuno Capture" programvare. |
| Telle spot forming units | |
| 1. | Åpne "Immuno Spot Capture" versjon 5.0 software. |
| 2. | Velg målsettinger t Type: normal. |
| 3. | Velg telling modul: smart teller. |
| 4. | Trinn 1: last plate. |
| 5. | Trinn 2: definere telle parametre: test nøyaktigheten av sted anerkjennelse på brønner med forskjellige steder. |
| 6. | Starte auto teller. |
| Kvalitetskontroll | |
| 1. | Open "immunospot Capture" versjon 5.0 software. |
| 2. | Velg telling modul: kvalitetskontroll. |
| 3. | Trinn 1: last plate. |
| 4. | Trinn 2: Analyser uthevede brønner individuelt. |
| 5. | Fullfør kvalitetskontroll. |
Tabell 1 - AutoImmun Diagnostika ELISPOT leseren bilde oppkjøpet og celle teller prosedyre.
ove_content "fo: keep-together.within-side =" always ">
Figur 1. Bilde av brønner fra en langsiktig kultivert IFN γ ELISPOT analysen. Cultured IFN-γ ELISPOT analysen ble utført approximatelyone måned etter utfordring med virulent M. bovis (tre dyr). Ikke-infiserte dyr ble inkludert som kontroller (ett dyr) Langsiktige cellelinjer ble generert ved å stimulere PBMC med en cocktail av rekombinant Ag85A (1 mikrogram / ml), TB10.4 (1 mikrogram / ml), RESAT-6.: CFP10 (1 pg / ml) og PPD-B (5 ug / ml) i 13 dager, etterfulgt av overføring til ELISPOT plater i nærvær eller fravær av autolog APC. Kortsiktige celler besto av PBMC isolert på dag 13 og belagt direkte inn ELISPOT plater. Langsiktige og kortsiktige celler ble stimulert med PPD-B (10 mikrogram / ml), RESAT-6: CFP10 (1 mikrogram / ml), medium alene eller pokeweed mitogen (5 &# 956; g / ml) i 24 timer.
Figur 2. Representative resultater fra en langsiktig kultivert IFN γ ELISPOT respons på M. bovis renset protein derivat. Cultured IFN-γELISPOT assay (-B PPD) ble utført approximatelyone måned etter utfordring med virulent M. bovis (åtte dyr). Ikke-infiserte dyr ble inkludert som kontroller (åtte dyr Long-term-celler ble samlet ved å stimulere PBMC med en cocktail av rekombinant Ag85A (1 pg / ml), TB10.4 (1 pg / ml), RESAT-6: CFP10 (1 ug / ml) og PPD-B (5 ug / ml) i 13 dager, etterfulgt av overføring til ELISPOT platene i nærvær eller fravær av autologe APCer. Omløps celler besto av PBMC isolert på dag 13 og belagt direkte inn i ELISPOT plate . Langsiktig og short-term-celler ble stimulert med PPD-B (10 pg / ml) eller medium alene i 24 timer. Spesifikke svar fra hvert dyr (SFC / 10 6 celler) er presentert som respons på PPD-B (gjennomsnitt av dobbeltprøver) minus den respons til mediene alene.
Discussion
IFN-γ produksjonen i langsiktige kultur ELISPOT-analyser er vanligvis på grunn av Tcm hos mennesker, men hvordan dette svaret utvikler seg i kulturen er dårlig forstått. Enten Tcm er til stede i sirkulasjon og ekspandere in vitro, eller hvis TCM reaksjoner skyldes differensiering av effektor og Tem celler til Tcm under kultur er ikke kjent. Men studier med prøver fra mennesker har funnet ut at CD4 + T-celler fra ex vivo og langsiktige kultivert IFN-γ ELISPOT-analyser har urelaterte epitope særegen, noe som tyder på at Tcm svar ikke utvikle seg fra effektorcellene 28. Selvfølgelig kan varigheten av responsen variere, men hvis patogen clearance er oppnådd, eventuelt både ex vivo og TCM responser avta. Også svarene av langsiktige kulturer målt tidlig og lenge etter antigen priming (når effektor responsen er lavere) er vist å korrelere, noe som indikerer at sirkulerende Tcm populasjoner tidlig og lenge etter antilende priming forblir beslektet in vivo. På den annen side, gjør størrelsen av ex vivo-respons ikke ut til å være relatert til størrelsen av minnerespons 29. Disse resultater antyder at langtids dyrkede IFN-γ ELISPOT responser resulterer fra in vitro ekspansjon av TCM og en tilhørende avtagende av effektor-responser i prøven, i stedet for differensiering av effektorceller i Tcm fenotype.
