Summary
Met behulp van hoge-resolutie differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie, is een ex vivo observatie van de afstraffing van beweeglijke ependymale cilia gelegen binnen de hersenen van muizen ventrikels aangetoond live-imaging. De techniek maakt een opname van het unieke ciliaire slaan frequentie en hoek slaan en hun intracellulaire calcium oscillatie stimulatie eigenschappen.
Abstract
Multiciliated ependymale cellen lijn de ventrikels in de volwassen hersenen. Abnormale functie of structuur van ependymale cilia wordt geassocieerd met verschillende neurologische stoornissen. De huidige ex vivo voor live beeldvorming van beweeglijke ependymale cilia techniek maakt het mogelijk om een gedetailleerde studie van ciliaire dynamiek na verschillende stappen. Deze stappen omvatten: muizen euthanasie met kooldioxide volgens de protocollen van de Universiteit van Toledo Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC); craniectomy gevolgd door de hersenen te verwijderen en sagittale hersenen dissectie met een vibratome of scherp mes om zeer dunne secties te verkrijgen door de hersenen laterale ventrikels, waar de ependymale cilia kunnen worden gevisualiseerd. Incubatie van plakjes van de hersenen in een aangepaste glazen bodemplaat bevattende Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM) / hoog-glucose bij 37 ° C in aanwezigheid van 95% / 5% O 2 / CO 2 mengsel is essentieel voor het weefsel in leven gedurendehet experiment. Een video van de trilharen kloppend wordt vervolgens opgenomen met een hoge resolutie differentiële interferentie contrast microscoop. De video wordt vervolgens geanalyseerd frame voor frame aan de ciliaire kloppend frequentie te berekenen. Dit maakt aparte indeling van de ependymale cellen in drie categorieën of types op basis van hun ciliaire kloppend frequentie en de hoek. Bovendien is deze techniek maakt gebruik van high-speed fluorescentiebeeldvorming analyse om de unieke intracellulaire calcium oscillatie eigenschappen van ependymale cellen en het effect van farmacologische middelen op calcium oscillaties en de ciliaire slaan frequentie karakteriseren. Bovendien is deze techniek geschikt voor immunofluorescentie beeldvorming voor ciliaire structuur en ciliaire eiwit lokalisatie studies. Dit is vooral belangrijk bij de diagnose van ziekte en fenotype studies. De grootste beperking van deze techniek is toegeschreven aan de vermindering van levende beweeglijke cilia beweging als het hersenweefsel begint te sterven.
Introduction
Trilharen sensorische microtubule gebaseerde organellen die zich uitstrekken van het celoppervlak naar de extracellulaire omgeving. Afhankelijk van de microtubuli organisatie kan cilia worden onderverdeeld in twee types - "9 + 0" of "9 + 2". Functioneel, op basis van hun beweeglijkheid, kunnen deze worden beschouwd als beweeglijk of onbeweeglijk cilia 1. Primaire cilia is een term die vaak gebruikt om aan te geven "9 + 0" niet-beweeglijke trilharen. Deze negen parallel doublet microtubules (aangeduid met "9") en een centraal paar microtubuli ontbreekt in de centrale schacht (aangeduid met "0"). Echter, sommige "9 + 0" cilia, zoals nodale cilia, die embryo lateralisatie reguleren zijn beweeglijk 2. Anderzijds zijn beweeglijke cilia kenmerk, naast de negen parallelle microtubule doubletten, met een bijkomend centraal paar microtubuli doubletten en onderworpen aan dynein motoreiwitten motiliteit vergemakkelijken. Bovendien hebben sommige "92 "cilia zoals olfactorische cilia onbeweeglijk 3. Ependymale cellen die de hersenen ventrikels en het centrale kanaal van het ruggenmerg gekenmerkt door beweeglijke trilharen de cerebrospinale vloeistof (CSF) langs de hersenen ventrikels 4 voortbewegen.
