Summary
Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) repræsenterer en kilde til patient-specifikke væv til kliniske applikationer og grundforskning. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til at omprogrammere humane perifere mononukleære celler (PBMNCs) opnået fra frosne buffy coats i virale-fri iPSCs anvender ikke-integrerer episomale plasmider.
Abstract
Somatiske celler kan omprogrammeres til induceret pluripotente stamceller (iPSCs) ved at tvinge ekspression af fire transkriptionsfaktorer (oktober-4, Sox-2, KLF-4, og c-myc), typisk udtrykt af humane embryonale stamceller (hESCs) . På grund af deres lighed med hESCs er iPSCs blevet et vigtigt redskab for potentielle patient-specifikke regenerativ medicin, undgå etiske spørgsmål i forbindelse med hESCs. For at opnå celler, der er egnede til klinisk anvendelse, skal genereres for at undgå transgen reaktivering, ændret genekspression og misvisende differentiering transgene-fri iPSCs. Desuden er det nødvendigt med en yderst effektiv og billig omprogrammering metode til at udlede tilstrækkelige iPSCs til terapeutiske formål. Givet dette behov, en effektiv ikke-integrerende episomalt plasmid tilgang er at foretrække valg for iPSC afledning. Øjeblikket den mest almindelige anvendte celletype til omprogrammering formål er fibroblaster, isolering af hvilket kræver vævsbiopsi, en invasive kirurgiske procedure for patienten. Derfor humant perifert blod repræsenterer den mest tilgængelige og mindst invasive væv til iPSC generation.
I denne undersøgelse er en omkostningseffektiv og viral-fri protokol ved at anvende ikke-integrerende episomale plasmider rapporteres til generering af iPSCs fra humane perifere mononukleære celler (PBMNCs) fra frosne fibrinlag efter fuldblod centrifugering og uden densitetsgradient separation.
Introduction
I 2006 gruppen af Shinya Yamanaka 1 demonstreret for første gang, at somatiske celler fra voksne mus og mennesker kan omdannes til en pluripotent tilstand ved ektopisk udtryk for fire omprogrammering faktorer (oktober-4, Sox-2, KLF-4, og c-Myc), genererer de såkaldte induceret pluripotente stamceller (iPSCs) 2. Patientspecifikke iPSCs ligner humane embryonale stamceller (hESCs) i form af morfologi, spredning og evnen til at differentiere til de tre-kim celletyper (mesoderm, endoderm og ektoderm), mens der mangler de etiske betænkeligheder forbundet med brugen af hESCs og omgåelse muligt immunafstødning 3. Således iPSCs fremstå som en af de vigtigste kilder til patient-specifikke celler til grundforskning, narkotika screening, sygdom modellering, evaluering af toksicitet, og regenerativ medicin formål 4.
Adskillige metoder er blevet anvendt til iPSC generation: virale integrere vektorer(Retrovirus 5, lentivirus 6), viral ikke-integrerende vektorer (adenovirus 7), Sendai-virus 8, BAC transposoner 9, episomale vektorer 10, proteiner 11 eller RNA levering 12. Selv om brugen af virus-medieret metoder kan føre til højeffektiv omprogrammering, virale vektorer integreres i genomet i værtsceller og derfor potentielt tilfældig insertionsmutagenese, kan permanent ændring af genekspression, og reaktivering af tavshed transgener under differentiering ikke udelukkes 13.
At gøre iPSCs sikrere for regenerativ medicin, er blevet gjort en indsats for at udlede iPSCs uden integration af exogent DNA i cellulære genomer. Selvom punktafgiftspligtige virale vektorer og transposoner er blevet udviklet, er det stadig uklart, om korte vektorsekvenser, som uundgåeligt forbliver i de transducerede celler efter excision, og transposasen udtryk, kunne fremkalde ændringer i celleular funktion 13. På trods af sin høje omprogrammering effektivitet, Sendai-virus udgør en dyr strategi og nå-through licensaftaler bekymringer med det firma, der udviklede dette system har potentiale til at begrænse dens anvendelse i translationelle studier. Desuden behovet for direkte indføring af proteiner og RNA kræver multiple levering af omprogrammering molekyler med de iboende tekniske begrænsninger Dette indfører, og samlet omprogrammering effektivitet er meget lav 14. Notatet har omkostningseffektive virale-frie og ikke-integrere metoder baseret på anvendelse af episomale plasmider blevet rapporteret for omprogrammering af hudfibroblaster 15. Specifikt i dette arbejde, besluttede vi at bruge kommercielle tilgængelige integration-fri episomale plasmider, som tidligere rapporteret 10,15.
Til dato repræsenterer hudfibroblaster den mest populære donor celletype 5. Imidlertid har andre cellekilder været succeshave formået omprogrammeres i iPSCs herunder keratinocytter 16, knoglemarv mesenchymstamceller 17, adipøst stromaceller 18, hårsækkene 19, og dental pulp celler 20. Isoleringen af disse celler kræver kirurgiske procedurer, og der er behov for flere uger til in vitro celle ekspansion for at etablere en primær cellekultur.
På denne baggrund, udvælgelse af start celletype er kritisk, og det er lige så vigtigt at kunne producere iPSCs fra let tilgængelige og mindre invasive væv såsom blod. Begge navlestrengsblod mononukleære celler (CBMNCs) 21,22 og perifere mononukleære celler (PBMNCs) 14,22-24 repræsenterer egnede kilder til celler til afledning af iPSCs.
