Abstract
Nåværende undersøkelser i fag-vert interaksjoner er avhengig av ekstrapolere kunnskap fra (meta) genomer. Interessant, 60-95% av alle fag sekvenser dele noen homologi til gjeldende kommenterte proteiner. Som et resultat, er en stor andel av fag-gener kommentert som hypotetisk. Denne virkeligheten tungt påvirker annotering av både strukturelle og hjelpe metabolske gener. Her presenterer vi Phenomic metoder utviklet for å fange opp den fysiologiske respons (er) i en valgt vert under ekspresjon av en av disse ukjente fag-gener. Multi-fenotype analyseplater (MAPS) brukes til å overvåke mangfoldet av verts substratutnyttelse og påfølgende biomasse formasjon, mens metabolomics gir bi-produkt analyse ved å overvåke metabolitt overflod og mangfold. Begge verktøy brukes samtidig for å tilveiebringe et fenotypisk profil som er assosiert med ekspresjonen av et enkelt antatt fag-åpen leseramme (ORF). Representative resultater for begge metodene sammenlignes, highlighting de fenotypiske profil forskjeller i en rekke bære enten antatte strukturelle eller metabolske fag gener. I tillegg er visualiseringsteknikker og høy gjennomstrømning beregnings rørledninger som tilrettelagt eksperimentell analyse presentert.
Introduction
Virus som infiserer bakterier (aka bakteriofag eller fag) er anslått til å eksistere på mer enn 10 31 viruslignende partikler (VLP) globalt og tallmessig overlegen alle andre organismer i et miljø 1,2. Den første metagenomic studie som undersøkte de virale lokalsamfunn knyttet til marine miljøer fokusert på å kvantifisere mangfoldet sett i viral brøkdel tre. I tillegg Breitbart og kolleger fant at over 65% av de virale samfunnet sekvenser delt ingen homologi til noen sekvenser som er tilgjengelige i offentlige databaser. Påfølgende metagenomic studier funnet lignende bevis: metagenomes fra marine sedimenter i San Diego, California inneholde 75% ukjente virale sekvenser 4; metagenomes fra hypers innsjøene i Salton Sea inneholde 98% ukjente virale sekvenser 5; og korall-assosiert metagenomes inneholde 95-98% ukjente virale sekvenser 6. Denne opphopning av unannotated informasjon har medførtfag genetisk materiale å være "den mørke materien av den biologiske univers" 7.
Genomisk karakterisering av fag er avhengig av å identifisere sekvenslikhet gjennom sammenligning mot eksisterende nukleinsyresekvenser og proteindatabaser. Fordi fag-kodet genetisk informasjon er overveiende ukjent, homologi-baserte metoder er ineffektiv. Innenfor deres genom, fager typisk kode tre store gensetyper: transkripsjon og replikering gener, metabolske gener, og strukturelle gener. Transkripsjon og replikering gener (klasse I / II gener 8) inkluderer polymeraser, primases, endo / exo-nukleaser og kinaser. Disse genene er svært konservert på grunn av sin betydning i faginfeksjon, transkribere og replikere fag genetisk materiale. Fag-polymeraser kan lett identifiseres ved hjelp av tradisjonelle metoder sekvenshomologi på grunn av deres globale bevaring 9 og har vist seg å fungere som effektive fylogenetiske 10 markører.I motsetning til dette fag metabolske og strukturelle gener (klasse II / III-gener 8) er stadig divergerende og ofte kommentert som hypotetiske gener.
Fag-metabolske gener påvirker metabolsk kapasitet av verten, og er ikke nødvendigvis nødvendig for viral replikasjon. Disse gener, ofte referert til som hjelpe metabolske gener 11 (AMGs), ser ut til å modulere metabolisme vert og tillater optimal progresjon av infeksjonen og suksess for virion modning. AMGs har vært forbundet med utnyttelsen, og opptak av næringsstoffer som begrenser eller i energiproduksjonsforløp. Noen eksempler er photosystem gener som finnes i genomene til ulike cyanophage 12-16, gener koblet til og regulert av fosfatmetabolisme 17,18, og utnyttelse av pentosefosfateveien vei for fag dNTP biosyntese 18,19. Til sammenligning strukturelle gener er blant de midten til slutten av gener produsert under infeksjon og varierer mellom ulike fag-host systemer. Produksjonen av strukturelle proteiner er avhengig av tilgjengeligheten av viral dNTP, og energi bassenger for deres transkripsjon, translasjon, og anordningen 8. Kapsidet og hale fiber strukturelle proteiner er ansett som den mest divergente av alle virus-protein-kodende gener og er nødvendig for vellykket virusproduksjon. Deres divergens er vanligvis tilskrevet den aktive rollen de spiller i utformingen av virus-vert koevolusjon 20. Avvikende proteiner, uavhengig av genet klassen, blir lett oversett ved bruk av tradisjonelle homologi og sekvenssammenstilling teknikker. Et forsøk på å korrigere for de begrensninger som ses med strenge sekvenssammenligninger har resultert i bioinformatikk stand til å bruke sekvens egenskaper for å bestemme krets, slik som kunstige nevrale nett 21. Kunstige nevrale nett (ANN) åpner for prediksjon av strukturelle og metabolske gener, men krever nedstrøms eksperimentell validering til direkte karaktergenfunksjon.
Formålet med dette manuskriptet er å tilveiebringe Phenomic protokoller som er i stand til å overvåke både katabolske og anabolske metabolisme av en vertsbakterie i løpet av ekspresjon av et nytt fag genet, funksjonelt sies gjennom ANN. Feltet av phenomics, biologi assosiert med mobilnettet fenotyper, er godt etablert i systembiologi til hjelp i etterforskningen av proteiner med ukjent eller pleiotropisk funksjon. Phenomic verktøy brukes til å koble fenotypisk informasjon til genotypisk informasjon. Vi hypoteser for mulige fag gener som deres funksjon (e) kan bestemmes gjennom å observere verts fysiologiske effekter under fag genuttrykk. For å undersøke denne hypotesen, ble to kvantitative metoder valgt. Multi-fenotype analyseplater (kart) ble brukt til å overvåke vert substratutnyttelse og den påfølgende biomasse formasjon mens metabolomics målt vert metabolitt mangfold og relative overflod under vekst i bestemte miljømentale forhold. Antatte strukturelle og metabolske proteiner ble overuttrykt i Escherichia coli, og representative resultater fra begge forsøk er sammenlignet. Mange visuelle teknikker og høy gjennomstrømning behandling av rørledninger presenteres for å lette eksperimentelle replikering. Endelig er reproduserbarheten og nøyaktigheten av de presenterte metoder diskutert i sammenheng med forventede fysiologiske effekter for en annotert kapsidprotein og fag metabolsk protein, tioredoksin, pluss to antatte AMGs.
Protocol
1. Forberedelse av Multi-fenotype analysen Plate (MAP) Underlag, Basal Media, Pre-vekst Media, og Buffer
- Gjør 50 ml 1,0 til 1,25% substrat aksjer.
- Oppløs 1,0 til 1,25% (w / v) av fast substrat i sterilt vann (varme hvis nødvendig). Filter sterilisere løsninger med 0,22 mikrometer filter enhet og store bestandene på RT. Eksempler på substrater som benyttes i disse forsøk er gitt i tabell 2.
- Gjør 250 ml 3x basal media for alle substrat klasser (karbon, nitrogen, svovel og fosfor). De MOPS (3-morfolinopropan-1-sulfonat) basert basale medier 22 inneholder følgende: 1 x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM Tricin), 0,4% glycerol, 9,5 mM * NH4Cl *, 0,25 mM NASO 4 *, 1.0 mM MgSO4 *, 1,32 mM K HPO 2 4 *, 10 mM KCl, 0,5 mM CaCl2, 5 mM NaCl, 6 uM FeCl3, og 0,1% (w / v) L-arabinose ** (tabell 1 og 2) .
Merk: * Disse forbindelsene er ikke inkludert, avhengig av basal media. For eksempel er 0,4% glycerol ikke anvendes i de karbonbasalmedier og i svovelbasalmedier 1,0 mM MgSO4 erstattes med 1,0 mM MgCl2. ** L-arabinose er spesifikk for induksjon av pBAD promotervektor, pEMB11, som ble forvandlet til en ara - E. coli K-12 stamme (BW 27 784) 23.- Legg hver komponent av basalmedier til en steril kolbe og bring oppløsningen til volum. Bland godt. Med en 0,22 mikrometer filter enhet, filter sterilisere hver basale media i en steril flaske.