Med storfe, er det relative bidraget av effektor og hukommelse delmengder til responser som detekteres av langsiktige IFN-γ ELISPOT-analysen ikke kjent. Nyere studier tyder på en sammenheng mellom vaksine fremkalte langsiktige kultur IFN-γ ELISPOT svar og beskyttelse mot senere eksperimentell infeksjon med M. bovis 23-24. Det har blitt rapportert at svake langtids IFN-γ ELISPOT respons på vaksinering er forbundet med fraværet av beskyttelse 30. Både live og drepeed vaksiner indusere lignende ex vivo IFN-γ ELISPOT svar, men vaksinering med levende BCG utløser sterkere langsiktig kultur IFN-γ ELISPOT svar enn gjør drept vaksinepreparater. Interessant, levende vaksiner er beskyttende mens drept formuleringer unnlater å gi beskyttelse mot utfordring med virulent tuberkuløs mykobakterier 31-32, 33.
Vurdering av Tcm responser er også mulig ved å sortere disse cellene fra PBMC. Direkte berikelse av Tcm fra PBMC krever imidlertid dyre enheter, høyt utdannede personlig og er vanskelig som disse cellene er ikke mange i blodet. Langsiktig kultur av PBMC gir berikelse av Tcm løpet Tem og effektorcellene uten dyre enheter; Men fordi disse T-cellepopulasjoner blir ekspandert in vitro de kan være mindre representativ for in vivo hukommelsesresponser. Det er mulig å få tilgang til IFN-γ hukommelsesresponser (ved hjelp av langvarig kultur eller Tcm slaging strategier) av andre enn ELISPOT analyser som: cytokin ELISAer 34, cytokin perle arrays (CBA), intracellulær farging (ICS), eller cytokin protein arrays (CPA). Disse metodene; men er generelt mindre følsomme enn ELISPOT-analysene 35.
En fordel med ELISPOT er dens evne til å detektere den umiddelbare fangst av cytokinet kort tid etter at den ble sluppet hindre fortynning i supernatanten og nedbrytning ved enzymatisk spaltning eller cytokin opptak av andre celler. ELISPOT-analyser detektere enkeltceller produserer cytokiner som gir nøyaktige resultater selv i svakt signal til støy scenarier (dvs. lave spesifikke responser) 35. Også, med ICS, kan påvisning av cytokiner før frigjøring resultere i falske identifikasjon av celler som produserer cytokiner (f.eks., På grunn av post-translasjonell modulasjon før eller under den sekretoriske prosess) 34. Transport hemmere ansatt med ICS-analyser for å minimere cytokinsekresjonunder antigen stimulering (kjent som Golgi-trinns-proteiner) for å begrense varigheten av cellestimulering på grunn av celletoksisitet av disse proteinene til slutt påvirker cytokinproduksjon 35.
Med det sagt - CBA, CPA og ICS er nyttige teknikker for måling av flere cytokiner samtidig og / eller for å bestemme celleoverflatemarkør ekspresjon (dvs. med ICS.). Derfor kan disse metodene bli anvendt i kombinasjon med IFN-γ ELISPOT-analyse 36. Mens tidligere bovin tuberkulose vaksine effektstudier målt Tcm svar via ELISPOT analysen, vil påvisning av Tcm svar av andre teknikker sannsynlig gi sammenlignbare resultater. Viktigere er ELISPOT-analysen mindre kostbart og enklere å utføre enn CBA, CPA og ICS analyseteknikker 34. Manuell telling av SFC er et alternativ til automatisk telling, og ELISPOT plater kan lagres ved romtemperatur i lengre tid med minimalt tap av kvalitet, før eller etter stedet counting 37.
