Protocol
आचार बयान: प्रयोगशाला पशु अनुसंधान के लिए संस्थान से आठवीं संस्करण (ILAR, 2011) और थे: सभी पशु प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग और देखभाल के लिए गाइड में प्रदान की दिशा निर्देशों में परिभाषित के रूप में अच्छा पशु अभ्यास के साथ सख्त अनुसार बाहर किया गया मिशिगन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (PRO0001553) ने मंजूरी दे दी।
1. माउस सर्जिकल प्रक्रियाओं
नोट: का प्रयोग 8-10 सप्ताह पुरानी C57BL / 6 चूहों। अन्य उम्र, पृष्ठभूमि, और चूहों के तनाव भी अलग अलग स्थितियों या आनुवंशिक मेकअप परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रक्रिया के tenotomy भाग के लिए, फेस मास्क, बाल बोनट, और बाँझ गाउन, दस्ताने, और उपकरणों का उपयोग करके बाँझ शर्तों को बनाए रखने। सर्जिकल साइटों sterilely povidone आयोडीन और बाँझ draping के साथ तैयार रहना चाहिए। 37 डिग्री सेल्सियस को पुनर्जीवन समाधान एक पशु चिकित्सा हीटिंग पैड का उपयोग और वार्मिंग से हाइपोथर्मिया से बचने के प्रशासन के लिए पहलेtion।
- 2.5% साँस isoflurane माउस का प्रयोग कर anesthetize। आसानी से सुलभ पीठ और हिंद अंगों को छोड़ने के लिए एक नाक शंकु का उपयोग करें। श्लेष्मा झिल्ली की उचित श्वसन दर और रंगाई बनाए रखने के लिए isoflurane के प्रशासन की दर को समायोजित करें और मांसपेशियों टोन, पैर के अंगूठे चुटकी, और corneal पलटा जाँच करके संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए। प्रक्रिया के दौरान सूखी आंख की चोट को रोकने के लिए माउस की आँखों को नरम नेत्र मरहम लागू करें। शल्य चिकित्सा क्षेत्र के नीचे एक पशु चिकित्सा हीटिंग पैड या गर्म पानी फैलानेवाला का उपयोग करने के लिए पर्याप्त शरीर का तापमान बनाए रखें।
- Analgesia के लिए शल्य चिकित्सा के लिए subcutaneously तुरंत पहले, buprenorphine, 0.1 मिलीग्राम / किग्रा प्रशासन।
- बारीकी से घुटने के लिए एड़ी से क़ैंची का उपयोग कर छोड़ दिया हिंद पंजा पर शल्य साइट दाढ़ी।
- बारीकी से रीढ़ की हड्डी के ऊपर शुरुआत और पृष्ठीय midline के बाईं ओर मुंडा क्षेत्र का विस्तार, चोट जला समायोजित करने के लिए एक क्षेत्र में कम से कम 2 सेमी एक्स 3 सेमी समाशोधन, माउस की पीठ दाढ़ी।
- 3 बारी povidone आयोडीन scrubs का उपयोग करते हुए घुटने के लिए हिंद पंजा सहित शल्य साइट तैयार करें।
- छोड़ दिया स्नायुजाल की औसत दर्जे का पहलू के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा प्रदर्शन करते हैं। स्नायुजाल आसानी से देखे जा सकते हैं ताकि चीरा विस्तार; लगभग 0.5 सेमी।
- तेज ऊतक कैंची के साथ मध्य में कण्डरा के तेज विच्छेदन के साथ एक दुखती tenotomy प्रदर्शन करते हैं। कण्डरा के नीचे ऊतक विमान में ऊतक कैंची से एक ब्लेड डालें और ब्लेड कण्डरा मध्य में है जब तक विमान के साथ काटना। तेजी से कण्डरा तोड़ कैंची ब्लेड बंद करें।
नोट: gastrocnemius, soleus, और Plantaris tendons सहित सभी पीछे, tendons का समावेश सुनिश्चित करें। - बाँझ धुंध के साथ दबाव लागू करने से रक्तस्तम्भन पाना (वहाँ कम से कम खून बह रहा है) किया जाना चाहिए और 5-0 Vicryl सिलाई के साथ त्वचा चीरा बंद करें।
- अनुमानित measuremen के साथ 35 ग्राम वजन एक एल्यूमीनियम ब्लॉक के साथ पृष्ठीय आंशिक मोटाई जला सम्पन्नटीएस 2 सेमी x 2 सेमी एक्स 3 सेमी 17 सेकंड के लिए माउस का मुंडा पीठ के लिए लागू एक पानी के स्नान में 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया।