Het algemene doel van deze methode is om te vergemakkelijken het bestuderen van de beweeglijke trilharen dynamiek en structurele afwijkingen. Gezondheid en ontwikkeling van de hersenen sterk afhankelijk van een efficiënte verspreiding van CSF in de hersenen ventrikels. Bijvoorbeeld, normale CSF stroming vochtbalans vereisen normaal kloppen en functionele ependymale cilia 5,6, wat weer spelen cruciale rol bij het reguleren van de gerichte beweging van neuronale cellen en stamcellen celmigratie 7. Als zodanig abnormale ependymale cilia functie of structuur kan leiden tot abnormale liquorcirculatie, die wordt geassocieerd met hydrocephalus, een medische aandoening waarbij er een abnormale ophoping van CSF in de ventrikels van de bregen. Dit kan dus leiden tot verhoogde intracraniële druk en progressieve uitbreiding van het hoofd, stuiptrekkingen, tunnelvisie en mentale handicap 8.
Het voordeel van deze techniek boven bestaande werkwijzen is dat het toegestaan voor het eerst drie verschillende ependymale celtypes bericht: I, II en III op basis van hun unieke ciliaire slaan frequentie en hoek slaan. Deze ependymale cellen zijn gelokaliseerd in bepaalde gebieden in de hersenen ventrikels. Bovendien kunnen de effecten van leeftijd en farmacologische middelen zoals alcohol en cilostazol op het veranderen van de ependymale celtypen of de lokalisaties aangetoond, die voorheen niet mogelijk deze classificatie van ependymale cellen. Cilostazool is een remmer van fosfodiesterase-3, een enzym dat cAMP metaboliseert AMP en regelt tevens intracellulair calcium 9. Met behulp van high-speed fluorescentiebeeldvorming analyse maakt beeldvorming en kwantificeren van de unieke intracellulairecalcium oscillatie eigenschappen van de ependymale cellen. Bijvoorbeeld, zowel alcohol als cilostazool significant de ependymale ciliaire kloppende frequentie en de intracellulaire calcium oscillaties eigenschappen, wat weer kan leiden tot een verandering in de cerebrospinale vloeistof volume vervanging door ependymale cilia 10 veranderd. Kortom, deze techniek was de sleutel tot het eerste bewijs van drie verschillende types van ependymale cellen met verschillende calcium oscillatie eigenschappen.
In het volgende hoofdstuk wordt een gedetailleerde stap-voor-stap overzicht van de procedure, met veel aandacht voor het prepareren van weefsels en handling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedures voor het gebruik van dieren werden door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Toledo goedgekeurd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de National Institutes of Health en de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
1. Brain Extraction, Sectioning en Tissue Voorbereiding
- Sacrifice wild-type muis stam C57BL / 6 door diep euthanasie met CO 2 stikken voor 5 min. Verzeker dood door cervicale dislocatie.
- Maak de muis hoofd met 70% ethanol.
- Voer craniectomy met steriele schaar en pincet door eerst trekken de huid af, te beginnen met de bovenkant van het hoofd om de schedel bloot te leggen.
- Dan, wanneer de schedel bloot, verwijdert de schedel door het afpellen het beenstuk per stuk, uitgaande van het achterste kant en verplaatsen naar de voorste zijde. Wees voorzichtig niet naar de hersenen ventrikels vernietigen.
- Verzamel de hele hersenen.
- Plaats de hersenen in een 100 mm petrischaal met DMEM / hoog glucosegehalte aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine-oplossing die 10.000 eenheden / ml penicilline en 10000 ug / ml streptomycine en voorverwarmd tot 37 ° C.
- Snijd de hersenen op de mediane sagittale vlak met de hand met een scherp mes, en de eerste 100-200 mm doorsnede van elke helft met een vibratome verkrijgen.
- Spoel het hersenweefsel met voorverwarmd 37 ° C fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS) oplossing.