Selvom effektiviteten af voksne PBMNC omprogrammering er 20-50 gange lavere end for CBMNCs 22, forbliver den mest bekvemme celletype til formålet prøveudtagning. IFaktisk PBMNC sampling har den fordel af at være minimalt invasiv, og desuden, at disse celler ikke kræver større ekspansion in vitro før omprogrammering eksperimenter. Til dato har forskellige protokoller rapporteret, at PBMNCs efter densitetsgradient separation kan fryses og optøs dage til flere måneder efter frysning og udvidet for få dage før omprogrammering ind iPSCs 22,23. Ikke desto mindre, så vidt vi er opmærksomme ingen rapporter har beskrevet omprogrammering af PBMNCs fra frosne buffy coats. Vigtigere, frosne buffy coats indsamlet uden densitetsgradient separation repræsenterer de mest almindelige blodprøver opbevaret i stor skala biobanker fra befolkningsundersøgelser, hvilket repræsenterer en lettilgængelig pulje af materiale til iPSC produktion, der undgår yderligere indsamling prøve.
Heri rapporterer vi for første gang genereringen af virale-fri iPSCs fra humane frosne fibrinlag, baseret på en tidligere beskrevet protokol 22. IDesuden blev iPSCs genereret fra frosne PBMNCs opnået efter densitetsgradient separation, som en kontrol protokol for de ikke-densitetsgradient oprensede PBMNC resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Perifere mononukleære celler (PBMNCs) blev isoleret fra blodprøver fra raske donorer efter underskrevet informeret samtykke og godkendelse af Etisk Udvalg i provinsen Sydtyrol humane perifere. Eksperimenter blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Alle data blev indsamlet og analyseret anonymt.
1. Isolering af perifere mononukleære blodceller (PBMNCs)
- PBMNCs opnået fra fibrinlag efter fuldblod centrifugering, uden densitetsgradient separation.
- Saml 8 ml venøst perifert blod i et natriumcitrat pufret plastrør, og opbevares ved stuetemperatur (25 ° C). Proces blod inden 12 timer efter indsamlingen.
- Centrifuger røret ved 2000 xg i 15 minutter ved 4 ° C i en svingende spand rotor, skifte-off centrifuge bremser.
- Opsaml overskyet buffy coat (laget mellem den øvre plasma fase og den nedrefase indeholdende de fleste af erytrocytterne), der indeholder den berigede PBMNC fraktion (500 pi) i et kryohætteglas rør.
- Resuspender 500 pi buffy coat med 500 pi 2x frysning medium indeholdende 90% FBS og 20% DMSO, for at opnå et samlet volumen på 1 ml med 10% DMSO-koncentration.
- Frys hætteglasset i en kontrolleret-hastighed frysning beholder ved -80 ° C. Store celler i flydende nitrogen i længere perioder.
- PBMNCs opnået efter densitetsgradient separation
- Saml 12 ml venøst perifert blod i et natriumcitrat pufret plastrør, og opbevares ved stuetemperatur. Proces blod inden 12 timer efter indsamlingen.
- Fortynd blodet med sterilt PBS til et endeligt volumen på 35 ml.
- Forsigtigt og langsomt, lag 35 ml fortyndet blod på 15 ml polysucrose opløsning (anvendt til densitetsgradient separation) (p = 1,077) i en 50 ml konisk rør (forhold 3: 1).
- Centrifugeres røret ved 800 xg i 30 minutter ved stuetemperatur ien svingende spand rotor, skifte-off centrifuge bremser.
- Suge det øverste, gul fase indeholdende plasma og kassér den. Forsigtigt, overføre uigennemsigtig hvid interfase lag, der indeholder PBMNCs til en ny 50 ml konisk rør.
- Bring samlet volumen på 30 ml med sterilt PBS og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes med 30 ml PBS. Tæl antallet af levedygtige celler, baseret på trypanblåteksklusion 25.
- Centrifugér PBMNCs ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur, aspireres supernatanten og kassér den.
- Resuspender cellepelleten i en passende mængde af frysning medium indeholdende 90% FBS og 10% DMSO, for at opnå en koncentration på 5 x 10 6 celler / ml.
- Alikvot 1 ml per hætteglas (ca. 5 x 10 6 celler / ml) og fryse hætteglasset i en kontrolleret-hastighed frysning beholder ved - 80 ° C. Store celler i flydende nitrogen i længere perioder.
2. Optøning og Plating af PBMNCs (dag 0)
- PBMNCs opnået fra fibrinlag efter fuldblod centrifugering, uden densitetsgradient separation.
- At starte protokollen hjælp PBMNCs fra indefrosne fibrinlag, optø 1 hætteglas med celler i et vandbad ved 37 ° C og fortyndes buffy coat med sterilt PBS til et endeligt volumen på 2 ml.
- Overfør den fortyndede buffy coat i en 50 ml konisk rør tilsættes 10 ml af rød celle lysis buffer og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
- For at fremstille 500 ml røde blodlegemer lysisbuffer, tilsættes 0,5 g kaliumbicarbonat, 4.145 g ammoniumchlorid, 100 pi 0,5 M EDTA-opløsning til 500 ml ultrarent vand, pH 7,2-7,4.