- Gjør 500 ml MOPS pre-vekstmedier. MOPS baserte pre-vekstmedium 22 inneholder følgende: 1 x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM Tricine), 0,4% glyserol, 9,5 mM NH4CI, 0,25 mM NASO 4, 1,0 mM MgSO4, 1,32 mM K 2 HPO 4, 10 mM KCl, 0,5 mM CaCl2, 5 mM NaCl og 6 uM FeCl3.
- Legg hverkomponent av den pre-vekstmedium til en steril kolbe og bringe til volum. Filter sterilisere med en 0,22 pm filterenhet, og deretter legge ampicillin ved en sluttkonsentrasjon på 100 ug / ml. Butikkløsning ved 4 ° C.
- Gjør 500 ml 0.5x Luria-Bertani (LB) agarskåler. Til en steril kolbe, tilsett LB komponenter for å lage en 0,5x konsentrasjon (1,25 g gjærekstrakt, 2,5 g NaCl, 2,5 g trypton, 7,5 g agar). Bland godt og autoklav å sterilisere.
- Avkjøl agar, og deretter legge 100 ug / ml av antibiotikumet ampicillin med blanding. Hell ~ 25 ml agar i petriskåler, tillate å stille, og oppbevares ved 4 ° C inntil nødvendig.
- Gjør 250 ml 10 mM Tris (pH 7,4) pluss 10 mM MgSO4 bufferoppløsning. Filter sterilisere med en 0,22 mikrometer filter enhet, og oppbevar løsningen på RT.
2. Utarbeidelse av Bakteriell Cell-suspensjon
- Forbered ferske kolonier. Fra en 12,5% glyserol frossen lager, plate frisk E. coli Clones bort på 0.5x LB agar som inneholder 100 mikrogram / ml ampicillin. Inkuber ved 37 ° C i 24 timer.
- Forbered flytende kulturer:
- Pipetter 3 ml av pre-vekstmedium inneholdende 100 ug / ml ampicillin i kultur-rør. For hver klone, bruke biologiske triplikater.
- Vaksinere selvstendige kolonier fra § 2.1 i forberedt kultur rør. Inkuber ved 37 ° C med risting i 22 timer.
- Pellet og vaske bakterieceller:
- Transfer O / N kulturer til 1,7 ml mikrofugerør. Pellet celler via sentrifugering ved maksimal hastighet (16 900 xg) i 2 min i en mikro. Dekanter supernatanten og vask cellene ved å re-suspendering i 500 pl av 10 mM Tris / 10 mM MgSO4 buffer. Gjenta.
- Re-pellet celler, dekanter supernatanten og re-suspendere celler i 1 ml 10 mM Tris / 10 mM MgSO4 buffer.
- Måle celletetthet og konsentrere cellene (hvis nødvendig):
- Fortynne celler fra avsnitt 2.3.3 10 ganger ii 10 mM Tris / 10 mM MgSO4 buffer og overføre denne fortynning i en kyvette. Måle optisk tetthet (OD 600 nm) i denne fortynning og posten.
- Konsentrer celler for å oppnå endelig konsentrasjon på 0,07 (OD 600 nm) i kartene (cellene vil bli utvannet 15 ganger når de legges til kartene, derfor cellene trenger for å være med en initial konsentrasjon av OD 600 nm = 1,05). Overfør konsentrert cellesuspensjon i et reservoar og lagre (ved romtemperatur) til trinn 3.5 av Kart forberedelse.
3. Utarbeidelse av Multi-fenotype analyseplater (Maps)
- Merke Maps. Etikett sterile 96-brønners mikro-titer-plater med en E. coli klone identifikasjonsnummer og kart skjematisk type.
- Delmengde sterilt vann inn Maps. Aseptisk overføring av sterilt vann i et væskereservoar. Pipetter 60 ul i hver brønn i mikro-titer plate ved anvendelse av en multikanal pipette.
- Delmengde basal media into Maps. Aseptisk overførings 3x basale media i en væske reservoaret. Pipetter 50 ul i hver brønn i mikro-titer plate ved anvendelse av en multikanal pipette. Gjenta trinn 3.2 og 3.3 for hver basal medier brukes i MAP skjematisk.
- Alikvote underlag i kartene. Overfør 30 mL av hver underlaget i riktig godt av kartene.
- Legg bakteriell suspensjon til kartene. Overfør 10 pl av bakterieceller fra avsnitt 2.4.2 i hver brønn av kartet ved hjelp av en multikanal pipette. Endre tips før re-introdusere pipette tilbake i kulturen lager.
- Kartene dekker med lim film. Dekk hver plate med et enkelt klebemiddel plate film. Trykk fast film på toppen av brønnene av platen og langs kantene for å skape en jevn og tett forsegling. Fjern overflødig film fra kantene av mikro-titer plate med en steril barberblad.
- Måle optisk tetthet av kart:
- Plasser utarbeidet kart i "Input" ermet på en multi-plate Spectrofotometer plateleser. Åpne plateleser programvare og lage en protokoll som måler absorbans (OD 600 nm) hvert 30 min, for totalt 32 timer, med 60 sekunders risting mellom leser.
- Sett temperaturen i apparatet til 37 ° C. Begynn protokollen når kartene har likevekt til innstilt temperatur.
- Etter 32 timer, fjerne kart fra "Output" hylsen i plateleser. Merk hver data tekstfil til å omfatte: E. coli klone identifikasjonsnummer, dato MAP løp, og MAP skjematisk type.
4. Multi-fenotype analyseplater (MAPS) Bearbeiding og parametrisering
- Vurdere vekstkurver som bruker en automatisert QA prosessen, f.eks PMAnalyzer 24.
- Kontroller at vekstkurver har OD 600 nm <0,20 i første 2 timer. Ikke bruk absorbans ved det første tidspunkt (t 0) i filteret på grunn av gjenstander av kondens, som typisk i det løset 1 (30 min).
- Fjern vekstkurver som bryter QA filter. Lagre kurve informasjon (prøvenavnet, brønn nummer, og OD 600 nm verdier) i en separat utgang fil for fremtidig referanse. Fortsett med analyse hvis vekstkurve passerer QA filter.
- Beregn medianvekstkurver. Ved hjelp av kopiere data, per brønn, beregne medianvekstkurven ved å ta den midlere optiske tetthet (OD 600 nm) verdi ved hvert tidspunkt. Post resulterer median vekstkurver i en separat utgang fil for fremtidig bruk.
- Beregne den optimale logistikkmodell for hver vekstkurve ved bruk av en tilpasning av ligningen er foreslått av Zwietering 25. Den logaritmiske ligning omfatter tre parametere som beskriver bakterievekst: forsinkelsestiden, λ (HR), den maksimale vekst, μ max (OD 600 nm 100 -1), og den endelige biomasseutbytte, α (OD 600 nm). Bruk data ved tid = 30 min (y 1) som initial verdi på grunn av gjenstander av kondens.
[1] - Beregn maksimal vekst ved hjelp av et direkte søk. Ta opp den største hastigheten av endring i løpet av en 90 min intervaller i dataene.
[2] - Anslå endelige biomasseutbytte ved å søke etter den øvre asymptotiske verdien av de største glidende gjennomsnitt over en 90 min vindu. Nærmere bestemt, som definerer den asymptoten til vekstkurven.
[3] - Bruke μ max og A-verdier fra 4.3.1 og 4.3.2, finn λ verdi ved å prøve alle verdier λ:
[4] - Bruk hver λ verdi å beregne en sum av squared error (SSE). Bruk lavest SSE er SSE (ks):
/files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg "/> [5]
- Bruk hver λ verdi å beregne en sum av squared error (SSE). Bruk lavest SSE er SSE (ks):
- Beregn maksimal vekst ved hjelp av et direkte søk. Ta opp den største hastigheten av endring i løpet av en 90 min intervaller i dataene.
[1] 
[2] 
[3] 
[4] 5. Fenotype Analyse av kart
- Beregn vekstnivå (GL) for hver vekstkurve for å vurdere den samlede veksten per klone per substrat. Definere GL som den harmoniske middelverdien av de skiftet logistikk utstyrt verdier:
[6] - Tildele en fenotype for hver vekstkurve basert på GL verdier. Her er de fire fenotyper som brukes er: forventet vekst, ingen vekst, forsterkning av funksjon, og tap av funksjon.