- Het onmiddellijk plaatsen hersenpreparaat in DMEM / High-glucose media voorverwarmd tot 37 ° C.
2. Live-Imaging Configuratie en instellingen
- Plaats het hersenweefsel secties 30 mm glazen bodem kweekschalen met 1 ml DMEM / hoge-glucose media. Stel de microscoop gesloten kamer omgeving 37 ° C, 95% / 5% O 2 / CO 2 gehalte (figuur 1
- Met behulp van een 60X objectief olie-immersie lens, het verzamelen van de ependymale cellen / cilia beelden door eerst een olie druppel op de 60X objectief en zich te concentreren op de cellen met regelmatige DIC doorgelaten licht.
- Volg dan de richting van de DMEM bubble beweging als een leidraad voor de locatie van de beweeglijke ependymale cilia als ciliary afranselingen creëren een soort zeepbel beweging in het gebied. Kies een gebied met gezonde cellen met beweeglijke cilia in de hersenen van de laterale ventrikel met behulp van de DIC filter. Zodra de ependymale cilia zijn gevonden, pas het licht en focus om een bevredigend resultaat krijgt.
- De Directe imaging parameters volgens een specifiek doel behulp Metamorph beeldverwerkingssoftware. In de huidige demonstratie verwerven vierentwintig-bits afbeeldingen met de camera binning ingesteld op 1 x 1 in combinatie met 60X objectieve en 5-10 msec belichtingstijd.
- Verzamel de DIC beelden van het oog tot een minimum exp hebben openen van de microscoop opening tot een optimaalComposure tijd. Observeer live beelden streamen naar de camera snel en onmiddellijke beeldacquisitie leveren zonder vertraging. Bereken de snelheid van cilia slaan op basis van het vereiste van de minimale blootstellingstijden onvoldoende beeldcontrast te verkrijgen.
3. Data Visualization en Analyse
- Bereken het aantal trilharen afranselingen door het tellen van het aantal slagen in 1 min. Doe dit door het verlagen van de snelheid van het beeld en het tellen van het aantal slagen met een celteller of iets dergelijks.
- Om de frequentie van de slagen Vermenigvuldig de belichtingstijd waarin de video wordt opgenomen door het aantal frames of time-lapse beelden die het aantal seconden krijgen. (Voorbeeld: belichtingstijd 5 msec 200 frames = 1000 msec of 1 sec).
- Bereken het aantal slagen in één seconde op de frequentie die wordt uitgedrukt als het aantal verslagen per één seconde te verkrijgen. Doe dit door het delen van het aantal cilia slagen meer dan een one-tweede keer interval (Voorbeeld: cilia slaat 50 keer in een 200 frames video opgenomen met belichtingstijd van 5 msec ie 5 msec x 200 frames = 1 seconde; nu verdelen 50 slagen per 1 sec = 50 Hz).
- Bereken de ciliaire kloppend hoek door het evalueren van de weg die door de ependymale cilia tijdens zowel de kracht en het herstel beroertes. Voer deze volgens een eerder beschreven werkwijze, met kleine modificaties 11. De precieze beweging van de individuele cilia wordt waargenomen tijdens de volledige slag cyclus.
- Op een acetaat vel geplaatst over de monitor, trek een horizontale lijn langs de ependymale rand en een verticale lijn door de middellijn positie van de trilharen in het begin van de macht beroerte.
- Plot de precieze positie van het cilium frame per frame als het beweegt naar voren tijdens de arbeidsslag. Op soortgelijke wijze plot de beweging van de trilharen in de herstel slag.
- Bereken de ciliaire kloppende hoek van de maximale afwijking van de cilium van de middellijn in tHij macht beroerte, evenals het herstel beroerte.
4. Calcium Signal Recording
- Na het doorsnijden van de hersenen, even uitspoelen hersenen slice met 1x PBS of Dulbecco's PBS (pH 7,0). Bereid vers Fluo-2 fluorescentie quenching voorkomen en een goede signaal-ruisverhouding te verkrijgen.