- Bring samlede volumen til 50 ml med steril PBS og centrifugere ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og pelleten vaskes med 50 ml sterilt PBS, centrifugeres buffy coat ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender cellerne i1 ml PBMNC medium, der tidligere er beskrevet 22, sammensat af IMDM og Hams F-12 (forhold 1: 1), 1% af Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamin (ITS-X), 1% af kemisk definerede Lipid Concentrate (CDL), 1% Penicillin / Streptomycin, 0,005% af L-ascorbinsyre, 0,5% af bovint serumalbumin (BSA), 1-Thioglycerol (slutkoncentration 200 uM), stamcellefaktor SCF (100 ng / ml), Interleukin -3 IL-3 (10 ng / ml), erythropoietin EPO (2 U / ml), Insulin-lignende vækstfaktor IGF-1 (40 ng / ml), Dexamethason (1 uM) og holo-transferrin (100 pg / ml ).
- Overføre dem til en brønd af en 12-brønds plade med standard vævskultur behandlede overflade, uden belægning, med en tæthed på 2 x 10 6 celler / ml. Inkubere cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i en fugtig inkubator i 48 timer, indtil de skiftende medium trin (se afsnit 3).
- PBMNCs opnået efter densitetsgradient separation
- For at starte protokollen hjælp frosne PBMNCs efterdensitetsgradient separation, tø 1 hætteglas med celler i et vandbad ved 37 ° C, overføres cellerne i 5 ml PBMNC medium. Centrifuger ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Cellerne resuspenderes i 1 ml PBMNC medium og overføre dem i en brønd på en plade med 12 brønde ved en densitet på 2 x 10 6 celler / ml. Inkubere cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i en fugtig inkubator i 48 timer, indtil de skiftende medium trin (se afsnit 3).
3. Kultur og Udvidelse af PBMNCs (DAY 2-13)
- Indsamle PBMNCs i suspensionskultur under anvendelse af en pipette med en 1 ml spids, i en 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 ml frisk PBMNC medium.
- Overfør cellerne i 1 brønd af 12-brønds plade med standard vævskultur behandlede overflade, uden belægning, og inkubere dem ved 37 ° C, 5% CO2 i en fugtig inkubator.
4. Transfektion af PBMNCs med episomale plasmider (dag 14)
Bemærk: Udfør isoleringen af de fire kommercielle intergation-fri episomale plasmider, som bærer de pluripotens gener under anvendelse af et kommercielt kit for plasmid oprensning og vurdere kvaliteten af de oprensede plasmider under anvendelse af en agarosegel-analyse, i henhold til producentens anvisninger.
- Indsamle PBMNCs i 15 ml konisk rør og tælle antallet af levedygtige celler (på grundlag af trypanblåteksklusion) 25.
- Centrifuger 2 x 10 6 celler ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender 2 x 10 6 celler i transfektion blanding indeholdende 100 pi genopslæmningspuffer T og 1 pg af hvert plasmid-DNA (et plasmid, der bærer OCT3 / 4 og shRNA mod p53, et plasmid, der bærer SOX2 og KLF4, enplasmid, der bærer L-MYC og LIN28, og en plasmid, der bærer EGFP, at kontrollere transfektionseffektiviteten).
- Aspirer transfektionsblanding indeholdende cellerne til en 100 pi spids og sæt pipetten med prøven lodret ind i røret, fyldt med 3 ml elektrolyse Buffer E2, som er tilføjet i pipetten station af elektroporation maskine, ifølge producentens instruktioner.
- Effektiv elektroporere celler ved hjælp af følgende program: 1.650 V, 10 msek, 3 pulser.
- Resuspendere elektroporerede celler (2 x 10 6 celler) i 2 ml forvarmet PBMNC medium, tilsætte 0,25 mM natriumbutyrat (NaB) og tælle antallet af levedygtige celler efter elektroporering protokol (på grundlag af trypanblåteksklusion) 25.
- Overfør celler til en brønd i en plade med 6 brønde uden belægning Vip forsigtigt pladen og inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i en fugtig inkubator.
- Dagen efter elektroporering, Count antallet af GFP-positive celler under fluorescensmikroskopi 8-10 tilfældige felter, for at vurdere transfektionseffektiviteten.
- Opretholde de transfekterede celler uden opdeling i 3 dage, indtil plating dem på MEF'er (se afsnit 6).
- Erstatte 2 ml frisk PBMNCs medium plus 0,25 mM NAB hver to dage.
5. Forbered Retter med Feeder-celler for Co-kultur (DAY 16)
- Coate brøndene i en plade med 6 brønde med 1 ml basalmembranmatrix i 15 minutter ved 37 ° C og plade mus embryonale fibroblaster (MEF'er) ved en densitet på 2 x 10 5 celler / brønd med 2 ml 10% FBS indeholdt DMEM (MEF medium) en dag før passage af elektroporerede PBMNCs på MEF feeder-celler.
6. Belægning transficerede PBMNCs onto MEF'er (DAY 17-19)
- Indsamle PBMNCs i suspensionskultur under anvendelse af en pipette med 1 ml spids, i 15 ml koniske rør og centrifugeres transficeret PBMNCs ved 300 xg i 10 minved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 2 ml frisk PBMNC medium, plus 0,25 mM NaB.
