Cellules souches pluripotentes induites (CISP) représentent une source de tissus spécifiques au patient pour des applications cliniques et la recherche fondamentale. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour reprogrammer les cellules humaines périphériques mononucléaires du sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés en CSPi virales sans l'aide de non-intégration des plasmides épisomiques.
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Article de méthode
Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules somatiques peuvent être reprogrammées en cellules souches pluripotentes induites (CISP) en forçant l'expression de quatre facteurs de transcription (Oct-4, Sox-2, KLF-4, et c-Myc), généralement exprimé par les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) . En raison de leur similitude avec les CSEh, CSPi sont devenus un outil important pour la médecine régénérative potentiel spécifique au patient, en évitant les questions éthiques liées aux CSEh. Afin d'obtenir des cellules appropriées pour une application clinique, CSPi gratuitement transgènes doivent être générés pour éviter transgène réactivation, l'expression du gène altéré et la différenciation erronée. En outre, un procédé de reprogrammation est performant et peu coûteux est nécessaire pour obtenir iPSCs suffisantes à des fins thérapeutiques. Compte tenu de cette nécessité, une approche efficace non-intégration plasmide épisomique est le choix préférable pour iPSC dérivation. Actuellement type cellulaire le plus couramment utilisé à des fins de reprogrammation sont les fibroblastes, dont l'isolement nécessite une biopsie tissulaire, un invasive intervention chirurgicale pour le patient. Par conséquent, le sang périphérique humain représente le tissu le plus accessible et moins invasif pour la génération iPSC.
Dans cette étude, un protocole de rapport coût-efficacité et virale sans l'aide de non-intégrant des plasmides épisomiques est signalé pour la génération de iPSCs à partir de cellules mononucléaires périphériques humaines dans le sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés après centrifugation de sang entier et sans séparation en gradient de densité.
Introduction
En 2006, le groupe de Shinya Yamanaka 1 a démontré pour la première fois que des cellules somatiques de souris et les humains adultes peuvent être convertis en un état pluripotent par l'expression ectopique de quatre facteurs de reprogrammation (Oct-4, Sox-2, KLF-4, et c-Myc), générer les soi-disant cellules souches pluripotentes induites (CISP) 2. CSPi spécifiques au patient ressemblent étroitement à des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en termes de morphologie, la prolifération et la capacité de se différencier en types de cellules de trois de germe (mésoderme, endoderme et ectoderme) tout en manquant les préoccupations éth....
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Protocole
Des cellules mononucléaires du sang (de PBMNCs) ont été isolés à partir d'échantillons sanguins périphériques humains de donneurs sains après consentement éclairé signé et l'approbation du comité d'éthique de la province du Tyrol du Sud. Des expériences ont été menées en conformité avec les principes énoncés dans la Déclaration d'Helsinki. Toutes les données ont été recueillies et analysées de façon anonyme.
1. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMNCs)
- PBMNCs obtenus à partir de couches leucocyto-plaquettaires après centrifugation de sang entier, sans séparation de gradient de densité. ....
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Résultats
Dans cette étude, un protocole simple et efficace pour la génération de iPSCs viraux exempts de reprogrammation de PBMNCs isolées à partir de couches leucocytaires congelée après centrifugation du sang total et la comparaison avec une reprogrammation de PBMNCs obtenus après séparation par gradient de densité est rapportée. La figure 1A montre une représentation schématique de le protocole détaillé. Après décongélation, les PBMNCs isolées, montrant une forme typique arrondie, sont développées dans un mil.......