- Bereid 1 mM voorraadoplossing van Fluo-2-oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO), meng en vortex de oplossing gedurende ten minste 5 minuten zodat Fluo-2 homogeen opgelost in DMSO.
- Verdun de Fluo-2 voorraadoplossing in 500 ml DMEM / hoog glucosegehalte aangevuld met 2% B27 voorverwarmd tot 37 ° C tot een uiteindelijke concentratie van 20 mg / ml.
OPMERKING: B-27 is een geoptimaliseerde serumvrij supplement met vitamine A, antioxidant cocktail en insuline gebruikt korte- of lange-termijn overleving van de hippocampus en andere CZS-neuronen te ondersteunen. - Onmiddellijk incubeer de hersenen segment met 20 mg / ml Fluo-2 gedurende 30 min bij 37 ° C in een glazen bodemplaat.
- Om de optimale belading calciumconcentratie fluorofoor Fluo-2 te bepalen en calcium kleurstof cel toxiciteit, challenge cellen met ATP te vermijden, en controleer de cellevensvatbaarheid door het bepalen van het tijdsverloop en de piekwaarde van calciumsignalen in reactie op ATP.
- Noteer de video calcium oscillatie bij een opnamesnelheid van 5 msec gedurende minstens 1 seconde (200 frames per seconde), met excitatie en emissie golflengten van 488 nm en 515 nm respectievelijk (Film 2).
- Om de Fluo-2 calcium signaal van autofluorescentie of beweging artefacten te onderscheiden, ervoor zorgen dat de intensiteiten uitgezonden bij 515 nm afzonderlijk wordt gecontroleerd.
OPMERKING: Fluo-2 niet de calcium fluoremetric geschikte intracellulaire calcium kwantificeren. Het is echter een uitstekend dynamisch calcium kleurstof snel calcium verandert, zoals calcium oscillaties te detecteren. Voor nauwkeurigere calcium kwantificering, Fura-2 aanbevolen. De dynamische veranderingen van Fura-2 wordt beperkt door de ratiometrischeaard van de kleurstof. - Volg de formules van de fabrikant naar de exacte intracellulaire calcium te berekenen. Voorbeeld [Ca2 +] = K x d (R - R min) / (Rmax - R). Waar Kd de dissociatieconstante van de kleurstof uit de vrijgegeven calcium, R de gemeten fluorescentie bij 488 en Rmin en Rmax zijn het fluorescentie verhoudingen bij minimale en maximale ionenconcentratie 12.
5. immunofluorescentiemicroscopie
- Bevestig de hersencoupes met fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 4% paraformaldehyde (PFA) en 2% sucrose gedurende 10 min. Als alternatief, bevestig de hele hersenen met 4% PFA en vervolgens sectie in 50 mm delen met behulp van een cryostaat.
- Was het weefsel driemaal met 1x PBS gedurende 5 min per keer.
- Incubeer de hersenen slice met een solution van 0,1% Triton-X in 1x PBS gedurende 5 minuten en spoel driemaal met 1x PBS gedurende 5 min per keer.
- Incubeer de hersenen segment met muis primair antilichaam, antiacetylated a-tubuline, gebruikt bij een verdunning van 1: 5000 in 10% FBS in 1x PBS gedurende een uur bij kamertemperatuur (KT) of overnacht bij 4 ° C.
- Was het weefsel driemaal met 1x PBS gedurende 5 min per keer.
- Incubeer de hersenen slice in secundair antilichaam, fluoresceïne anti-muis-IgG bij een verdunning van 1: 500 in 10% FBS in 1x PBS oplossing gedurende 1 uur bij KT.