- Plate cellerne onto MEF-coatede 6 brønd-plade og inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i en fugtig inkubator.
- Efter to dage, suge mediet og erstatte det med 2 ml iPSC medium bestående af knockout DMEM (KO-DMEM), 20% KO-Serum Replacement (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% penicillin / streptomycin, 20 mM L- glutamin, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 10 ng / ml FGF (basic bFGF) og 0,25 mM NaB.
- Erstat 2 ml frisk iPSC medium hver dag og tjek cellerne dagligt.
Bemærk: På omkring dag 22-25, bør de første kolonier af iPSCs være synlige.
7. Picking og udvidelse af induceret pluripotente stamceller (iPSCs) Kloner (DAY 30-35)
Bemærk: På omkring 30-35 dage efter transfektion, bør IPSC kolonier være klar til plukning og genudpladning. Omprogrammering effektivitet bør være estiparret som procentdelen af antallet af IPSC kolonier / totale antal elektroporerede celler, som tidligere rapporteret 26.
- Dagen før passage IPSC kolonier, forberede MEF feeder i en plade med 12 brønde (1,25 x 10 5 celler / brønd).
- Aspirer MEF medium og ændre med 1 ml iPSC medium med 10 ng / ml bFGF og 10 pM Y-27632. Manuelt dissekere med en nål en koloni på hvert tidspunkt under dissektionsmikroskop i plukning-hætte for at opnå et gitter, indsamle mindre klumper ved pipettering og overføre dem enkeltvis hver i en brønd af 12-brønds plade overtrukket med MEF'er.
- Passage og udvide hver 12-brønds plade til en plade med 6 brønde i et forhold 1: 2, derefter hver 6-brønds plade i et forhold 1: 4 for yderligere formering. Dissekere og udvide iPSCs manuelt i de første 2-3 passager (så grundigt beskrevet i trin 7.2), og brug derefter et enzym dissociation procedure (start fra trin 7.4).
- For et enzym dissociation protokol, ren iPSC Colonies ved opsugning differentierede dele under dissektionsmikroskop i plukning-hood.
- Inkuber iPSCs med 1 ml collagenase IV (1 mg / ml) i 10 minutter ved 37 ° C.
- Aspirere enzymopløsningen, skylles cellerne med 1 ml af KO-DMEM og indsamle kolonierne i en 15 ml konisk rør. Centrifuger ved 100 xg i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer supernatanten, resuspender kolonier i 2 ml iPSC medium med 10 ng / ml bFGF og 10 pM Y-27632 og plade dem på MEF-overtrukne plade med 6 brønde (forhold 1: 4).
8. Karakterisering af iPSCs (Mellem 5-15 Passager)
- Alkaline Phosphatase Farvning
- Kultur IPSC kolonier i 3-5 dage i iPSC medium med 10 ng / ml bFGF.
- For at starte en alkalisk phosphatase farvningsprotokollen, skylles iPSCs gang med PBS og derefter rette dem med 1 ml 4% PFA i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne tre gange med PBS, til fjernelse af resterende PFA.
- Stain fikserede celler under anvendelse afen kommerciel alkalisk phosphatase-farvning kit ifølge producentens instruktioner.
- Immunofluorescens
- Kultur IPSC kolonier i 3-5 dage i iPSC medium med 10 ng / ml bFGF.
- For at starte en immunofluorescensbestemmelse, vask iPSCs gang med PBS og derefter rette dem med 1 ml 4% PFA i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne tre gange med PBS, til fjernelse af resterende PFA.
- Behandle faste iPSCs med 1 ml permeabilisering / blokerende opløsning indeholdende 4% gedeserum, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 og 0,05% natriumazid (NaN3) i 1 time ved stuetemperatur.
- Aspirer blokerende opløsning og inkuber de fikserede celler med primære antistoffer i 3% BSA og 0,05% NaN3-opløsning O / N ved 4 ° C (se materiale tabel for primært antistof liste og foreslog antistof fortyndingsfaktor).
- Den næste dag, vaskes iPSCs tre gange med PBS, derefter inkubere cellerne med Alexa Fluor 488 ged anti-mus og Alexa Fluor 555 gede-anti-kanin-antistoffer, fortyndet 1: 1.000 i 3% BSA og 0,05% NaN3-opløsning i 1 time ved 37 ° C.
- Plette kerner med DAPI (1 ug / ml) i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke, efterfulgt af tre gange vask med PBS.
- Differentiering af iPSCs i embryoide Bodies (EB)
- Kultur IPSC kolonier for 5-6 dage i iPSC medium med 10 ng / ml bFGF.
- Fjern differentierede dele fra IPSC kolonier ved sugning under dissektionsmikroskop i pluk-hætte.
- Inkuber iPSCs med 1 ml collagenase IV (1 mg / ml) i 10 minutter ved 37 ° C.
- Aspirere enzymopløsningen, skylles cellerne med 1 ml af KO-DMEM og indsamle kolonierne i en 15 ml konisk rør. Centrifuger ved 100 xg i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer supernatanten og resuspender kolonierne i 2 ml EB medium sammensat af KO-DMEM, 20% defineret føtalt bovint serum (FBS), 1 mM NEAAs, 1% Penicillin / Streptomycin, 20 mM L-glutamin, 0,1 mM46; mercaptoethanol.