- Bestem fenotyper ved å sammenligne vekst i alle kloner på en bestemt substrat i form av standardavvik unna gjennomsnittet. Bruk denne statistikken og et minimum vekstterskel for å betegne den fenotype som presenteres av vekstkurven (figur 1 A, B). Figur 1C viser eksempler på fenotype oppdrag.
- Definere vekst som GL ≥ 0,4 (Figure 1A, B). Definer Gain av funksjon (figur 1C, grønn) som å ha en GL> to standardavvik over gjennomsnittet, og en middel> veksten terskel. Tap av funksjon (figur 1C, rød) er definert som å ha et GL <to standardavvik under gjennomsnittet og en midlere> vekstterskelen.
- Skape visuelle fremstillinger av datasettet basert på fenotyper og vekstkurver.
- Vis vekstdynamikk portretterer OD 600 nm verdier som farge raskt sammenligne vekstkurver mellom flere kloner (figur 2).
- Vis fenotypiske distribusjoner blant alle kloner basert på vekstforhold (figur 3).
[6] 6. Bygge Kontinuerlig Kultur Apparatus
- Reactor port konstruksjon (Figur 4A, B). Bore tre 1/4 in. Hull, fordelt 3/4 i. Fra hverandre, i hatten for den kontinuerlige kultur reaktoren.
- For port α: skru en kvinnelig luer tråd stil panel mount til 1/16 i brodd fra bunnen av lokket med brodd peker opp, ut av hetten.. Sikker brodd med en 1/4 i. Panelmontering låsemutteren.
- For port β: skru en kvinnelig luer tråd stil panel mount til 1/16 i brodd med brodd peker opp, ut av hetten.. Sikker brodd med en 1/4 i. Panelmontering låsemutteren.
- For port γ: skru en kvinnelig luer tråd stil panel mount til 1/16 i brodd fra bunnen av lokket slik at brodd peker opp, ut av hetten.. Sikker brodd med 1/4 i. Panelmontering låsemutteren. Skru en hann med integrert låsering til 1/8 i. Bred slange til brodd montering på innsiden av lokket.
- For utstrømningen port: bore et 5/16 i hull på 75 ml merket av den kontinuerlige kultur reaktoren.. Skjær 3/4 i. Utenfor mutteren slutten av 1/4 i. Piggtråd skott montering. Skru på 1/4 i. Piggskott beslaget (pakning er på utsiden av flasken, og mutteren er på innsiden, Figur 4B).
- Tåteflaske port konstruksjon (Figur 4C). Bor to 1/4 in. Hull fordelt 1 i. Fra hverandre i hatten av tåteflaske.
- For porten δ: skru en kvinnelig luer tråd stil panel mount til 1/8 i brodd med brodd peker opp, ut av hetten.. Sikker brodd med en 1/4 i. Panelmontering låsemutteren.
- For porten ε: skru en kvinnelig luer tråd stil panel mount til 1/16 i brodd med brodd peker opp, ut av hetten.. Sikker brodd med en 1/4 i. Panelmontering låsemutteren.
- Skru en hann med integrert låsering til 1/8. Bred slange til brodd montering, på innsiden av hetten.
- Fôring rør og rør utvidelser:
- Cut to 1 i. Stykker av rør (1/8. Ytre diameter (OD) x 1/16. Indre diameter (ID)). Fit brikkene på porter α og γ av den kontinuerlige kultur reaktoren gjort i avsnitt 5.2.
- Skjær en eneste en i. Stykke tubing (1/4 in. OD x 1/8. ID). Fit stykket på port Β av den kontinuerlige kultur reaktoren.
- Skjær et enkelt 3,5 i. Slange (1/8. OD x 1/16. ID). Monter dette stykket på innsiden av port γ, på hann med integrert låsering til 1/8. Bred slange. Port γ er prøvetakingsporten av den kontinuerlige kultur reaktoren.
- Skjær en eneste en i. Slange (1/4 in. OD x 1/8. ID). Passer denne stykke på δ porten på tåteflaske.
- Skjær en enkelt 11 i. Slange (1/16 in. OD x 1/8. ID). Monter dette stykket på innsiden av porten ε av tåteflaska, på hann med integrert låsering til 1/8. Bred slange.
- Skjær to 18 i. Stykker av rør (1/8. OD x 1/16. ID). Monter ett stykke til port ε av tåteflaske. Lagre den andre stykke for kapittel 7.
7. Kjører Kontinuerlige kulturer for Metabolomics
- Sterilisere materialer:
- Autoclave tørrstoffene i 30 minutter. Sørg for å vikle lokket av tåteflaske gjort i punkt 5 i aluminiumsfolie. Hold festet slangen rett.
- Pakk cap av den kontinuerlige kultur reaktoren, laget i § 5 i aluminiumsfolie. Hold festet slangen rett. Pakk 18 i. Tubing kutt i avsnitt 6.3.5 og den minste peristaltiske pumpeslanger adapter i aluminiumsfolie. Hold slangen rett. Autoklaver i 30 min.
- Gjør 2 liter 0.5x LB buljong. I tåteflaske, må 0.5x LB buljong. Dekk tåteflaske med folie. Autoklav i 1 time.
- Gjør 70 ml 0.5x LB buljong. Hell kjøttkraft inn i den kontinuerlige kultur reaktoren. Plasser en røre bar i den kontinuerlige kultur reaktoren. Dekk med folie og reaktoren autoklav i 30 min.
- Autoclave tørrstoffene i 30 minutter. Sørg for å vikle lokket av tåteflaske gjort i punkt 5 i aluminiumsfolie. Hold festet slangen rett.
- Kontinuerlig kultur set-up:
- Bakteriecelle-suspensjon.
- Fra en 12,5% glyserol frossen lager, plate frisk E. coli-kloner bort på 0,5x LB agar inneholdende 100 ug / ml ampicillin. Inkuberved 37 ° C i 24 timer.
- Inokulere en enkelt koloni i 3 ml 0,5x LB medium inneholdende 100 pg / ml ampicillin. For hver klone bruke biologiske triplikater. Inkuber ved 37 ° C med risting i 22 timer.
- Koble delene sammen.
- Legg alle autoklaverte materialer til et biologisk sikkerhetskabinett og slå ultrafiolett lys på mens media kjøler. Når media er avkjølt, tilsett 0,1% L-arabinose og 100 mikrogram / ml ampicillin til alle 0.5x LB buljong.
- Pakk kontinuerlig kultur reaktorlokket og skru på reaktoren. Unngå å ta på prøvetakingsrøret. Pakk fôring korken og skru på tåteflaske. Unngå å ta på prøvetakingsrøret.
- Hold 18 i. Slange koblet til port ε sterile. Un-pakk 18 i. Slange og slangepumpe slange adapter.
- Monter en fri ende av 18 i. Røret på den ene ende av den peristaltiske pumpe slangeadapter. Sett den andre enden av peristaltiske pumpen slangen adapter til18 i. røret er koblet til port ε av mate korken.
- Skru 0,22 um filterenhetene på portene β og δ av den kontinuerlige kultur reaktoren. Skru en 0,22 mikrometer filter enhet på adapteren port α. Til 0,22 pm filterenhet, passer den frie enden av 18 i. Slangen.
- Start kontinuerlig kultur.
- I biosikkerhet hette, inokulere kontinuerlig kultur reaktor med 100 ul av O / N kultur som er gjort i avsnitt 7.2.1.1.
- Lukk system før du flytter den kontinuerlige kulturen inn i en 37 ° C inkubator. I inkubatoren har en magnetisk røreplate og mini peristaltiske pumpe satt opp.
- Monter slangepumpe slange adapter i peristaltiske pumpen. Slangen fra tåteflasken starter på "In" side, og slangen som fører til reaktoren starter på "ut" side.
- Sett peristaltiske pumpen til: "FAST". Start peristaltiske pumpen ved å bytte til R20; FORWARD ". Kontroller at mediet begynner å strømme gjennom røret.
- Plasser reaktoren på magnetisk røreplate og begynner å blande. Kontinuerlig kultur reaktoren må stabilisere seg i 24 timer før prøvetaking.
- Prøvetaking av kontinuerlig kultur. Skru en 5 ml luer lok sprøyte inn port γ og trekk opp 4,5 ml kultur.
- Bruke 500 pl av kulturen for å måle tettheten (OD 600 nm). Fortynn cellene til å lage 4 x 1 ml kulturer ved OD 600 nm = 0,35.