- Voordat observatie onder een fluorescentiemicroscoop, tegenkleuring het gedeelte met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) gedurende 5 min naar de nucleus (of DNA) 13 bevlekken. Om fotobleken, imago van de secties onmiddellijk te minimaliseren met een minimale blootstelling mogelijke tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Meten ependymale cilia functie in levende muis hersenen
De werkwijze beschreven in dit protocol wordt gebruikt om ependymale cilia en structuur in het verse weefsel losgesneden van muizenhersenen en te controleren en te bestuderen cilia slaan frequentie luisteren. De stappen gevolgd om volledig experiment bereiken afgebeeld op schematische stroomdiagram (figuur 1). Het wordt sterk aanbevolen dat het experiment wordt uitgevoerd binnen een kort tijdsbestek om de beweeglijke cilia zo actief mogelijk te houden. Een vertegenwoordiger van time-lapse film en beelden van de ependymale cellen en hun beweeglijke trilharen worden ook getoond (Film 1 en figuur 2a). Data-analyse in de verkregen stroom bereikt door het tellen van het slaan en de hoek patroon van de bewegende cilia. De criteria voor de trilharen in drie types delen worden weergegeven in tabel 1. De aanwezigheid van ependymale cilia is confirmed met ciliaire marker, geacetyleerde-a-tubuline en de ependymale cellen tegengekleurd met DAPI (DNA marker) naar de nucleus tonen (Figuur 2b). Op basis van onze waarnemingen van ependymale cellen in de hersenen laterale ventrikel van ten minste 22 onafhankelijke experimenten, waren we in staat om ependymale cellen te classificeren in drie typen op basis van de ciliaire kloppende frequentie. Bovendien hebben we aangetoond dat ethanol 0.25% concentratie de onderdrukt cilia kloppen frequentie ongeacht het type (Figuur 3). Wat nog belangrijker is, deze gegevens in samenhang met onze eerdere bevindingen 10.
Het meten van calcium signalering door ependymale cilia
Het is eerder aangetoond dat het buigen van cilia een cilium-afhankelijke intracellulaire calcium signalering 14-16 kan leiden. Deze techniek stelt onderzoekers onderzoeken en meten van de intracellulaire calcium signaal in de hersenen ventrikels
Figuur 1:. Ependymale cilia imaging protocol flowchart Ependymale cilia imaging protocol illustreert stappen om een experiment vanaf muis brainextraction, snijden en weefsel voorbereiding op het verwerven en analyseren voltooien. Een benadering een uur tijdlijn wordt gepresenteerd met stap-voor-stap procedure.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 52.853 / 52853fig2.jpg "/>
Figuur 2:. Ependymale cilia lokalisatie in de hersenen ventrikels Hier worden ependymale cellen van het laterale ventrikel van een muizenhersenen. (A) DIC beelden van individuele ependymale cellen (onderste pijlen) en cilia (bovenste pijlen) getoond. (B) Een overlay-beeld van een sectie hersenen is gekleurd met antilichaam tegen een ciliary marker, geacetyleerd a-tubuline, in het groen (top pijlen), en tegengekleurd met een nucleaire / DNA-merker, DAPI, weergegeven in blauw (bodem pijlen) . Houdt u er rekening mee dat panelen a en b vertegenwoordigen verschillende hersenen secties.
Figuur 3:. Alcohol en verschillen in trilharen verslaan van frequenties tussen soorten ependymale cellen van de muis hersenen laterale ventrikel De ex vivo hersenen slice werd geïncubeerd zonder (Control) of (Ethanol) 0,25% alcohol gedurende 5 min. In vergelijking met controle, alcohol behandeling significant af cilia slaan frequentie, zoals aangeduid door een sterretje. Ten minste 5-10 onafhankelijke preparaten werden voor elke ependymale celtype en behandelingsgroep.
Film 1: Registratie van ependymale cilia in type III ependymale cellen Hier worden opnames van ependymale cilia, gekenmerkt door het verslaan van de frequentie en de hoek die uniek zijn voor III ependymale cellen te typen van de hersenen van de derde ventrikel.. Dit cijfer werd eerder gerapporteerd 10 en werd met toestemming gebruikt.