- Plate IPSC kolonier i suspension i 6 dage på ultralave tillæg 6-brønds plader, med henblik på at tillade dannelse af kugleformede tredimensionale embryoide legemer (EBS). Skift 2 ml frisk EB medium hver to dage.
- På dag 7, indsamle EB'er og pladen dem på 0,1% gelatineovertrukne 6-brønds plader i 2 ml EB-medium og opretholde EB'er i differentiering i 20 dage.
- Skift 2 ml frisk EB medium hver to dage.
- QRT-PCR for genekspressionsanalyse
- Kultur IPSC kolonier for 5-6 dage i iPSC medium med 10 ng / ml bFGF.
- Uddrag totalt RNA fra PBMNCs, iPSCs eller EB anvendelse af 1 ml kommerciel reagens i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Evaluere RNA koncentration og renhed ved egnede metoder, såsom anvendelse af et spektrofotometer (høj kvalitet RNA med A260 / A280 og A260 / 230-forhold> 1,8) 27.
- CheckRNA integritet ved anvendelse af et kommercielt kit ifølge producentens protokol (høj kvalitet RNA RQI> 9,5) 28.
- Udføre en reverse transkription-reaktion på 1 ug totalt RNA under anvendelse af et kommercielt revers transkriptase-kit i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Forbered qPCR blandinger indeholdende 5 ng cDNA skabelon, 7,5 pi SYBR GREEN Supermix, 2 pi af 5 pM primere (forward: 1 pi og omvendt: 1 pi) og 6 pi RNase / DNase-frit vand for hver reaktion 29.
- Udfør QRT-PCR under anvendelse af følgende program: en indledende denatureringstrin ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler opdelt i et denatureringstrin ved 95 ° C i 15 sek og primer annealing og forlængelse trin ved 60 ° C i 45 sek 29.
- Normalisere ekspressionen af andre gener under anvendelse af GAPDH som housekeeping-gen 28 (se primerne anført i tabel 1).
- qPCRfor Transgene Udelukkelse
- Uddrag DNA fra PBMNCs eller iPSCs anvendelse af 1 ml lysepuffer indeholdende 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% natriumdodecylsulfat (SDS) og 20 ug / ml proteinase K.
- Tilsættes samme mængde (1 ml) på 100% isopropanol, bland ved inversion tre gange for at muliggøre DNA præcipitation og centrifugeres ved 10.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, vaskes DNA-pelleten med 1 ml 70% ethanol og centrifugeres ved 10.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer og kassér supernatanten og resuspender den i RNase / DNase-frit vand.
- Evaluere DNA-koncentration og renhed ved hjælp af egnede metoder, såsom anvendelse af et spektrofotometer (høj kvalitet RNA med A260 / A280 og A260 / 230-forhold> 1,8) 27.
- Forbered qPCR blandinger indeholdende 5 ng DNA-skabelon, 7,5 pi SYBR GREEN Supermix, 2 pi 5 pM primere (forward: 1 pi og omvendt: 1 pi) og 6 &# 181; l RNase / DNase-frit vand for hver reaktion 29.
- Normalisere ekspressionen af specifikke episomalt plasmid EBNA-1-genet under anvendelse FBX-15 som housekeeping-gen 29 (se primerne anført i tabel 1).
- Karyotype Analysis
- Kultur IPSC kolonier for 5-6 dage onto fødefri basalmembranmatrix overtrukne plade med en kommerciel defineret, fødefri vedligeholdelsesmedium for iPSCs efter producentens anvisninger.
- At starte karyotype analyse protokol, løsnes IPSC kolonier med 1 ml celle løsrivelse opløsningen i 5 minutter ved 37 ° C, indtil der opnås encellede dissociation.
- Indsamle celler og centrifugeres ved 400 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender iPSCs i 2 ml af en medium specielt udviklet til dyrkning af celler til prænatal diagnostik teknikker. Plade encellede iPSCs onto basalmembranmatrix belagt glas retter og inkuberes dem i et 37 ° C, 5% CO 2 </ Sub> inkubator.
- Efter 2-4 dage, der tilsættes 10 pl / ml colchicin direkte til kulturerne og inkuberes i 3 timer ved 37 ° C, 5% CO2 i en fugtig inkubator.
- Aspirere mediet og inkuberes iPSCs i 1 ml af en hypotonisk opløsning (0,6% natriumcitrat og 0,13% kaliumchlorid) i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl celler med 1 ml 5% eddikesyreopløsning og løse iPSCs med methanol / eddikesyre-opløsning (forhold 3: 1) i en maskine med kontrolleret temperatur og fugtighed (28 ° C, 42% rH).
- Fordybe og bejdse fikserede celler med Quinacrine opløsning i 15-20 min ved stuetemperatur i mørke (for at opnå Q-banding) 30.