Den langsiktige kultivert IFN-γ ELISPOT responsen har vært brukt for å vurdere minne svar av menneskelig og kyr ved vurdering av tuberkulose vaksine svar 14-16,31-32,33. Tcm svar antas også å spille viktige roller i verts svar på flere andre smittestoffer fra storfe, som for eksempel:. Mycoplasma mycoides subsp mycoides 42, Anaplasma Marginale 38 og bovin respiratorisk syncytialt virus 39. Potensielt kan på lang sikt ELISPOT-analyse tilpasses for andre dyrearter, cytokiner og infeksjoner. Disse bredere søknader vil være spesielt nyttig for veterinær immunologi applikasjoner grunnet dagens begrensede tilgjengeligheten av spesifikke reagenser.
Tcm svar er avgjørende for beskyttelse mot flere infeksjoner, men måle dem tidlig etter infeksjon / immunisering (for sykdom utfallet prediksjon eller vaksineeffekt) may være tungvint. Analyse av immunresponsen i henhold til ex vivo og korte antigenstimulering forhold vil oftere representere effektor reaksjoner, på grunn av overlappingen av hukommelse og effektor-reaksjoner, spesielt i begynnelsen av immunologisk hukommelse formasjonen. I sammenheng med kroniske sykdommer hvor antigenet lasten er kontinuerlig, vil ex vivo responser vurdere effektor-cellere eller en kombinasjon av hukommelse og effektor-celle responser. Den langsiktige dyrket IFN-γ ELISPOT-analyse, som er beskrevet her, sannsynligvis muliggjør måling av TCM responser i stedet for effektor-T-celle-eller kombinerte CD4 + T-celleresponser. Oppsummert gir langvarig dyrket IFN-γ ELISPOT-analyse en verdifull metode for estimering T-celle hukommelsesresponser og har vært anvendt med hell for å evaluere hukommelsesresponser av flere arter av en rekke infeksjoner midler 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forskning ble støttet av USDA, ARS Cris: 3625-32000-104 og Landbruks- og matdepartementet Forskningsinitiativet Competitive Grant no. 2011-67015-30736 fra USDA National Institute of Food and Agriculture. Vi takker Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen, og Tracy Porter for deres utmerkede teknisk assistanse samt Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille, Jay Steffen, David Lubbers Robin Zeisness, og David Panthen for utmerket omsorg og behandling av dyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium citrate (dihydrate) | Various | ||
| Citric acid (monohydrate) | Various | ||
| Dextrose | Various | ||
| ELISPOT PVDF plate | Various | ||
| Vectastain ABC – AP KIT Standard | Vector Laboratories | AK-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5300 | |
| Ag85A | Lionex | LRP-0004.3 | 23, 24, 25, 37 |
| TB 10.4 | Lionex | LRP-0061.6 | 23, 24, 25, 37 |
| PPDb | Prionics AG | 7600055 | |
| rESAT-6:CFP10 | Kind gift Dr. Minion, Iastate | 23, 24, 25, 27, 37 | |
| Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 | Serotec | MCA1783B | 23, 24, 25, 27, 37 |
| Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 | Serotec | MCA2112 | 23, 24, 25, 27, 37 |
| Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 | Serotec | MCA1653GA | |
| Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A | Serotec | MCA2434GA | |
| Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 | Abcam | ab95665 | |
| Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 | Serotec | MCA1783PE | |
| Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 | Invitrogen | A-21130 | |
| Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 | SouthernBiotechnology | 1080-193 | |
| Goat anti-rat IgG-APC | Invitrogen | A10540 | |
| BD Cytofix/Cytoperm™ | BD Biosciences | 554714 | |
| BrefeldinA | Sigma-Aldrich | B7651 | |
| Pokeweed Mitogen | Sigma-Aldrich | L8777 | |
| Recombinat human Interleukin 2 | Sigma-Aldrich | I7908 |
References
- Szabo, S. J., Kim, S. T., Costa, G. L., Zhang, X., Fathman, C. G., et al. Novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Mullen, A. C., High, F. A., Hutchins, A. S., Lee, H. W., Villarino, A. V., et al. Role of T-bet in commitment of Th1 cells before IL-12-dependent selection. Science Signaling. 292 (5523), 1907 (2001).
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. Journal of immunology. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Lighvani, A. A., Frucht, D. M., Jankovic, D., Yamane, H., Aliberti, J., et al. T-bet is rapidly induced by interferon-gamma in lymphoid and myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15137-15142 (2001).
- Masopust, D., Picker, L. J. Hidden memories: frontline memory T cells and early pathogen interception. Journal of immunology. 188 (12), 5811-5817 (2012).