- Prøven fortynnet kulturer inn 1,7 ml mikrofugerør. Gjenta prøvetaking hver 12. time i 4 dager.
- Forberede prøver for GC-TOFMS:
- Pellet celler via sentrifugering ved maks hastighet (16 900 xg) i 2 min. Dekanter supernatanten. Vask cellene med 500 ul av fosfatbufret saltvann (PBS). Gjenta dette trinnet.
- Dekanter supernatanten en siste gang, og deretter senk mikrofugerør med pelle celler i flytende nitrogen til boblende stopper. Store prøver i -80 ° C fryser.
- Bakteriecelle-suspensjon.
8. Kjører Serial Passage batch kulturer for Metabolomics
- Forbereder bakteriecelle-suspensjon. Fra en 12,5% glyserol frossen lager, plate frisk E. coli kloner bort på 0,5x LB-agar som inneholdt 100 pg / ml ampicillin. Inkuber ved 37 ° C i 24 timer.
- Inokuler individuelle kolonier i 3 ml 0,5x LB medium inneholdende 100 ug / ml ampicillin. Bruk biologiske triplikater for hver klone.
- Serie passasje batch kulturer.
- Subkultur O / N fra 8.1.1 via en 500-gangers fortynning i 3 ml LB-næringsløsning inneholdende 50 pg / ml ampicillin og 0,1% L-arabinose. Subkultur bør ha en OD 600 nm <0,005. Inkuber ved 37 ° C med risting.
- Kontroller optisk tetthet (OD 600 nm) ved 2,5 og 2 timer. Grow celler for å oppnå OD 600 nm = 0,35.
- Subkultur via en 500-fold dining i 3 ml LB-næringsløsning inneholdende 50 pg / ml ampicillin og 0,1% L-arabinose. Subkultur bør ha en OD 600 nm <0,005.
- Kontroller optisk tetthet (OD 600 nm) ved 2,5 og 2 timer. Grow celler for å oppnå OD 600 nm = 0,35.
- Prøvetaking serie passasje batch kulturer.
- Ved hjelp av steril pinsett, plassere en 0,22 m membranfilter på toppen av et filter manifold. Delmengde 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS) på filterpapiret og deretter slå på vakuumpumpe.
- Gjenta tilsetning av 1 ml PBS. Overfør 1 ml subkultur fra seksjon 8.2.3 på filterpapiret. Herfra kan bevege seg raskt for å få prøver i flytende nitrogen umiddelbart. Fylles i 1 min.
- Aliquot 1 ml PBS på filterpapir for å vaske prøven. Skylle raskt uten å søle prøven over sider av filterpapir. Gjenta.
- Ved hjelp av steril pinsett sett filteret på en 1,7 ml mikrosentrifugerør ved forsiktig brette filter. Senk mikrofugerør i flytende nitrogen til boblende stopper. Oppbevares prøven i -80 ° C fryser.
9. Metabolitt analyse og prosessering
- Skips tre prøver per klone på tørris til en metabolomics kjernefasiliteten for utvalgets behandling, analyse og normalisering av GC-TOFMS.
- For hver prøve bestemmes midlere, median, standardavvik og variasjonskoeffisient på tvers av metabolitter, ved hjelp av kopiere data.
- For statistisk analyse, manuelt kode en QA rørledningen ved hjelp betinget utsagn og repeterende henrettelser 26 for å fjerne metabolitter som ikke følger definerte vilkår.
- For tilstand 1, fjerne metabolitter der mer enn to prøvene har null overflod. Fjern interne standarder fra metabolomic profiler.
- For Betingelse 2, fjerne disse metabolittene som ikke finnes i cellene av interesse. Her fjerne følgende metabolitter: indol 3 acetate, dihydroabiet ic syre, nonadekan-, salicylsyre, salicylaldehyd, kolesterol, fenol, 1-monostearin, oktadekanol, 1-monopalmitin, dodekan, dodekanol, 1-heksadekanol, 5-metoksytryptamin, benzosyre, pentadecanoic syre, fosforsyre, pelargonsyre, palmitinsyre syre, kaprinsyre, hydroksylamin, stearinsyre, myristinsyre, maleimid, levoglucosan, og 4-hydroksysmørsyre.
- For Tilstand 3, fjerne disse metabolittene som variasjonskoeffisienten er større enn 1.
- Capture globale metabolomics effekter ved å se på metabolitt relative abundances.
- Lag en visuell representasjon av median metabolitten overflod per klone for hver metabolitt (figur 6).
- Identifisere rammene ved å observere klone-metabolitten par frekvenser.
- Beregn Z score for hvert median verdien av hver metabolitt i en klone. Beregne z score ved hjelp av følgende ligning:
/52854/52854eq7.jpg "/> [7]
Merk: Term X MC representerer overflod nivået av et spesifikt metabolitt for en bestemt klon. Uttrykket μ C representerer gjennomsnittet av alle kloner for en bestemt metabolitt. Term σ C er den tilhørende standardavvik. - Lag en visuell representasjon av data som uteliggere er uthevet (data følger ikke med).
- Beregn Z score for hvert median verdien av hver metabolitt i en klone. Beregne z score ved hjelp av følgende ligning:
Representative Results
Alle prøver som brukes til å bestemme de åpne leserammer (ORF) er valgt i denne studien ble samlet inn fra Starbuck Island, Side 7 (STAR7) og Caroline Atoll, side 9 (CAR9) av de sørlige Line Islands. En estimert 100 liter sjøvann fra disse områdene ble samlet under korallgrensesjikt ved hjelp av lensepumper, som tidligere beskrevet 5. Innholdet i pumpene var underlagt fractionalization gjennom store porede filtre for å fjerne små eukaryoter og deretter konsentrert bruker 100 kDa tangential strøms filtre slik at bare mikrober og viruslignende partikler (VLP). Å separere VLP, ble gjenværende sjøvann ført gjennom 0,45 um filter resulterer i virome. Kloroform ble introdusert til denne viral fraksjonen for å stanse vekst av eventuelle gjenværende celler og lagret ved 4 ° C.
VLP ble renset ved hjelp av cesiumklorid-metoden, hvor tetthetsgradienter separere ved sentrifugering, og tillater utvinning av virioner ved ~ 1,35 g / ml til 1,5 g / ml 3. Viral DNA ble ekstrahert ved hjelp av en CTAB / fenol: kloroform protokollen og forsterkes via flere forskyvning forsterkning ved hjelp Phi29 reagenser. Sekvensering av den virome ble oppnådd med kommersielt tilgjengelig pyrosekvensering teknologi.
Bio brukt i behandling og valg av virale ORF for denne studien er som følger. Tre pre-behandlingstrinn ble brukt på CAR9 og STAR7 virus metagenomes. Først ble offentlig programvare som brukes for å fjerne kodesekvenser som et resultat av amplifikasjon av det virale DNA-sekvensering før 27. For det andre var vanlige sekvense artefakter som sekvens duplikater og lavt kopiantall filtrert ut av datasettet via en ekstra bioinformatikk program 28. Til slutt, fjerning av fremmedlegeme sekvens forurensning 29 ble utført for de sekvensene som hadde ≥ 90% dekning og ≥ 94% identitet med sekvenser i følgende databaser: RefSeq virus genomer; Menneskelig - Referanse GRCh37; Menneskelig - Celera Genomics; Menneskelig - Craig Venter (HuRef); Menneskelig - Seong-Jin Kim (koreansk); Menneskelig - Kromosom 7 versjon 2 (TCAG); and Human - James Watson, Yanhuang (YH, asiatisk), Yoruba (NA18507; afrikansk) referansesekvenser 21. Etter disse prosessene, sekvenser fra de CAR9 prøvene utgjorde 591 600 og STAR7 sekvenser utgjorde 939 311. Disse sekvensene ble lastet opp på MGRAST og monteres via assembler programvare ved hjelp av standardinnstillingene. Contigs ble oversatt til seks leserammer og antatte åpne leserammer (pORFs) ble identifisert ved hjelp av skript, som tidligere beskrevet 21.
Å identifisere ukjente ORF'ene en rekke likhetsbaserte søk ble utført for å fjerne ORF'ene med kjent funksjon. Kort fortalt ble følgende søk utført med tilhørende søking kriterier 21:
- Betydelig likheten på ≥ 95% identitet i løpet av ≥40 basepar (bp) ved MGRAST BLAT i M5NR database.