- Erhverve celle metafaser under et fluorescens mikroskop ved 100X forstørrelse 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse en enkel og effektiv protokol til generering af virale-fri iPSCs ved omprogrammering af PBMNCs isoleret fra frosne fibrinlag efter fuldblod centrifugering og sammenligning med omprogrammering af PBMNCs opnået efter densitetsgradient separation er rapporteret. Figur 1A viser en skematisk fremstilling af den detaljerede protokol. Efter optøning de isolerede PBMNCs, der viser en typisk afrundet form, ekspanderes i specifik blod dyrkningsmedium i 14 dage (figur 1B) og derefter transficeret med episomale plasmider. Efter 10-15 dage efter transfektion, små afrundede lyse kolonier med definerede marginer og embryonale stamceller-lignende morfologi begynder at dukke (figur 1C). Ca. 20-30 dage efter transfektion, IPSC kolonier bliver meget kompakt, med skarpe kanter, øge deres størrelse og er klar til plukning og ekspansion (figur 1D). Efter de første overførselsteknikker trin (2-3 passager),IPSC kolonier opretholde deres udifferentierede tilstand og vise en typisk embryonale-stamceller morfologi menneske. I de første passager, manuel plukning er en mere effektiv måde ekspansion sammenlignet med enzym dissociation for at vælge fuldt udifferentieret, kompakt og tæt pakket kolonier (figur 2A). Større forstørrelse af IPSC kolonier viser individuelle celler inden kolonierne og den høje kerne til cytoplasma forholdet er lettere observeret (figur 2B). Efter indledende mekanisk plukning, er valgt IPSC kloner ekspanderet med enzym dissociation hjælp Collagenase IV. Efter 10-15 passager af in vitro ekspansion, er cytogenetisk analyse udført på IPSC kolonier. Omkring 20 metafaser fra mindst to uafhængige kulturer, ved ca. 300-400 band niveau, analyseres og alle prøver viser en normal karyogram (figur 2C). Denne observation tyder på, at iPSCs er genetisk stabil.
Aftis in vitro ekspansion (5-10 passager), er iPSCs karakteriseret til ekspression af stemness markører og deres pluripotens potentiale. Figur 3A, B viser, at iPSCs er positive for alkalisk phosphatase-farvning. Brug af QRT-PCR-analyse, har vi bekræftet, at iPSCs udtrykker endogene pluripotente gener (SOX-2, OCT3 / 4, Nanog) til væsentligt højere niveauer end startende PBMNCs, mens ekspressionsniveauer af endogen C-MYC og KLF-4 er ens før og efter iPSC omprogrammering (figur 3C). Efter kun 5 passager i kultur, kan ekspression af exogene episomale transgener ikke påvises i iPSCs, hvilket således indikerer den vellykkede aktivering af endogene pluripotente gener. PBMNCs 5 dage efter transfektion, med stærke transgenekspressionsniveau, vurderet ved episomale specifikke primere for EBNA-1, anvendes som positiv kontrol. PBMNCs, der aldrig udsat for plasmider, der bærer de 4 eksogene pluripotens gener, anvendes som negativ kontrol (Fifigur 3D). Endelig immunofluorescensanalyse viser, at iPSCs ekspres pluripotens markører, såsom OCT3 / 4, SOX-2, SSEA-4, TRA-1-60, og TRA-1-81 (Figur 4).
iPSCs er differentieret i embryoide legemer (EBS) under anvendelse af en spontan differentiering protokol, som vist i figur 5A, med henblik på at vurdere deres in vitro pluripotens potentiale. QRT-PCR-forsøg viser, at iPSCs er i stand til at differentiere til celler af de tre kimlag; ja, EB opnået efter 20 dages differentiering display signifikant opregulering af afstamning markører repræsentative for endoderm (SOX-7, AFP), mesoderm (CD31, ACTA-2, CDH-5, RUNX-1) og ektoderm (KTR- 14, TH, GABRR-2) (figur 5B). Konfokal mikroskopi analyse viser, at single-celle dissocierede slå klynger udtrykker typiske cardiomyocyte markører såsom troponin I (Tn-I) og α-actinin, organiseret på en klar sarcomerisk mønster (figur6A). Desuden immunofluorescensanalyse af EB'er viser en positiv farvning for neuron-specifikke markør klasse III β-tubulin (TUJ1) samt for det dopaminerge neuronale markør tyrosin hydroxylase (TH) (figur 6B).