Movie 2: Intracellulaire calcium oscillatie in ependymale cellen Hier worden opnames van calcium oscillaties van ependymale cellen door een deel van de laterale ven de hersenen.tricle na incuberen van de hersenen segment met 20 mg / ml calcium indicator Fluo-2, gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Calciumgehalte van de sectie hersenen werd bestudeerd en pseudo-gekleurd. De kleur balk geeft calciumgehalte van de ependymale cellen; waar de zwart-paars en rood-geel vertegenwoordigen lage en hoge calciumgehalte, respectievelijk. Voor intracellulair calcium kwantificering vindt ependymale cel calcium worden berekend uit meerdere afzonderlijke ependymale cellen, zoals in het protocol tekst en gemiddeld tussen de controle- en behandelingsgroepen. De video van calcium oscillatie werd opgenomen in 200 frames per seconde met excitatie en emissie golflengten van 488 nm en 515 nm respectievelijk. Dit cijfer werd eerder gerapporteerd 10 en werd met toestemming gebruikt.
| Ependymale celtype | Cilia kloppend frequentie | Cilia kloppend hoek |
| Type I | > 60 Hz | <90 ° |
| Type II | 30-60 Hz | 90-135 ° |
| Type III | <30 Hz | > 135 ° |
Tabel 1:. Soorten ependymale cilia De indeling van ependymale cilia in type I, II of III is voornamelijk gebaseerd op het kloppende frequentie en slaan hoek van ependymale cilia zich in afzonderlijke hersengebieden derde ventrikel. Delen van deze gegevens zijn eerder gerapporteerd en werden hier met toestemming gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven is een protocol voor de voorbereiding van de muis hersenweefsel voor zowel live beeldvorming en fluorescentiemicroscopie dat een snelle en gevoelige nauwe observatie van de ependymale cilia biedt in de hersenen ventrikels. Deze techniek is niet beperkt tot de laterale ventrikel; het kan worden gebruikt om de cilia andere hersenventrikels observeren. Deze beeldvormende techniek zorgt voor een live stream, dat de beweging van de CSF door ciliaire kloppend lijkt in een ex vivo setting. Bovendien maakt de analyse van de gerichte beweging van de trilharen. Dit wordt met name vergemakkelijkt door het gebruik van een hoge resolutie DIC en fluorescentie beeldvormingssysteem. Een voordeel van dit systeem is dat de microscoop is ingesloten in een klimaatkamer, waardoor een fijnregeling van de temperatuur, vochtigheid en CO 2 niveaus. Dit zijn zeer kritische parameters die moeten worden beschouwd voor de overleving van cellen en weefsels bij het uitvoeren van live-imaging experiments. Het systeem is ook voorzien van automatische XY en Z modules en een digitale camera en golflengtefilter switcher, die allemaal belangrijke kenmerken voor beeldvorming van dynamische cellulaire gedrag zoals cilia verkeer te vergemakkelijken. De microscoop is aangesloten op een computer en het verkrijgen van afbeeldingen van hoge kwaliteit wordt vergemakkelijkt door imagingsoftware.
Met behulp van deze techniek om ependymale cellen te delen in verschillende typen biedt een aanzienlijke verbetering ten opzichte van bestaande / vorige methoden die worden gebruikt om ependymale cilia bestuderen. Zo kan het effect van bepaalde farmacologische of toxische middelen zoals alcohol anderszins worden geminimaliseerd of uitgesloten indien ependymale cellen worden beschouwd als een populatie 17. Het is belangrijk om in gedachten dat, ondanks het feit dat de kenmerken van cilia slaan frequenties en hoeken zeer verschillend tussen deze drie soorten ependymale cilia, zijn we begonnen met de fysiologie van deze cellen begrijpen houden. VandaarVolgens onze eerdere werk ons classificatie robuust genoeg als de procedure correct wordt uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol.