नोट:, हालांकि यानी, ब्लॉक करने के लिए कोई अतिरिक्त दबाव लागू करने से बचने के लिए ब्लॉक की पूरी सतह क्षेत्र माउस के साथ संपर्क में है यह सुनिश्चित करना कि anesthetized माउस के शीर्ष पर ब्लॉक आराम से उपयुक्त जला गहराई को प्राप्त होने की गुरुत्वाकर्षण की अनुमति देते हैं जगह में ब्लॉक पकड़े ही बल। ब्लॉक के एक ओर से जुड़ी एक पतली प्लास्टिक संभाल गर्म पानी से स्नान हेरफेर, स्थिरीकरण, और पुनः प्राप्ति के लिए सुविधाजनक है। यह एक लगभग 30% कुल शरीर सतह क्षेत्र एक 8-10 सप्ताह पुरानी C57BL 6 / माउस में जला पैदा करेगा। इस संपर्क को जलाने के कारण घाव पर जला गहराई की एकरूपता और जानवरों के बीच reproducibility के लिए अन्य तरीकों (लौ जलाने की क्रिया या जला) पर चुना गया था। - धुंध के साथ जला साइट सूखी और एक tegaderm ड्रेसिंग लागू होते हैं।
- गरम पुनर्जीवन तरल पदार्थ प्रशासन: Lactated घंटी समाधान के 1 मिलीलीटरintraperitoneal इंजेक्शन और 0.5 मिलीलीटर चमड़े के नीचे इंजेक्शन। पुनर्जीवन के इस एक बार प्रशासन को जला चोट और tenotomy से वसूली के लिए पर्याप्त है।
नोट: चूहों पूरी तरह से ठीक हो रहे हैं जब तक निगरानी के तहत स्वच्छ पिंजरों में व्यक्तिगत रूप से, अन्य चूहों के साथ आवास पिंजरों को घर से anesthetized चूहों वापस नहीं है। ठेठ वसूली 1-6 घंटा के भीतर होता है। जला साइटों आम तौर पर 2-4 सप्ताह के भीतर ठीक है और साफ आवास के वातावरण में रखा अगर शायद ही कभी घाव संक्रमण से जटिल कर रहे हैं। - Buprenorphine 0.1 मिलीग्राम / किग्रा चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्रक्रिया के बाद 3 दिनों के लिए हर 12 घंटा प्रशासन। उपयुक्त अंतराल पर धारावाहिक μCT स्कैन के साथ हो विकास की निगरानी करें। अस्थानिक हड्डी विकास पहली μCT द्वारा स्पष्ट लगभग 3 सप्ताह के बाद सेशन है।
नोट: हो विकास के बहुमत के बाद सेशन 9 सप्ताह से पूरा हो गया है। हम 15 सप्ताह पर स्कैन μCT एक भी अंत बिंदु की तुलना में 15 सप्ताह के लिए द्वि-साप्ताहिक ओ मात्रा या दोहराया μCT के साथ स्थान में एक फर्क स्कैन नहीं मनाया है।प्रयोगों के अंत में, संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार सीओ 2 साँस लेना के साथ सभी चूहों euthanize और 10 मिनट के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ मौत की पुष्टि करें।
2. μCT अधिग्रहण और विश्लेषण
- प्रवण स्थिति में स्कैनर बिस्तर पर anesthetized माउस सुरक्षित। प्रस्ताव विरूपण साक्ष्य साँस लेने को रोकने के लिए बिस्तर पर सुरक्षित रूप से हिंद अंग टेप। छवि अंशांकन के लिए माउस के नीचे प्रेत युक्त हवा, पानी, और हाइड्रॉक्सियापटाइट शामिल करें।
- अस्थि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और proximally distally हिंद पंजा की टिप करने के लिए संयुक्त कूल्हे से दोनों पिछले पैर शामिल हैं कि ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र को परिभाषित। निम्नलिखित मानकों का उपयोग कर एक छवि से प्राप्त करें:। 80 केवी, 500 μA और 1,300 मिसे जोखिम, 48 माइक्रोन voxel आकार 14,15
- में उचित क्षेत्रों में औसत घनत्व तीन प्रेत कक्षों में से प्रत्येक में एक रॉय ड्राइंग और inputting द्वारा Hounsfield इकाइयों (एच यू) के लिए छवि जांचनासॉफ्टवेयर।