Figur 1. Protokol til generering af iPSCs fra humant perifert blod og celler morfologiske ændringer under protokollen. (A) Diagram over den anvendte protokol til at generere iPSCs fra frosne PBMNCs efter DGS og PBMNCs isoleret fra frosne fibrinlag ved hjælp af en enkelt transfektion af ikke-integrerende episomale plasmider. (B) Repræsentative billeder af prolifererende PBMNCs opnået fra DGS og buffy coats efter optøning og ekspansion i kultur i 14 dage, inden de blev transficeret. Scale bar 100 pm. (C) Eksempler på IPSC kolonier en uge efter cellerne er plated om MEF'er. Scale bar 500 pm. (D) Repræsentative billeder af IPSC kolonier på 30-35 dage efter re-plating på en MEF feeder-lag. Scale bar 500 pm. iPSCs = inducerede pluripotente stamceller; DGS = densitetsgradient separation; PBMNCs = perifere mononukleære celler; MEF'er = mus embryonale fibroblaster; GFS = vækstfaktorer; bFGF = basisk fibroblastvækstfaktor; NaB = natriumbutyrat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Morfologi og karyotype analyse. (A) Repræsentative billeder af IPSC kolonier efter 2-3 manuelle overførselsteknikker trin. Scale bar 500 pm. (B) Større forstørrelse af IPSC kolonier. Scale bar 200 pm. (C) representative normale karyograms fra iPSCs efter 10-15 passager af in vitro ekspansion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. iPSC karakterisering: alkalisk phosphatase-aktivitet, re-ekspression af endogene pluripotency gener af iPSCs og evaluering af transgen silencing (A) og (B) Repræsentative billeder viser positiv farvning for alkalisk phosphatase.. Scale bar 500 pm. (C) Søjlediagrammet viser re-ekspressionen af endogene pluripotency gener (c-myc, KLF-4, SOX-2, OCT3 / 4 og NANOG) i begge iPSCs opnået fra DGS og fibrinlag ved hjælp QRT-PCR-analyse ( n = 4, Student t-test: * p <0,05, § p <0,005 vs. tilsvarende PBMNCs). (D) QRT-PCR med episomale-specifikke primere (EBNA-1) (i forhold til kontrol FBOX15 primere) viser ingen genom-integration af episomale vektorer. (N = 4, Student t-test: * p <0,001 vs. tilsvarende PBMNCs 5-dages transfektion). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Immunofluorescensanalyse af embryonale stamceller pluripotens markører. Repræsentant immunfluorescensfarvning viser signifikant udtryk for pluripotens proteiner SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, OCT3 / 4 og SOX-2. Kerner modfarvet med DAPI. Scale bar 200 pm for iPSC DGS (A) og iPSC Buffy coat (B). Scale bar 100 um for iPSC Buffy coat (A), iPSC DGS (B strong>) og (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Protokol for differentieringen af iPSCs og ekspressionen af tre kim lag gener i EB'er fås fra iPSCs. (A) Skematisk repræsentation af protokollen fremkalde spontane differentiering af iPSCs fra PBMNCs efter DGS og buffy coats i EB'er. (B) QRT-PCR-forsøg, der viser ekspression af alle tre kimlag gener: endoderm (SOX-7, AFP), mesoderm (CD31, ACTA-2, CDH-5, RUNX-1), ektoderm (KRT-14, TH, GABRR-2) i EB'er efter 20 dages differentiering (n = 4, Student t-test: * p <0,05 vs. tilsvarende iPSCs modstykke). EBS = embryoide organer./52885/52885fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Konfokal mikroskopi analyse af hjerte- og neuronale proteiner i EB'er på dag 20 af differentiering fås fra PBMNCs efter DGS og buffy coats-afledte iPSCs. (A) Repræsentative billeder (maksimal projektion af konfokal billedstak) for hjerte-sarcomerisk proteiner α-actinin og troponin I (Tn-I) i enkelt-celle dissocieres slå områder (skala bar 10 um) og (B) for neuron-specifik markør klasse III β-tubulin (TUJ1) og den dopaminerge neuronal markør tyrosin hydroxylase (TH) (skala bar 20 pm). Kerner er modfarvet med DAPI. Klik her for at se en større version afdette tal.
| Primer | Sekvens | ||
| C-MYC-fw | 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3 ' | ||
| C-MYC-rev | 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3 ' | ||
| KLF-4 fw | 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3 ' | ||
| KLF-4 rev | 5'- AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG-3 ' | ||
| SOX-2 fw | 5'- GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3 ' | ||
| SOX-2 rev | 5'- TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3 | ||
| OCT3 / 4 fw | 5'- GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3 ' | ||
| OCT3 / 4 rev | 5'- CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3 ' | ||
| NANOG fw | 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3 ' | ||
| NANOG rev | 5 &# 8242; -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3 ' | ||
| SOX-7 fw | 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3 ' | ||
| SOX-7 rev | 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3 ' | ||
| AFP fw | 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 ' | ||
| AFP rev | 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3 ' | ||
| CD31 fw | 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3 ' | ||
| CD31 rev | 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3 ' | ||
| ACTA-2 fw | 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3 ' | ||
| ACTA-2 rev | 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3 ' | ||
| CDH-5 fw | 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3 ' | ||
| CDH-5 rev | 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3 ' | ||
| RUNX-1 fw | CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3 ' | RUNX-1 rev | TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3 ' |
| KRT-14 fw | 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3 ' | ||
| KRT-14 rev | 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3 ' | ||
| TH fw | 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3 ' | ||
| TH rev | 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3 ' | ||
| GABBR-2 fw | 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3 ' | ||
| GABBR-2 rev | 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3 ' | ||
| EBNA-1 fw | 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3 ' | ||
| EBNA-1 rev | 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3 ' | ||
| GAPDH fw | 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3 ' | ||
| GAPDH rev | 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 ' |
Tabel 1: Liste over QRT-PCR primere Primersekvenser anvendt til evaluering af endogen pluripotens genekspression, transgen lyddæmpning og udtryk for tre kim lag markører..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I fortiden, den eneste måde at opnå menneskelige pluripotente stamceller bærer en bestemt genetisk mutation var at rekruttere forældre gennemgår præ-implantation genetisk diagnose og generere embryonale stamceller fra deres kasserede blastocyster 31,32. Ved hjælp af en omprogrammering tilgang, kan forskerne nu generere iPSCs fra patienter, der bærer stort set alle genotype. Muligheden for at starte fra et patient-specifik cellelinie og en let tilgængelig kilde er meget vigtigt, da det tillader en undersøgelse af patofysiologien af lidelser og efterfølgende identifikation af hidtil ukendte terapeutiske fremgangsmåder.