Het identificeren van verschillende ependymale cilia is van fundamenteel belang om een basiskennis van ependymale fysiologie krijgen. Deze methode maakt het mogelijk onderscheid te maken tussen de drie verschillende typen ependymale cellen uniek en specifiek gepositioneerd binnen het derde ventrikel met betrekking tot het slaan en -hoek, leidend tot de indeling in drie verschillende types (Tabel 1). Om te bevestigen dat de verschillen in trilharen slaan frequenties zijn niet te wijten aan verschillen in de levensvatbaarheid van de ependymale cellen of verschillen in de dieren tijd wordt aanbevolen dat alleen intact en geschakelde ependymale strips of schijven die zijn aangesloten op neuronaal weefsel en minimaal 100 mm dikte worden gebruikt. Bovendien moet ciliaire slaan frequentie gemeten op verschillende plaatsen langs elk ependymale sectie. We hebben eerder aangetoond dat ciliaire slagfrequentie gegevens die met deze techniek consequent reproduceerbaar tussen 87 experimentele waarnemingen 10 is. Vandaar dat ependymale cellen nauwkeurig geclassificeerd, afhankelijk van hun ciliary pak slaag. Bovendien mag bij farmacologische middelen die bekend zijn bij de ciliaire slaan frequentie te verlagen, de trilharen kloppende frequentie theoretisch genormaliseerd slaan frequentie na verwijdering van deze farmacologische agentia.
Een kritische stap in dit protocol heeft voornamelijk betrekking op de behandeling van de hersenweefsel en de benodigde tijd voor de proef te voltooien. Het is noodzakelijk om het hersenweefsel voorzichtig behandelen, zodat de structuur en functie van ependymale cilia behouden en om trauma te reduceren tot de fragiele weefsel. Belangrijker en bederf en dood van het hersenweefsel, die een beperkende factor voor het succes van deze techniek kan worden voorkomen, is het zeer aand die de stappen voor deze techniek worden uitgevoerd zo dicht mogelijk bij één uur mogelijk. Toch kan deze beperking worden ondervangen in de toekomst met de vooruitgang in kweken en kweken ependymale of gelijksoortige celtypen met beweeglijke cilia in vitro en het gebruik van alternatieve voedingsmedium. Het gebruik van alternatieve voedingsmedium zoals aCSF en Earle's zouten voor de incubatie van de hersenplakken is aangetoond in de literatuur 5. Echter, in onze handen, het gebruik van DMEM / hoog-glucose was voordeliger dan aCSF mogelijk door de aanwezigheid van grote hoeveelheid glucose (4500 mg / ml) in het medium als een potentiële energiebron. Zo is de belangrijkste criterium voor de levensvatbaarheid van het weefsel en dus de geldigheid van de aanpak beoordeelt cilia slaan evalueren, aangezien dit een representatief teken van levende cellen.
Live-beeldvorming van ependymale cilia biedt een krachtig instrument om downstream signalering paden van cilia activering analyserenzoals calcium signalering en trillingen. Bijvoorbeeld met behulp van levende fluorescentie beeldvorming, het is dat ongeacht de ependymale celtype / cilia aangetoond worden ependymale cellen gekenmerkt door unieke calcium oscillatie eigenschappen 10. Al met al is dit protocol is om zowel fundamentele wetenschappelijke kennis en de klinische praktijk relevant. Van de fundamentele wetenschap oogpunt Deze techniek biedt een overzicht van de functionele en fysiologische rol van ependymale cilia structuur, functie en mechanistische downstream signaling pathways. Vanuit het perspectief van de klinische praktijk, deze methode is zeer relevant voor de zoektocht naar medicijnen die ependymale cilia als nieuw therapeutisch doelwit voor neurologische aandoeningen zoals waterhoofd en alcoholmisbruik te richten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