- Betydelig likheten (e-verdi ≤ 0,001) av TBLASTN mot alle offentlige metagenomes i Min Metagenome Database Resource.
- Betydelig likheten (e-verdi ≤ 0,001) av BLASTP og TBLASTN mot NR database.
- Betydelig likheten (e-verdi ≤ 0,001) av RPS-BLAST mot konservert Domain Database.
- Protein oversettelser fra en utvalgt brøkdel av hvert datasett sammenlignet mot løses proteinstrukturer i Protein Data Bank.
- Beregning av dinukleotidpolyfosfater frekvenser ved hjelp dinukleotid Signaturer pakken.
De resulterende pORFs ble utformet for ekspresjon i E. coli bruker offentlig tilgjengelig genet design software. Back-oversettelse av amino-syresekvensene anvendes en universell kodonbruk Tabell utformet for å få plass til ekspresjon i E. coli med et minimalt forbruk terskel på 2%. Restriksjonsenzymgjenkjennelsessekvenss for BamHI og Hindi ble ekskludert fra sekvensene til rette for kloning. En utenforstående syntetisert konstruert gensekvenser 30 og deretter ORF'ene ble klonet inn i en medium-kopi nummer pBAD promotervektor, pEMB11, via standard restriksjonsenzym kloning. Alle kloner ble transformert inn i E. coli K-12 stamme BW 27 784 23.
Multi-fenotype analyseplater (Maps)
En høy gjennomstrømming og robust programvare rørledningen ble utnyttes for analyse av kartene, den PMAnalyzer 24. Rørledningen ble utviklet på en Linux server miljø og utfører ulike trinnene inkludert: analyseringen av optisk tetthet filer, formatering data i lesbar tekst-filer, pre-prosessering av vekstkurver for kvalitetssikring (QA), og utføre matematiske modelleringsteknikker for å analysere vekstkurver . Den primære modellering skript ble utviklet i Python versjon 2.7.5 for å gjøre bruk av PyLab modulen.
(Figur 2A). Rå vekstkurver ble sammenlignet med logistikk vekstkurver for å bestemme om programmet PMAnalyzer nøyaktig parametriseres og modellerte klon vekst under eksperimentering (data ikke vist). For ytterligere informasjon om nøyaktighet og gyldighet av kartene og PMAnalyzer se Cuevas et al. 24
Etter validering av metoden, ble kartdataene analysert ved hjelp av flere parametere, slik som maksimal veksthastighet (μ max) og vekstnivået (GL), levert ved hjelp av behandlings rørledningen. Sammenlignende visualisering av vekstkurver er ofte brukt for vekst datafortolkningen; Men det antall kurver som kan bli visualisert ved en tid for sammenlikning har begrensninger. Å analysere en rekke vekstkurver samtidig, ble varme kart avledet tomter tryglet å sammenligne titalls kloner dyrket på en enkelt substrate mot at forholdene 'gjennomsnittlig svartid (figur 2B). Innflytelsen plassert ved overekspresjon av et nytt fag protein er observert gjennom endringer i kurveparametere, spesielt: lagfase, eksponensiell fase og den maksimale biomasseutbyttet (asymptote). Som et eksempel er den bratte stigning fra faseforsinkelse i eksponensiell fase modellert i vekstkurven for kapsid-protein (figur 2A) reprodusert ved en rask endring i fargeintensiteten fra svart til hvitt for den samme klon i det dynamiske plottet i figur 2B .
For å få et bilde av global klon fordeling mellom substrater, ble fenotypiske klassifikasjoner avledet fra GL (figur 3). Her er de fire fenotyper er atskilt i fire diagrammer hvor høyden på hver stolpe representerer antallet kloner viser at fenotype for et spesifikt substrat. Uteliggere i dataene er anerkjent som kloner som faller inn i "gevinst fun k "eller" tap av funksjon kategorien ". Uteliggere kan deretter oppsøkt individuelt og undersøkt nærmere eksperimentelt. Dessuten gjenkjenner global analyse substrat skjevheter i analysen. Substrater så som fenylalanin, eplesyre, glysin og resulterte i en «ingen vekst» klassifisering. Substrater som konsekvent faller inn i noen vekst klassifisering, på tvers av alle kloner, ikke er tungt vektet i nedstrøms funksjonell karakterisering.
Metabolomics
De katabole produkter fra kloner uttrykker ukjente fag gener ble identifisert ved hjelp av metabolomics. Kort fortalt kloner ble dyrket under enten en kontinuerlig kultur eller serie passasje i batch kultur miljø før de blir sendt ut for GC-TOFMS analyse på en metabolomics kjernefasiliteten. For detaljer om utvalgets behandling, analyse og normalisering for GC-TOFMS iverksatt av den valgte kjernefasiliteten se Fiehn et al. 31 Briefly er 1 ml kald ekstraksjon oppløsningsmiddel tilsatt til hver prøve, hvorpå prøvene ble virvlet og sonikert i et kaldt bad i 5 minutter. Prøver blir til slutt sentrifugert og halvparten av prøven dekanteres og tørkes ned for analyse. Ekstraktene ble renset og tilsatt indre etensjonsindeksen markører før den blir lastet inn i gasskromatografen og deretter senere overført til massespektrometeret. Data fra hver prøve analyseres slik at signalintensitetene for alle detekterte signaler i kromatogrammet blir rapportert. For normalisering, er overflod av toppene for hver prøve summert og de totale peak Forekomsten gjennomsnitt mellom alle prøvene i settet. Metabolitt Forekomsten per prøve er delt av prøvens peak overflod og deretter multiplisert med gjennomsnittlig peak overflod av prøvesett. De resulterende data brukes for analyse av metabolomics i forskning diskutert.
Validering av metabolomics reproduserbarhet ble pålagt åbestemme den passende prøvestørrelse for hver dyrkning metode. For å detektere presisjonen ses innen prøver og variasjonen sees over prøvestørrelser standard feil av gjennomsnittet (M) for både n = 3 og n = 6 datasett ble gjennom (figur 5B). Uavhengig av den kontinuerlige kultur (CC) prøvestørrelse, mindre enn 1% av dataene hadde en S M ≤ 1,5. Median S M s var 221 og 300, og verdiene varierte 0 til 7,55 x 10 5 og 3,74 x 10 5, for n = 3 og n = 6 hhv. S M s ble også beregnet for hvert sett av prøve replikerer i serie kultur (SC) -metoden. Igjen, mindre enn 1% av dataene hadde en S M ≤ 1.5, en median S M for 137, og en rekke 0 til 3,51 x 10 5. Å sammenligne S M fordelinger mellom hvert prøvesett (CC n = 3 vs . CC n = 6, CC n = 3 vs. SC n = 3, og CC n = 6 vs. SC n = 3) en permutasjon test ble utført. Den distribution av enten kontinuerlig kultur S M verdier datasettet var ikke signifikant forskjellig fra fordelingen av seriekultur S M verdier (p-verdi = 0,0). Men fordelingen av S M-verdier for kontinuerlig kultur n = 3 data var signifikant forskjellig fra den til S M verdiene for kontinuerlig dyrking n = 6 data (p-verdi = 1,908804 x 10 -49). Til slutt, ble variasjonskoeffisienten per metabolitt sammenlignes før og etter gjennomføring av en kvalitetssikring (QA) trinn (figur 5C). I alt ble 210 metabolitter fjernet etter gjennomføringen av QA rørledningen (40% av dataene). Mindre enn 1% av de fjernede data hadde en metabolitt overflod av null, ~ 2% var intern standard data, ~ 5%, ble data fra metabolitter aldri tidligere observert i E. coli, og de resterende metabolitter (> 30%) hadde en variasjonskoeffisient større enn 1.