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Discussion
Dans le passé, la seule façon d'obtenir des cellules souches pluripotentes humaines porteuses d'une mutation génétique particulière était de recruter les parents subissant un diagnostic génétique pré-implantatoire et de générer des cellules souches embryonnaires à partir de leurs blastocystes rebut 31,32. En utilisant une approche de reprogrammation, les chercheurs peuvent désormais générer des CSPi de patients porteurs de pratiquement tout le génotype. La possibilité de démarrer à partir d'une li.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
L’étude a été soutenue par le ministère de la Santé et le Département de l’aide à l’éducation, de l’université et de la recherche de la province autonome de Bolzano et la Fondation Sparkasse du Tyrol du Sud.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube en plastique Venosafe tamponné au citrate de sodium | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Chlorure d’ammodium | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Bicarbonate de potassium | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA poudre disodique | Sigma-Aldrich | E5134 | Solution 0,5 M |
| Ficoll-Paque Premium ; | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Solution de polysaccharose pour la centrifugation par gradient |
| de densité Milieu de Dulbecco modifié d’Iscove (IMDM) ; | Gibco | 21056-023 | Sans phénol rouge |
| Jambon F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insuline-Transférrine-Sélénium-Éthanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 ; | 1X (Stock : 100X) |
| Concentré lipidique chimiquement défini | Gibco | 11905031 | 1X (Stock : 100X) |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Acide L-ascorbique 2-phosphate sesquisel de magnésium hydraté | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycérol | Sigma-Aldrich | M6145 | Concentration finale à 200 µ ; |
| M Facteur de cellules souches humaines recombinantes (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock : 100 & micro ; g/ml) ; |
| Interleukine-3 humaine recombinante (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock : 10 & micro ; g/ml) |
| Facteur de croissance analogue à l’insuline humaine recombinante (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock : 40 µ ; g/ml) |
| Érythropoïétine humaine recombinante (EPO) | R& D Systems ; | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock : 50 U/ml) |
| Dexaméthasone ; | Sigma-Aldrich | D2915 1 | &mu ; M (Stock : 1 mM) |
| Holo-Transferrine Humaine | R& D Systems ; | 2914-HT | 100 &mu ; g/ml (Stock : 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Milieu pour l’analyse cytogénétique |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Milieu pour culture sans nourricier d’iPSC |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum | Replacement Gibco | 10828-028 | |
| Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| Solution d’acides aminés non essentiels MEM (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-mercaptoéthanol ; | Gibco | 31350-010 | 0,1 mM (Stock : 50 mM) |
| Butyrate | de sodium Sigma-Aldrich | B5887 | 0,25 mM (Stock : 0,5 M) |
| FGF humain recombinant basique, 145 aa ; | R& D Systems ; | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock : 10 & micro ; g/ml) |
| Y-27632 dichlorhydrate | Sigma-Aldrich | Y0503 ; | 10 et micro ; M (Stock : 10 mM) |
| Sérum bovin défini fœtal | Hyclone SH 30070.03 | ||
| EmbryoMax 0,1 % Solution de gélatine | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Membrane basale Matrice Facteur de croissance Réduit | BD Biosciences | 354230 | |
| Colgénase de type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock : 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Solution de détachement cellulaire |
| Fibroblaste embryonnaire de souris (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well |
| plate Plasmide pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene ; | 27077 | 1 et micro ; g (Stock : 1 µ ; g/µ ; l) |
| Plasmide pCXLE-hSK | Addgene ; | 27078 | 1 et micro ; g (Stock : 1 µ ; g/µ ; l) |
| Plasmide pCXLE-hUL | Addgene ; | 27080 | 1 et micro ; g (Stock : 1 µ ; g/µ ; l) |
| Plasmide pCXLE-EGFP | Addgene ; | 27082 | 1 & micro ; g (Stock : 1 µ ; g/µ ; l) |
| Kit de coloration à la phosphatase alcaline | Stemgent | 00-0009 | |
| Antigène embryonnaire spécifique au stade 4 (SSEA-4) Anticorps | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anticorps anti-TRA-1-60 | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anticorps anti-TRA-1-81 | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anticorps | anti-Oct-3/4Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anticorps anti-nanog | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anticorps anti-troponine I | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anticorps anti-&alpha ;-actinine (sarcomérique) | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Classe III ß ;-tubuline (TUJ1) Anticorps | Covance Produits de recherche Inc ; | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anticorps anti-tyrosine hydroxylase (TH) | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-souris ; | Sondes moléculaires | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Chèvre Anti-Lapin | Sondes moléculaires | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Culture Plaque 6 puits | Corning | 3471 | |
| Trizol | Réactif Ambion | 15596-018 ; | réactif pour l’extraction de l’ARN |
| SuperScript VILO Kit de synthèse d’ADNc | Invitrogen | 11754050 | Kit de transcriptase inverse |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Système de détection PCR en temps réel | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Système d’électrophorèse automatisé Experion | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument de vérification de l’intégrité de l’ARN |
| Experion ARN Kit d’analyse Highsense | Bio-Rad | 7007105 | Kit de réactifs pour vérifier l’intégrité de l’ARN |
| Microscope de dissection (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonSystème de transfection 100 µ ; l Kit | Invitrogen | MPK10025 | Kit de réactifs pour l’électroporation |
| Système de transfection au néon | Invitrogen | MPK5000 | Instrument utilisé pour l’électroporation |
| Spectrophotomètre UV/Vis NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument pour la quantification de l’ADN/ARN |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Kit de purification de plasmide |
Références
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from f....
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Réimpressions et autorisations
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