I den foreliggende undersøgelse, kombinerede vi en plasmid tilgang 15 med en fremgangsmåde, der allerede anvendes til at producere iPSCs fra PBMNCs tidligere frosne efter densitetsgradient separation 22 og held genererede virusfri iPSCs fra frosne buffy coat PBMNCs. Anvendelsen af fibrinlag stedet for densitetsgradient adskilt PBMNCs alleOWS os at reducere omkostningerne, arbejdstid og manuelle trin for operatører under prøve behandling. Det set-up af en low-cost-protokol hjælp PBMNCs fra frosne buffy coats er afgørende for studier med forhøjet antal deltagere og for prøve samlinger i multi-center studier. Vigtigt er, evnen til at producere iPSCs fra frosne fibrinlag giver adgang til mange frosne biosamples allerede er lagret i blodbanker, ved anvendelse af en enkel, omkostningseffektiv og ikke så tidskrævende fremgangsmåde til prøveindsamling.
Denne induktion metode kan være nyttig til afledningen af patientspecifikke integration-fri iPSCs, hvor kolonier er karakteriseret ved fravær af episomale transgen efter kun få passager (≥5 passager) i begge udgangsmaterialer. Bemærkelsesværdigt, vi observerede, at alle de valgte IPSC kolonier opnået fra begge typer af udgangsmateriale display sammenlignelige pluripotens funktioner og bevarelse af cellulære og molekylære ligheder til hESCs, indicaTing en succesfuld iPSC afledning og en konsekvent reproducerbarhed af protokollen.
Endvidere har vi med succes genereret iPSCs fra mere end 10 humane hudfibroblast- og 3 kardiale mesenchymale stromale cellelinier (både fra raske donorer og patienter med hjerte- og skeletmuskulatur-sygdomme) ved hjælp af denne metode (data ikke vist), hvilket antyder, at den beskrevne protokol kan anvendes til vellykket omprogrammering af forskellige celletyper. Men valget af blod som udgangsmateriale er fordelagtigt i forhold til fibroblaster, især når man tænker at omfattende udvidelse af fibroblaster in vitro kan påvirke effektiviteten af omprogrammering, baseret på fibroblast passage nummer og proliferationshastighed 33,34. Vores protokol tillader også generering af transgene-fri iPSCs fra frosne buffy coats efter en minimal kultur tid og dermed reducere med omkring 3-4 uger den nødvendige tid til afledning af iPSCs i forhold til andre kilder, såsom fibroblasts. Endvidere nyere undersøgelser vist, at blod celleafledte iPSCs vise en epigenetisk signatur, der mere ligner hESCs end dem opnået fra mesenkymale stamceller (MSC) / fibroblaster 14,35.
På trods af den succesfulde generation af iPSCs fra frosne buffy coats, skal overvejes i denne protokol et par begrænsninger. Før omprogrammering induktion, kunne forstærkningen af PBMNCs fra frosne buffy coats repræsenterer et kritisk trin i protokollen. Kvaliteten af udgangsmateriale kan kraftigt påvirke valget og isolering af PBMNCs, for at opnå tilstrækkelige celleantal til omprogrammering procedure (mindst 2 x 10 6 celler for elektroporering). Dette skyldes hovedsagelig, at iboende biologiske variabilitet af prøverne, men også tekniske spørgsmål. Faktisk amplifikation af PBMNCs fra frosne fibrinlag er mindre effektiv i forhold til PBMNCs opnået fra densitetsgradient separation, som følge af en stærk degighed på manuel operatør variabilitet. For at øge reproducerbarhed og effektivitet PBMNC amplifikation fra frosne fibrinlag uden densitetsgradient separation er anvendelsen af automatiserede systemer anbefales kraftigt at indsamle buffy coat fraktioner. Selv om det er vanskeligere at udvide et tilstrækkeligt antal PBMNCs fra fibrinlag end PBMNCs efter densitetsgradient separation, effektiviteten af omprogrammering (ca. 0,001-,0005%) af de to udgangsmaterialer er sammenlignelig, ifølge blod omprogrammering effektivitet tidligere rapporteret 14, 23. Da omprogrammering effektivitet er lav til regenerativ medicin formål, anvendelse af forbedrede EBNA1 / OriP (fra Epstein-Barr virus, EBV) episomale vektorer kan øge antallet af IPSC kolonier til fremtidig celleterapi udvikling 22,36. Derudover er en MEF fødelag for iPSC generering og vedligeholdelse anvendes i vores protokol. For at opnå klinisk kvalitet iPSCs kunne en feeder-fri kultur være et alternative metode til yderligere undersøgelser.
Afslutningsvis denne protokol udgør en gyldig metode til at generere iPSCs fra en let tilgængelig patient celle kilde med den store fordel af anvendelse af et ikke-integreret system, der potentielt kan anvendes til afledningen af klinisk kvalitet iPSCs, ikke kun for sygdomsmodeller men også for en fremtidig personlig medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
- Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
- Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
- Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
- Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
- Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
- Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
- Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
- Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
- Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
- Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).