Som med kartene analyse, global observations gitt en innledende forståelse av dybden av informasjons metabolomics tilbud. For å oppnå en global bilde, ble kloner hierarkisk gruppert basert på deres relative metabolitt abundances som gir informasjon om klone-metabolitt profiler, potensielle kloner med tilhørende funksjoner og klone-metabolitten uteliggere (figur 6). For å markere protein funksjoner, metabolitter skilles ut og gruppert basert på felles stoffskifte. Ved hjelp av denne analyse med foreløpige resultater, var det tydelig at metabolomikk er i stand til å separere gener fra forskjellige klasser (figur 6, fremhevet kloner). I tillegg ble avvikende identifikasjon med metabolomics data bestemmes ved å beregne standard score (z score) for hver klone-metabolitten pair. For å sikre statistisk signifikans, ble uteliggere definert som en klone-metabolitt paret med en Z poengsum verdi på 2, sto for bare 5 prosent av dataene (data ikke vist).
ether.within-side = "always"> 
Figur 1. Definisjoner av fenotype klassifikasjoner. (A) Forholdet mellom vekstnivå (GL) og maksimal vekstrate. Datapunkter sirklet i rødt representerer vekstkurver som viser liten eller ingen substratutnyttelse. (B) Boxplot representasjon som definerer vekstterskelen basert på fordelingen av vekstkurver med en minimal vekst (<0,15 OD / hr). (C) Variansen og standardavvik for GL er beregnet for substrat D-galaktose. Korte stiplede linjer representerer to standardavvik fra gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
highres.jpg "/>
Figur 2. MAPs validering via presisjon og differensiering. (A) Vekstkurvene for annoterte konstruksjons (kapsid) og metabolske kloner (tioredoksin), to nye metabolske kloner (EDT2440, EDT2441), og den gjennomsnittlige respons av kloner dyrket på sukrose, D- galaktose og D-mannose i kartene. Blå linjer indikerer standardavvik sett mellom kopiere data (n = 3). (B) Vekstkurvene for 47 forskjellige kloner er representert som varme kart for sukrose, D-galaktose og D-mannose. Den kommenterte strukturelle (grønn sirkel) og metabolske kloner (oransje sirkel), to nye metabolske kloner (mørk og lys blå sirkler), og gjennomsnittlig responstid (rød sirkel) er uthevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
pload / 52854 / 52854fig3highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 3. Clone fordeling for hver fenotype tvers av flere underlag. Den fenotype-klone teller for 47 kloner over 72 karbonspesifikke vekstvilkår. Tabellen gir direkte teller for hver fenotype. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. skjema som i detalj konstruksjonen av den kontinuerlige kulturapparat. (A) trinnene som brukes for å bygge porter α-γ av den kontinuerlige kultur reaktoren, (b) fremgangsmåten brukes til å bygge ut strømningsporten av den kontinuerlige kultur reaktoren, og (C ) trinnene for å bygge porter δ og ε av den kontinuerlige kultur tåteflaske. = "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Sammenligning av Phenomic metodene som presenteres. (A) Arbeidsflyt for utarbeidelsen av Multi-fenotype analyseplater (kart), kontinuerlige kulturer og serie kulturer. (B) Prosent Standard error of mean (S M) teller for begge n = 3 og n = 6 utvalgsstørrelsene for kontinuerlig kultur (CC) og serie kultur (SC) prepareringsmetoder for metabolomics. Y-aksen er på en log skala. (C) fordelinger av variasjonskoeffisient (CV) per metabolitt, før og etter gjennomføring av QA rørledningen for kontinuerlig kultur (CC) -metoden.g5highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Metabolomic profiler av kloner dyrket i kontinuerlig kultur. Er Median metabolitt abundances for et sett av metabolitter plottet for 84 kloner dyrket i kontinuerlige kulturer. Metabolittprofiler for kommenterte strukturelle (capsid) og metabolske kloner (tioredoksin), to nye metabolske kloner (EDT2440, EDT2441), og gjennomsnittlig metabolske responsen er uthevet i rødt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Compound | Carbon | Nitrogen | Svovel | Fosfor |
| Glyserol | - | 0,40% | 0,40% | 0,40% |
| Salmiakk | 9,5 mm | - | 9,5 mm | 9,5 mm |
| Natriumsulfat | 0,250 mm | 0,250 mm | - | 0,250 mm |
| Magnesium sulfat | 1,0 mm | 1,0 mm | - | 1,0 mm |
| Kalium fosfat | 1.32 mm | 1.32 mm | 1.32 mm | - |
| Magnesiumklorid | - | - | * | - |
| Kaliumklorid | 10 mm | 10 mm | 10 mm | 10 mm |
| Kalsiumklorid | 0,5 mikrometer | 0,5 mikrometer | 0,5 mikrometer | |
| Natriumklorid | 5 mm | 5 mm | 5 mm | 5 mm |
| Jernklorid | 6 mikrometer | 6 mikrometer | 6 mikrometer | 6 mikrometer |
| L- arabinose | 0,10% | 0,10% | 0,10% | 0,10% |
| MOPS pH 7,4 | 1x | 1x | 1x | 1x |
Tabell 1. Forbindelsene og konsentrasjoner av de ulike basal medier brukes i kartene. * 1,0 mM magnesiumklorid er substituert. 1x MOPS = 40 mM MOPS, 4 mM Tricin.
| Karbonsubstrater | Nitrogen underlag | Svovel underlag | Phosphorus underlag | ||
| 2 deoksy-D-ribose | 2-deoksy-D-ribose | 1-butan-sulfonsyre | adenosin-5-monophoshate | ||
| 4-hydroksy-fenyl-eddiksyre | -acetamid | acetylcystein | beta-glycerophosphate | ||
| eddiksyre | adenin | D-cystein | creatinephosphate | ||
| adenosin-5-monofosfat | adenosin | D-metionin | D-glukose-6-fosfat | ||
| adonitol | allantoin | dietyl-ditiofosfat | dietyl-ditiofosfat | ||
| alfa-D-glukose | beta-fenyletylamin | DL-ethionine | DL-a-glycerofosfat | ||
| alfa-D-laktose | biuret | glutation | kaliumfosfat | ||
| alfa-D-melebiose | cytidine | isetionsyre | natriumpyrofosfat | ||
| sitronsyre | cytosin | L-cysteinsyre | natrium tiofosfat | ||
| D-alanin | D-alanin | L-Cysteine | |||
| D-arabinose | D-asparagin | L-djenkolic syre | |||
| D-arabitol | D-aspartat | L-metionin | |||
| D-asparagin | D-cystein | magnesiumsulfat | |||
| D-aspartat | D-glukosamin | metansulfonsyre | |||
| D-cellubiose | D-glutaminsyre | N-acetyl-DL-metionin | |||
| D-cystein | DL-a-amino-N-smørsyre | N-acetyl-L-cystein | |||
| D-fruktose | D-metionin | kalium-tetra-thionate | D-galaktose | D-serin | natriumtiosulfat |
| D-glukosamin | D-valin | sulfansyre | |||
| D-glucose | gamma-amino-N-smørsyre | taurin | |||
| D-glukose-6-fosfat | glysin | taurocholinsyre | |||
| D-glutamat | guanidinet | tiourinstoff | |||
| D-mannose | histamin | ||||
| D-raffinose | inosine | ||||
| D-ribose | L-alanin | ||||
| D-salicin | L-arginin | ||||
| D-serin | L-asparagin | ||||
| D-trehalose | L-citrulline | ||||
| D-xylose | L-cystein | ||||
| dulcitol | L-glutaminsyre | ||||
| glyserol | L-glutamin | ||||
| glysin | L-glutation | ||||
| i-erytritol | L-histidin | ||||
| inosine | L-isoleucin | ||||
| L-alanin | L-leucine | ||||
| L-arabinose | L-lysin | ||||
| L-arabitol | L-metionin | ||||
| L-asparagin | L-ornitin | ||||
| L-aspartat | L-fenyl-alanin | ||||
| L-cysteinsyre | L-prolin | ||||
| L-cystein | L-pyroglutaminsyre | ||||
| L-fukose | L-serin; L-treonin | ||||
| L-glutaminsyre | L-tryptofan | ||||
| L-glutamin | L-valin | ||||
| L-isoleucin | N-acetyl-D-glukosamin | ||||
| L-leucine | putrescin | tiourinstoff | |||
| L-metionin | tymidin | ||||
| L-fenylalanin | tymin | ||||
| L-pyroglutaminsyre | tyramin | ||||
| L-rhamnose | tyrosin | ||||
| L-serin | uridine | ||||
| L-sorbose | |||||
| L-treonin | |||||
| L-tryptofan | |||||
| L-valin | |||||
| L-xylose | |||||
| laktat | |||||
| laktulose | |||||
| malate | |||||
| myo-inositol | |||||
| oksalsyre | |||||
| kaliumsorbat | |||||
| propionsyre | |||||
| putrescin | |||||
| kininsyre | |||||
| natriumpyruvat | |||||
| natriumsuccinat | |||||
| sukrose | |||||
| tymidin | |||||
| xylitol |
Tabell 2. Liste over underlag som brukes i kartet eksperimenter.