- बाएं पिछले अंग की टिबिया समानांतर Orthotopic cortical हड्डी संरचनाओं और प्रधान कार्यालय के चित्रण के लिए स्पष्ट संरचनात्मक देखें अनुमति देने के लिए z अक्ष के साथ है तो सॉफ्टवेयर में "धरनेवाला" उपकरण का उपयोग, छवि को फिर से पूरबी।
- ओ का सामना करना पड़ा है जब तक कि घुटने में शुरू हुए छवि स्लाइस के माध्यम से distally स्क्रॉल। पुस्तिका तख़्ता उपकरण का उपयोग, पंजा के माध्यम से या ओ पार कर गया है जब तक distally जारी रखने के लिए हर 5 वीं टुकड़ा पर अस्थानिक हड्डी के चारों ओर एक रॉय बनाने के। विस्तार और सब हो गये हैं कि एक आरओआई में एक साथ ROIs सिलाई करने के लिए एक्सट्रपलेशन उपकरण का उपयोग करें।
- एक 3 डी आरओआई बनाओ और विश्लेषण मेनू का चयन करें। सबसे अच्छा हड्डी खिड़की बताते हैं कि निचले और ऊपरी सीमा मूल्यों की स्थापना से हड्डी की मात्रा की गणना। सभी स्कैन के लिए एक ही तय की दहलीज मूल्यों का प्रयोग करें।
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Representative Results
इस वर्तमान अध्ययन में, प्रोटोकॉल आघात के पहले प्रकाशित माउस मॉडल के लिए वर्णित है / हो। 14-17 इस चोट के कारण जला एक आंशिक मोटाई के साथ एक दुखती tenotomy और वैश्विक भड़काऊ अपमान के साथ समवर्ती स्थानीयकृत मांसपेशियों की चोट का निर्माण शामिल प्रेरित जला। इस धारावाहिक इमेजिंग के साथ पीछा किया जा सकता है, जो tenotomy स्थल पर प्रतिक्रियाशील हड्डी के विश्वसनीय गठन में यह परिणाम है। तिथि करने के लिए, दोनों दुखती tenotomy निरंतर और चोट जला दिया है कि (50 से अधिक) सभी चूहों tenotomy स्थल पर प्रधान कार्यालय के एक औसत दर्जे का राशि विकसित किया है। अस्थानिक हड्डी के गठन यों, एक calibrated छवि μCT प्रोटोकॉल प्रत्येक वांछित समय बिंदु पर प्रयोग किया जाता है। दुखती tenotomy के साथ संयोजन में एक जला चोट के अलावा महत्वपूर्ण हो की प्रेरण में महत्वपूर्ण साबित हो गया है। दोनों चोटों समवर्ती हो रहा है के साथ एसी की तुलना में tenotomy साइट पर बनता है कि अस्थानिक हड्डी की राशि में उल्लेखनीय वृद्धि हुई हैhilles tenotomy अकेले (चित्रा 1)। 17
के साथ या समवर्ती जला चोट के बिना दुखती tenotomy निम्नलिखित चित्रा 1. ओ विकास। सभी चूहों बाएं पिछले अंग की एक दुखती tenotomy प्राप्त, चूहों के आधे से भी एक 30% TBSA आंशिक मोटाई पीठ पर चोट जला प्राप्त किया। μCT स्कैन 5 दिन और 3, 5, 7, 9 में पूरा किया गया है, और 15 सप्ताह की चोट के बाद। (ए)। प्रतिनिधि 3 डी पुनर्निर्माण Orthotopic हड्डी सफेद और ओ नीले रंग के साथ दिखाया जाता है। लाल हलकों प्रधान कार्यालय के niduses संकेत मिलता है। अस्थानिक हड्डी tenotomy के क्षेत्र के रूप में अच्छी तरह से कम अंग में चोट साइट के लिए बाहर का और समीपस्थ स्थानों में विकसित करता है। ओ clnically देखा करने के लिए भी इसी तरह, इस प्रतिक्रियाशील अस्थि कंकाल हड्डी के साथ सटे हो या नरम ऊतक में दूर से विकसित कर सकते हैं। (बी)। ओ की मात्रा का ठहराव था कॉमएक calibrated छवि प्रोटोकॉल के साथ pleted और ग्राफ में दिखाया गया है। प्रधान कार्यालय, 15 सप्ताह से परे आम तौर पर 5-9 सप्ताह के बीच देखा सबसे बड़ी वृद्धि वेग के साथ 9-15 सप्ताह के बीच हालांकि विकास पठारों कायम किया है। डाटा * पी <0.05, एन = समूह प्रति 4, छात्र के टी -test, साधन +/- एसडी हैं (यह पहले से 17 से संशोधित डेटा, प्रकाशित किया है कि कृपया ध्यान दें)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
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