- Sallusto, F., Lenig, D., Förster, R., Lipp, M., Lanzavecchia, A. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature. 401 (6754), 708-712 (1999).
- Waters, W. R., Palmer, M. V., Thacker, T. C., Davis, W. C., Sreevatsan, S., et al. Tuberculosis immunity: Opportunities from studies with Cattle. Clinical and Developmental Immunology. 2011 (1), 1-11 (2011).
- Whelan, A. O., Villarreal-Ramos, B., Vordermeier, H. M., Hogarth, P. J. Development of an antibody to bovine IL-2 reveals multifunctional CD4 T(EM) cells in cattle naturally infected with bovine tuberculosis. PLoS ONE. 6 (12), e29194 (2011).
- Streitz, M., Tesfa, L., Yildirim, V., Yahyazadeh, A., Ulrichs, T., et al. Loss of receptor on tuberculin-reactive T-cells marks active pulmonary tuberculosis. PLoS ONE. 2 (8), e735 (2007).
- Soares, A. P., Scriba, T. J., Joseph, S., Harbacheuski, R., Murray, R. A., et al. Bacillus Calmette-Guérin vaccination of human newborns induces T cells with complex cytokine and phenotypic profiles. Journal of immunology. 180, 3569-3577 (2008).
- Waters, W. R., Palmer, M. V., Buddle, B. M., Vordermeier, H. M. Bovine tuberculosis vaccine research: historical perspectives and recent advances. Vaccine. 30 (16), 2611-2622 (2012).
- Letvin, N. L., Mascola, J. R., Sun, Y., Gorgone, D. A., Buzby, A. P., et al. Preserved CD4+ central memory T cells and survival in vaccinated SIV-challenged monkeys. Science. 312 (5779), 1530-1533 (2006).
- Mattapallil, J. J., Douek, D. C., Buckler-White, A., Montefiori, D., Letvin, N. L., et al. Vaccination preserves CD4 memory T cells during acute simian immunodeficiency virus challenge. The Journal of experimental medicine. 203 (6), 1533-1541 (2006).
- Lindenstrom, T., Knudsen, N. P. H., Agger, E. M., Andersen, P. Control of Chronic Mycobacterium tuberculosis .infection by CD4 KLRG1- IL-2-secreting central memory cells. The Journal of Immunology. 190 (12), 6311-6319 (2013).
- Todryk, S. M., Bejon, P., Mwangi, T., Plebanski, M., Urban, B., et al. Correlation of memory T cell responses against TRAP with protection from clinical malaria, and CD4 CD25 high T cells with susceptibility in Kenyans. PLoS ONE. 3 (4), e2027 (2008).
- Webster, D. P., Dunachie, S., Vuola, J. M., Berthoud, T., Keating, S., et al. Enhanced T cell-mediated protection against malaria in human challenges by using the recombinant poxviruses FP9 and modified vaccinia virus Ankara. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (13), 4836-4841 (2005).
- Rie, A., Warren, R., Richardson, M., Victor, T. C., Gie, R. P., et al. Exogenous reinfection as a cause of recurrent tuberculosis after curative treatment. New England Journal of Medicine. 341 (16), 1174-1179 (1999).
- Caminero, J. A., Pena, M. J., Campos-Herrero, M. I., Rodríguez, J. C., Afonso, O., et al. Exogenous reinfection with tuberculosis on a European Island with a moderate incidence of disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (3), 717-720 (2001).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A., Araki, K., Ahmed, R. From vaccines to memory and back. Immunity. 33 (4), 451-463 (2010).
- Millington, K. A., Gooding, S., Hinks, T. S. C., Reynolds, D. J. M., Lalvani, A. Mycobacterium tuberculosis.-specific cellular immune profiles suggest bacillary persistence decades after spontaneous cure in untreated tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 202 (11), 1685-1689 (2010).
- Su, L. F., Kidd, B. A., Han, A., Kotzin, J. J., Davis, M. M. Virus-specific CD4(+) memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults. Immunity. 38 (2), 373-383 (2013).
- Goletti, D., Butera, O., Bizzoni, F., Casetti, R., Girardi, E., Poccia, F. Region of difference 1 antigen-specific CD4+ memory T cells correlate with a favorable outcome of tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 194 (7), 984-992 (2006).