Discussion
Her presenterer vi Phenomic tilnærminger for funksjonell karakterisering av antatte fag gener. Teknikker er utviklet assay stand til å overvåke vert anabole metabolisme, Multi-fenotype analyseplater (kart), i tillegg til den etablerte metoden for metabolomics, i stand til å måle effekter på katabolsk metabolisme. Vi følger flere verktøy for å håndtere store datasett som følge av disse teknologiene, slik at for høy gjennomstrømming bearbeiding og analyse 24. Til slutt, gjennom sammenligning av en annotert fag kapsidprotein, fag thioredoxin, to antatte metabolske fag gener, og gjennomsnittlig eksperimentelle responsen vi foreslå ulike strategier for å tolke både datasett og gen klasser, med vekt på identifisering av fenotypiske trender og identifisering av utliggere.
Som nevnt, begge tilnærminger kvantitativt måle bare halvparten av verts metabolisme. For å tolke de relative funksjon av noen avnye proteinene under etterforskning, data fra begge metoder er nødvendig for å gi bevis av funksjon. Selv om dette ikke er et fokus for vår nåværende manuskriptet, er data utganger fra hvert Phenomic metoden satt gjennom kombinatoriske analyser som fokuserer på klynge teknikker som tilfeldig skog og prinsipal komponent analyse. Videre må hypoteser som følge av den kombinerte analysen deretter bli validert ved tradisjonelle genetiske metoder.
Endelig metodene presenteres er sterkt påvirket av bakteriell fysiologi og derfor følger de samme standardene. Når foretaket enten metoden, hensyn må gjøres for å sikre uavhengige, clonal grupper blir eksperimentert med; forurensning forhindres; en enkelt variabel blir testet; og hensiktsmessige kontroller blir løp samtidig. Unnlatelse av å ta hensyn til disse punktene vil resultere i uklare resultater, i likhet med alle fysiologiske analysen.
Multi-fenotype analyseplater(Kart)
Utviklingen av kart gir en høy gjennomstrømming og tilpasningsdyktig analysen sammenlignet med teknologier som er tilgjengelige (Figur 5A og tabeller 1,2). Analysen bruker forsyninger, utstyr og grunnleggende teknikker tilgjengelig i alle mikrobiologi laboratorier. Inkorporering av en beregnings rørledning, PMAnalyzer 24, for påfølgende databehandling og analyse sikrer hurtig tolking. I tillegg kan både eksperimentelle og analytiske aspekter av tilnærmingen lett justeres eller innstilt for tilpassede formål. For eksempel, hvis en stor del av de data ikke klarer å passere filtrering er beskrevet i seksjon 4, kan man manuelt sile gjennom vekstkurver for å identifisere problemer. Hvis problemet oppstår på grunn av strenge filterparametrene, kan justeringer av skriptet gjøres. Alternativt, dersom problemer er forbundet med den eksperimentelle prosess (dvs. forlenget kondensasjon, mangel overføring av bakteriell celLS, etc.) og deretter ytterligere replikater lett kan gjentas.
Som beskrevet i Cuevas et al. 24, er den PMAnalyzer et enkelt bash program skrevet som en wrapper script som utfører analyser og analyse scripts som en sammenhengende, automatisert rørledningen. Alle skript er fritt tilgjengelige fra et depot Git ved 25 ved å ta medianverdien for hvert tidspunkt tvers triplikat data, og senere parameterizes den logis kurve for å oppnå lag tid, maksimal veksthastighet, asymptote, og en ny periode, Growth nivå. Medianverdien ble valgt over middelverdien i vår studie for å redusere effekten av store uteliggere, men skriptet kan lett tilpasses til å beregne gjennomsnittet av kopiere data. På grunn av redusert variasjon (SE) sett over replikere data (Figur 2A) vi opprettholdt bruk av medianen i PMAnalyzer for å montere en logistisk kurve. I tillegg er avskåret for vekst i denne studien (GL ≥ 0,4) var Determined ved å sammenligne hvordan data adskilt på tvers av vekstnivå, og maksimal veksthastighet (figur 1 A, B). Avhengig av instrumenter og modellsystem brukes dette begrepet kan variere, krever omdefinering av dette kuttet av verdi.
En stor fordel med vår analyse er evnen til å sammenligne fenotyper ved hjelp av en enkelt parameter som karakteriserer generell mikrobiell vekst, som vi definerer som Growth Level (GL). GL er en harmonisk middelverdi, og dermed reduserer effekten av store utliggere i dataene. Bruken av en harmoniske middelverdien med forskjøvet logistikk utstyrt verdier for å gi en oppsummering av veksten var kommet til gjennom prøving og feiling. Andre metoder har forsøkt å skille veksten følger: Tiden det tok for å nå bestemte kurveparametre (halv μ maks, maks μ, og bæreevne), koeffisienten (R 2), og kombinasjoner av de to R multiplisert med bestemte kurveparametre. Ved hjelp av en harmoniske middelverdien med forskjøvetlogistikk-fit verdier for GL gitt det største utvalget i vurderingen av vekst, og dermed ble det den metoden du velger. En vurdering å merke seg er at dynamiske vekstkurve mønstre har potensial for å bli borte når du bruker en enkelt parameter eller et utstyrt modell. For eksempel, de enkelte kurve parametere av den logistiske kurven og GL er i stand til å representere bifasisk vekst. I et enkelt karbon miljø, denne effekten på veksten innebærer formidling av det virale protein enten omdannelse av substratet eller skifte i substratutnyttelse. Ekstra effekter potensielt tapt når ikke vurderer flere vekst parametrene inkluderer: langvarig lag tid, foreslår en økt belastning av viral maskiner eller produkter; raskt akselerer eksponentiell fase, noe som tyder på virale proteiner koplet til vert energiproduksjon veier; eller høyere nivåer av biomasse dannelse, noe som tyder viral støtte i mange næringsopptak og anabolisme (data ikke vist). Dermed plotte begynnende vekstkurver ( Når de vurderer de ulike svarene bidratt med strukturelle og metabolske gener i kartene, er det observert at de ulike substrat klasser i spørsmålet gir størst bevis for protein funksjon. For eksempel er metabolske proteiner ofte forbundet med oppkjøpet av begrensende næringsstoffer, som er uspesifikke som vert sentrale metabolisme 16,32. Foreløpige MAP eksperimenter viser at kloner antatte metabolske fag gener har en økt etterslep fase når dyrket på sentrale metabolisme karbonkilder (Figur 2A). Motsatt kloner bærer mulige strukturelle gener, som krever store andeler av verts energi- og dNTP bassenger, resultere i en falsk positiv respons på vekst for sentral og aminosyre metabolisme karbonsubstrater. Dette er sannsynligvis på grunn av akkumulering av uoppløselige proteiner resulterer i mange filamentering og / eller inklusjonslegemer, som observert gjennom mikroskopi (figur 2A og data ikke vist). Mens videre analyse er nødvendig for å validere disse foreløpige resultatene, kartene er stand til å hente fenotypiske responser som korrelerer til en hypotese funksjoner av spesifikke fag gen klasser. I tillegg til belysning av ukjente virusproteiner, kartene er en roman ressurs for å undersøke den funksjonelle og metabolsk diversitet av en enkeltperson bakterie eller et samfunn av bakterier. MAP komponenter er konstruert for enkel endring for å støtte vekst av en rekke bakterier; inkludert marine, auksotrof, og anaerobe mikrober. For å lette dette arbeidet definert basal og pre-vekstmedier krever ytterligere eller justert kjemiske stoffer før en annen bakterie slekten kan støttes i kartene.Et notat i denne bruken av kartene er å opprettholde definerte medier, som forbyr bruk av ingredienser som trypton, gjærekstrakt og pepton. Metabolomics Feltet av metabolomics er avhengig av metabolitt databaser, som inkluderer isolerte metabolitter identifisert ved massespektrometri. Kjernen anlegget valgt her har en av de største metabolomics databaser. Interessant, var uidentifiserbar (~ 65%) mer enn halvparten av de metabolittene som følge av våre eksperimenter, mens andre hadde aldri før vært registrert i vår vert, Escherichia coli (eksempler: Indole tre eddiksyre 33, salisylsyre 34 og dihydroabietic syre 35). Dette faktum kan tilskrives enten en sterk forspenning av databasen overfor plante metabolitter, eller de spesifikke proteinene som undersøkes. Uansett, er resultatet et begrenset antall kjente metabolitter som er tilgjengelige for datarepresentasjon og analyse. I future, ville flere metabolomics metoder ved hjelp av ulike databaser tillate større metabolitten dekning. I dag, både kjente og ukjente metabolitter blir brukt når man sammenligner og kontrastere våre nye virusproteiner. Ved hjelp av denne tilnærmingen, hypoteser vi at kloner funksjonelt lignende proteiner vil dele en økt likhet i deres fullstendig metabolomic profil. Foreløpige metabolomics analyse viste at mens strukturelle og metabolske gener ikke klart atskilt fra hverandre, de gener som oppviser lignende effekter på verten når den overuttrykkes korrelerer (figur 6). For eksempel, de kommenterte capsid gensamlingene tett med de antatte metabolske gener uthevet i denne studien, EDT2440 og EDT2441. Undersøkelser ved hjelp av en offentlig tilgjengelig trans topologi og signalpeptid prediktor program viste bevis på at begge mulige metabolske gener havn en enkelt transmembrane domene. Interessant 5 out of the ni kloner i den første gruppen gruppen (mest venstre del av dendrogram) ha forutsett transmembrane domenene ved hjelp av den samme topologien program. Videre undersøkelser er nødvendig, er det imidlertid sannsynlig at metabolittene til stede under overekspresjon av disse klonene er forbundet med cellulære stressrespons som følge av membranen eller strukturelle belastninger. Dette bevis støtter at mens metabolomics data besitter en økt mengde støy, er metoden i stand til å fremheve signaler som skiller generelle effektene av gener, både innenfor og på tvers av et gen klasse. For å finne ut om metoden er stand til å trekke ut spesifikk informasjon om gen-funksjon, ble metabolitter gruppert i spesifikke stoffskifte. Hypotesen blir, hvis en klon påvirker metabolitter som er spesifikke for en enkelt bane, og deretter overuttrykt genet er aktivt i denne reaksjonsvei. Før etableringen av vår metabolomics kvalitetssikring rørledningen, foreløpige data viste at over end underrepresenterte metabolitter var typisk "ukjent", som gir lite informasjon på trasé de er tilknyttet (data ikke vist). Preprocessed metabolomics data, men avslører at flertallet av metabolitten profilene er like og bare et utvalgt antall ukjente og kjente metabolitt Forekomsten varierer på tvers av kloner, for eksempel putrescin og uracil (figur 6). Å gi større oppløsning av proteinfunksjons jobbes for å eksperimentelt sammenligne romanen fag gener mot kjente fag gener, som kan brukes til å fylle i "hull" av metabolitten basert funksjonell karakterisering. Den tildelte funksjon av kjente virale gener ved hjelp av denne teknikken, tilveiebringer en referanse for funksjonen av de ukjente gener. Likevel er den begrensende faktoren for metabolomic analyse størrelsen og relevansen av databasen. For å korrigere for disse begrensningene, metabolomic databaser relatable til denne forskningen må utvikles; sliksom en database av metabolittene og deres abundances spesifikke for ASKA innsamling av E. coli-kloner hvor et enkelt ORF er overuttrykt i 36. Bevis for behovet for slike databaser ble gitt i 2013 da forskere ved Lawerence Berkeley National Laboratory utarbeidet den første omfattende database av metabolitter som er spesifikke for hele mutant biblioteker av modell bakterier 37. Denne forskningen gitt ny innsikt i gener som kreves for utnyttelse av spesifikke metabolitter, avslører den klare sammenhengen mellom fenotype og genotype. Når man vurderer metabolomics som et verktøy, er det viktig å definere prosessregime fulgt i kjernen anlegget. En gjenstand av de fleste eksperimentelle prosedyrer er dag-til-dag variasjon forbundet med instrumentene bruk. Hittil alle GC-MS analyse implementerer bruk av interne standarder som er inkludert i hver analysedrevet; men tillegg av prosjektspesifikke interne prøvene </ Em> kjørte hver dag eksperimentering fjerner ekstra varians. Disse hensynene må rettes tidlig for å unngå normaliserings problemer og fordommer. En annen løsning er å behandle alle prøver ved en kjernefasilitet på samme maskin, og som et enkelt parti, en mulighet som er tilgjengelig til enhver kjerne anlegg. De ulike verktøyene både innført og re-undersøkt i dette manuskriptet gi romanen betyr å skjerme og karakter funksjonelt ukjente fag gener. Enkelheten og tilpasning av de eksperimentelle teknikker med effektivisere bruken av beregnings rørledninger sikrer disse metodene er aktuelt for et bredt spekter av forsknings bestrebelser og felt. Vårt mål er at Phenomic tilnærminger presenteres her vil hjelpe ytterligere undersøkelser av nye fag proteiner i tillegg til systemer som er like funksjonelt udefinert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Sterivex Filter | Fisher Scientific | SVGP01050 | Millipore |
| 0.22 µm Millex Filters | Fisher Scientific | SLGV033RS | Millipore |
| 0.22 µm SteriCap Filter | Fisher Scientific | SCGPS02RE | Millipore |
| 0.22 µm Omnipore membrane filters | Millipore | JHWP02500 | Millipore |
| 96-well micro-titer plates | VWR | 82050-764 | Standard F-Bottom 96 well Microplates |
| 2 ml 96-well plate | Fisher Scientific | ||
| Adhesive seal plate film | Sigma-Aldrich | Z369667 | |
| 2 L Nalgene square bottles | Cole Parmer | T-06040-70 | |
| 125 ml Nalgene square bottles | Cole Parmer | T-06040-50 | |
| 1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon | Cole Parmer | EW-45509-04 | |
| Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in. | Cole Parmer | EW-45500-30 | |
| Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in. | Cole Parmer | EW-45500-34 | |
| Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing | Cole Parmer | EW-45505-31 | |
| Male Luer with lock ring x female Luer coupler | Cole Parmer | T-45508-80 | |
| Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD | Fisher Scientific | 6149-0002 | |
| Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD | SaniPure | AR400002 | |
| Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID | SaniPure | AR400007 | |
| Variable flow mini pump (peristaltic pump) | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Magnetic stirrer | Velp Scientifica | F203A0160 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 14-512-141 | Millipore* Filter Forceps |
| Multi-plate spectrophotometer plate reader | Molecular Devices Analyst GT | ||
| Filter manifold | Fisher Scientific | XX10 025 02 | |
| Software: | |||
| Python version 2.7.5 | http://www.python.org/ | ||
| PyLab module | http://wiki.scipy.org/PyLab | ||
| R version 3.0.1 | http://www.r-project.org/ | ||
| reshape2 library | http://had.co.nz/reshape | ||
| ggplot2 library | http://ggplot2.org/ | ||
| Gene Composer | PSI Tech Portal | http://www.genecomposer.net | |
| Services: | |||
| West Coast Metabolomics Center | UC Davis | http://metabolomics.ucdavis.edu | |
| DNA 2.0 | https://www.dna20.com | ||
References
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).
- Hendrix, R. W. Recoding in Bacteriophages. Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).
- Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
- Breitbart, M., et al. Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).
- Dinsdale, E. A., et al. Functional metagenomic profiling of nine biomes. Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).
- Vega Thurber, R. L., et al. Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).
- Pedulla, M. L., et al. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes. Cell. 113 (2), 171-182 (2003).
- Calendar, R., Abedon, S. T. The bacteriophages. , Oxford Univeresity Press. (2006).
- Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).
- Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules. Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).
- Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses. Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).
- Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus. Nature. 424 (6950), 741 (2003).
- Mann, N. H., et al. The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains. Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).
- Lindell, D., et al. Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).
- Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).
- Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations. PLoS biology. 3 (5), e144 (2005).
- Rohwer, F., et al. The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages. Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).
- Miller, E. S., et al. Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage. Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).
- Thompson, L. R., et al. Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).
- Paterson, S., et al. Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution. Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).
- Seguritan, V., et al. Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins. PLoS computational biology. 8 (8), e1002657 (2012).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture Medium for Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).
- Cuevas, D. A., et al. Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles. F1000Research. , (2014).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. , Available from: http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf (2014).
- Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets. BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).
- Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).
- Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PloS One. 6 (3), e17288 (2011).
- Welch, M., et al. Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli. PloS One. 4 (9), e7002 (2009).
- Fiehn, O., et al. Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies. The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).
- Zeng, Q., Chisholm, S. W. Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation. Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).
- Shindy, W. W., Smith, O. E. Identification of plant hormones from cotton ovules. Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).
- Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).
- Chappell, J. The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism. Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research. DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).
- Baran, R., et al. Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype. ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).