- Waters, W. R., et al. Efficacy and immunogenicity of Mycobacterium bovis. DeltaRD1 against aerosol M. bovis. infection in neonatal calves. Vaccine. 27 (8), 1201-1209 (2009).
- Hope, J. C., et al. Identification of surrogates and correlates of protection in protective immunity against Mycobacterium bovis. infection induced in neonatal calves by vaccination with M. bovis. BCG Pasteur and M. bovis. BCG Danish. Clinical and Vaccine Immunology. 18 (3), 373-379 (2011).
- Thom, M. L., et al. Duration of immunity against Mycobacterium bovis. following neonatal vaccination with bacillus Calmette-Guérin Danish: significant protection against infection at 12, but not 24, months. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (8), 1254-1260 (2012).
- Aabye, M. G., Ravn, P., Johansen, I. S., Eugen-Olsen, J., Ruhwald, M. Incubation of whole blood at 39°C augments gamma interferon (IFN-γ)-induced protein 10 and IFN-γ responses to Mycobacterium tuberculosis .antigens. Clinical and vaccine immunology : CVI. 18 (7), 1150-1156 (2011).
- Maue, A. C., Waters, W. R., Davis, W. C., Palmer, M. V., Minion, F. C., Estes, D. M. Analysis of immune responses directed toward a recombinant early secretory antigenic target six-kilodalton protein-culture filtrate protein 10 fusion protein in Mycobacterium bovis.-infected cattle. Infection and Immunity. 73 (10), 6659-6667 (2005).
- Godkin, A. J., Thomas, H. C., Openshaw, P. J. Evolution of epitope-specific memory CD4(+) T cells after clearance of hepatitis C virus. Journal of immunology. 169 (4), 2210-2214 (2002).
- Todryk, S. M., et al. The relationship between human effector and memory T cells measured by ex vivo and cultured ELISPOT following recent and distal priming. Immunology. 128 (1), 83-91 (2009).
- Vordermeier, H. M., et al. Viral booster vaccines improve Mycobacterium bovis. BCG-induced protection against bovine tuberculosis. Infection and Immunity. 77 (8), 3364-3373 (2009).
- Orme, I. M. Induction of nonspecific acquired resistance and delayed-type hypersensitivity, but not specific acquired resistance in mice inoculated with killed mycobacterial vaccines. Infect. Immun. 56 (12), 3310-3312 (1988).
- Griffin, J. F., Mackintosh, C. G., Slobbe, L., Thomson, A. J., Buchan, G. S. Vaccine protocols to optimise the protective efficacy of BCG. Tubercle and lung disease : the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 79 (3), 135-143 (1999).
- Buddle, B. M., et al. Protection of cattle from bovine tuberculosis by vaccination with BCG by the respiratory or subcutaneous route, but not by vaccination with killed Mycobacterium vaccae. Research in veterinary science. 59 (1), 10-16 (1995).
- Lehmann, P. V., Zhang, W. Unique strengths of ELISPOT for T cell diagnostics. Methods in Molecular Biology. 792 (Chapter 1), 3-23 (2011).
- Tincati, C., Iii, A. J. C., Snyder-Cappione, J. E. Distinguishing latent from active Mycobacterium tuberculosis. infection using Elispot assays: looking beyond interferon-gamma). Cells. 1 (2), 99-99 (2012).
- Lash, G. E., Pinto, L. A. Multiplex cytokine analysis technologies. Expert review of vaccines. 9 (10), 1231-1237 (2010).
- Vordermeier, M., Whelan, A. O. ELISPOT assays to enumerate bovine IFN-γ-secreting cells for the development of novel vaccines against bovine tuberculosis. Methods in molecular biology. 792, 219-227 (2012).
- Han, S., Norimine, J., Palmer, G. H., Mwangi, W., Lahmers, K. K., Brown, W. C. Rapid deletion of antigen-specific CD4+ T cells following infection represents a strategy of immune evasion and persistence for Anaplasma marginale. Journal of immunology. 181 (11), 7759a-7769a (2008).
- Helden, M. J. G., et al. Pre-existing virus-specific CD8(+) T-cells provide protection against pneumovirus-induced disease in mice. Vaccine. 30 (45), 6382-6388 (2012).
